用于生物樣品低溫保藏的樣品載具的制作方法

專利名稱：用于生物樣品低溫保藏的樣品載具的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于生物樣品低溫保藏的樣品載具(Probentrger)和方法。
在現代生物醫藥和生物技術中，對生物材料，特別是細胞、細胞群、天然或者人造組織、整個器官和胚胎機體的細胞進行低溫保藏的需求在持續增長。在低溫保藏下，人們將生物材料冷凍到低的、即所謂的低溫溫度(Cryogenic Temperature)，尤其是在-80℃～-196℃的溫度范圍。在此條件下，活細胞的新陳代謝實際上處于停滯狀態，從而使細胞可以保存很多年。
為了保持低溫保藏細胞的活性，人們使用了特定的低溫介質(Cryomedia)，其包含防護材料(低溫防護物)--例如二甲亞砜(DMSO)、乙二醇、甘油和糖，例如海藻糖或葡萄糖。低溫防護物通過穩定細胞膜和大分子，以及通過防止細胞內冰的形成來保護細胞。細胞內冰晶對于細胞膜主要是產生不可逆的機械損害(見S.S.N.Murthy在“Cryobiology”第36卷，1998年，84-96頁)。適合各種類型的細胞或組織的低溫介質的最佳組合需實驗確定。
除了低溫介質的組合，對于保持比較高的細胞活性起著關鍵作用的是冷凍以及解凍模式(速度、溫度梯度、持續時間等)。有關于此，迄今為止已經出版了關于不同樣品種類以及保藏條件的大量規程，其既描述了快的冷凍以及解凍速度也描述了緩慢的冷凍以及解凍速度或者是兩者的結合(參見，例如J.M.Baust等在“Cell Transplantation”第10卷，2001年，561-571頁，以及M.Miyamoto等在“Cell Transplantation”第10卷，2001年，363-371頁)。其中指出，在任一種情形下都需要精確控制的溫度調節，因為細胞活性對冷凍/解凍速度依賴性很強。
如果將細胞懸浮液或者組織冷凍在傳統的由塑料制得的低溫容器中，不能保證樣品中所有細胞都精確的遵循相同的冷凍速度。造成這種情況一方面由于不利的表面/容積比(低溫容器/細胞樣品)，另一方面由于低溫容器普遍采用的塑料材料和水性的低溫介質具有很小的導熱能力。
這不僅導致冷凍的樣品內部陡直的溫度梯度，而且造成冷凍速率強烈的空間不均勻性。根據它所處位置的不同溫度條件，每一個細胞得到不同冷凍或解凍速率。因此，在低溫速率下強烈的不均勻性對于單個細胞而言造成活性的嚴重喪失，因為只有所有細胞遵循最佳冷凍速率，樣品才具有高的活性。
為了避免或者消除這些問題，已知以下解決途徑。由Berison等(參見“Anim.Reprod”第63卷，2000年，205-220頁)證實在冷凍豬的精液時，相對于在圓柱狀塑料管(所謂的Maxi-straws)中冷凍，在平的塑料容器(所謂的扁平包裝)中冷凍，精液活性可以得到顯著提高。作者認為其原因可歸結為平的低溫容器中的均勻的冷凍和解凍過程。另一個問題是，在“Maxi-straws”中，由于在樣品周圍已經解凍的水的隔離特性，導致樣品內核中解凍速度嚴重減慢。
由S.-P.Park等(參見“Human Reproduction”第15卷，2000年，1787-1790頁)描述了將人體胚胎超快冷凍在最初為電子顯微鏡而設計的銅格柵中。在這種情況下，當將樣品浸入液氮中時，熱量可被非常迅速地帶走，而這對于胚胎活性而言是有利的。
由實踐中，人們知道用于保存微生物的商品化的系統(產品“Micrybank”，制造者SenseLab-Gmbh，萊比錫，德國)。其將微生物結合在小陶瓷球的多孔表面上，在特定的低溫介質中保藏。然而，這個系統僅是對樣品的改進處理。冷凍過程不理想。陶瓷球具有比較小的熱傳導性，從而能夠阻止快的冷凍或解凍。此外，細胞或者組織由于它們的尺寸而不適合于吸附到多孔表面上。
少量樣品體積(毫升或微升范圍)形式的生物樣品冷凍在適當結構的二維冷凍基片上也是已知的。由此可以避免所述的溫度梯度以及冷凍速度梯度的問題。借助這項技術，僅能使少量樣品放置在冷凍基片上，這在需要大體積樣品(例如在毫升范圍)的應用中是個缺陷。
本發明的目的在于可以提供用于生物樣品低溫保藏的改進的樣品載具，借此可以克服傳統樣品載具的缺點。根據本發明的樣品載具應該使得、尤其是能夠可再生地調節所定義的低溫或解凍規程，其中應該能夠避免樣品內溫度梯度或者冷凍速度或者解凍速度的變化。此外，該樣品載具應該適合于大體積樣品的保藏。本發明的目的還在于可以提供一種改進的低溫保藏方法，借此可以避免傳統的冷凍或解凍規程的缺點。
該目的通過具有根據權利要求1和7的特征的樣品載具和方法實現。本發明的優選的實施方案和應用由其從屬權利要求給出。
根據本發明的第一個重要方面，提供了一種用于低溫保藏、特別是用于生物樣品低溫保藏的樣品載具，其具有至少一個樣品容器以容納生物樣品，其中設置由具有以下結構的材料得到的承載體(Trgerkrper)，該結構具有多個內部的、可填充樣品的敞口空腔。帶有內部空腔的承載體具有比樣品容器的內表面大得多的內表面。由此得到的表面/容積的比例相對于傳統的樣品載具有利地得到顯著改善。通過借助承載體與低溫介質的熱傳導連接，冷凍和解凍過程在溫度分配和溫度變化的速度方面能夠實現顯著均勻化。
根據本發明的優選實施方案，所述承載體至少部分地由具有像金屬一樣的導熱性材料組成。據此，冷卻劑實際的溫度能夠以更快的速度傳輸到樣品上。有利地，能夠以更高的準確性和可再現性進行冷凍和解凍規程。承載體優選地由金屬、金屬合金或者包括金屬或金屬合金的復合材料組成。承載體也可由聚合物材料或者陶瓷材料構成，其內表面鍍有具有與金屬導熱率相應的導熱能力的金屬、金屬合金、半導體材料或者化學粘合劑。聚合物可以例如通過合成塑料或者基于天然有機材料的、特別是基于纖維素的固定材料，其例如通過熱解的木材而制得。
帶有內空腔的結構優選地由其空間遍布蜂窩、孔道、溝槽或者其它可穿通結構的結構體構成。空腔的最小橫截面尺寸有利地在1μm-10mm范圍中，優選地在5μm-5mm范圍中。空腔可以設置成有規則(蜂窩結構)或者無規則結構(內部鍍膜的植物或者動物組織或者器官、海綿或者泡末結構)。規則布置具有以下優點在承載體中吸收的樣品體積可以定量地準確得出。不規則結構通常可以根據承載體的制造方法不同，以良好的表面/容積比生產。
具有內表面的承載體在其外形上優選地與本發明的樣品載具的至少一個樣品容器的內部形狀相適應。這個特點的優點在于具有樣品容器空間高利用率以及整個樣品容器中的低溫保藏條件具有均勻性。承載體可以固定的或松動的方式設置在樣品容器中。固定安裝具有以下優點，即本發明的樣品載具具有緊湊的、獨立的結構，特別是在自動系統中可以毫無問題地使用。如果承載體可從樣品容器中抽出，這將在承載體的清洗和/或預處理(例如預冷凍)上帶來優點。
本發明的另一個優點在于，承載體可以用作熱交換器，例如當樣品容器僅部分填充，使得僅承載體的一部分空腔結構裝有樣品，這樣剩下的上方的結構可用作熱交換器。例如蒸汽狀的低溫介質掠過承載體的空閑部分并且以此加快了熱量的排出，反過來，在解凍過程中也可加快熱量的供給。根據優選的實施方案，承載體可以附加配備遠離承載體并伸進低溫介質中去的熱交換元件。通過這種布置，熱交換在完全填滿的承載體中也得到改善。
根據本發明的一個優選的實施方案，承載體由傳統的催化劑、比如在機動車中使用以減少有害物質的催化劑的載體材料制得。包含催化劑結構的承載體由例如以貴金屬(例如鉑)鍍膜的鋼或陶瓷的基本材料組成。采用催化劑結構具有特別的優點，即已知的催化劑載體在大的內表面方面已經得到優化并且由適合于在低溫保藏中使用的惰性材料組成。
根據本發明的又一優選實施方案，承載體由所謂的由生物形態陶瓷組成，所述生物形態陶瓷由基于多糖的材料制得。優選地，這種材料可以由植物制得，根據植物的生長特性不同，可以得到具有任一期望尺寸的空腔。生物形態陶瓷的又一個優點在于其生物相容性。
本發明的主題還在于一種應用所述載具進行低溫保藏的方法。通過本發明方法可利用的技術——例如吸移或者傾析(decanting)，可以將生物樣品加到承載體上，并被承載體容納。根據本發明方法的優選實施方案，采用一個預冷凍的承載體，樣品由此優選地在真正的冷凍過程之前經歷均勻的預冷凍。
根據本發明保藏的生物樣品一般包括含有生物材料的液體。該液體包括例如培養基、營養溶液或者其他兼容的用來包覆的介質。本發明優選的可以使用感興趣的生物材料，例如細胞、細胞群、天然或人造組織、組織切片、器官、部分器官或者胚胎機體的細胞。樣品可以涉及例如加入了生物材料的懸浮樣品或液體。因此，樣品也可以包括其中生物材料例如處于容器底部的液體。材料的尺寸一般和載具中空腔的尺寸彼此相一致。這使得用于提供給組織生產(“組織工程”)的生物組織或者組織的部分能夠有利地得到保藏。
本發明的其它優點和特點在以下參照附圖描述，圖中所示為


圖1和2根據本發明樣品載具的若干實施方案的示意圖；和圖3和4以根據本發明的樣品載具得到的實驗結果。
根據本發明的樣品載具1包括對應于
圖1所示實施方案中的樣品容器2，其中設置承載體3。樣品載具1具有例如底部封閉的圓柱的形狀。其例如可以由已知的小樣品管或者試管構成。承載體3具有較大內表面的容積結構。承載體3的外形與樣品容器內部形狀相適應或者比其稍大(參見下面)。由承載體3占據的樣品容器2的內部空間處于例如0.5-10ml的范圍，優選地為1-5ml。
承載體3由具有高導熱率的多孔的、類似蜂窩的、海綿狀或者泡沫狀的金屬材料，或者由內部鍍膜的植物或動物組織或器官構成。優選地，承載體能夠實現準確、快速、可調的熱量導進、排出。導熱率總計為例如至少0.1J/K kg。內表面與承載體的容積比取決于所用承載體材料的種類和/或其生產條件，在具體應用中，承載體材料或者所說的表面/容積比根據要保藏的樣品的性質(例如懸浮樣品)以及供利用的低溫設備來選擇。該比例可以總計為例如4000m-1，承載體的內部空腔由其厚度優選地小于0.2-0.5mm的壁來分隔。
承載體3例如由用于機動車的金屬催化劑材料形成。孔道大小或者單位體積的細胞數根據要保藏的不同的生物樣品來選擇。承載體3例如由鉑(導熱率為0.32J/K kg)、鋼(0.11J/K kg)或者鋁(0.22J/K kg)組成。承載體3例如由用于機動車的、由德國Fuerstenfeldbruck制造商FA.Matrix制造的金屬催化劑或者陶瓷-金屬-催化劑，剪切得到。
傳統催化劑結構的優點在于其較小的熱膨脹，使得在保藏過程的不同階段基本保持承載體的外部尺寸。
或者，承載體可以由聚合物或者陶瓷構成的復合材料組成，其具有由良好熱傳導材料構成的內部鍍膜。此外，承載體可以自基于天然多糖的材料(例如纖維素、藻酸鹽、果膠)制備，特別是基于木材或者植物纖維制備，其中該材料經過熱解過程和內表面的處理，如硅烷化或者金屬沉積(所謂的生物形態陶瓷)。具有多孔結構的硅烷化木材特別適合作為承載體，如P.Greil在“Journal of the European Ceramic Society”第21卷，2001年，105-188頁中描述的。其他用于生物相容材料的植物或者動物原料的范例包括基于仙人掌、大戟屬植物、硅藻、紙莎草蘆葦、海藻、蜀葵、接骨木、壓制動物皮、骨頭尤其是管狀骨頭、海綿和蜂窩的承載體。或者，承載體可以由天然的多孔礦石，例如鼓氣陶土，通過內部鍍膜制造。
由生物形態陶瓷制得的承載體按照以下方法制造。首先，將木材本體熱解以形成相應的由碳構成的引導束支架(Guiding BundleFramework)。例如在1400℃時進行聚合。接著，引導束支架浸泡在鍍膜溶液中。鍍膜溶液的液體浸濕引導束支架的內表面。鍍膜例如在硅熔液中在約1600℃時進行。在從熔液中抽出的承載體的冷凍過程中，在其內表面沉積硅層。有利的，根據所選用的木材，可以制得不同孔道尺寸的承載體。此外，承載體的外部尺寸有大的可變性。硅烷化的竹子提供例如具有直徑約1-5cm的承載體。利用藤條可以制得直徑達大約1cm的承載體。
可以用于代替硅烷化的是，可以用具有生物相容的、無毒金屬對熱解引導束支架(Xylem)進行鍍膜。可以使用例如金熔液或者鉑熔液作為鍍膜溶液。
承載體的內表面一般經過多次鍍膜。例如，在生物形態陶瓷中，由硅、金以及其它生物相容材料構成一種多層鍍膜。一般采用如已知的晶體鍍膜半導體技術的技術以在承載體內表面鍍膜。
承載體的另一個優點在于它的機械可變形性。雖然承載體由固定材料制造，但由于具有強的可透氣的容積結構，它的外形可輕易地彈性變形。首先，可以制備其外形比樣品容器稍大的承載體。在將承載體裝入樣品中時，承載體受到擠壓，使得在彈性變形作用下固定在樣品容器中。
圖2表示具有細胞培養板形狀的、包含多個樣品容器21、22、23…的樣品載具1，其中分別放置有一個承載體31、32、33…。這些樣品載具具有例如圓柱形狀。圖2的上部表示承載體的俯視圖。不同模式的部件圖A、B和C展示根據本發明使用的承載體可以配備的空腔的不同形狀。
例如，根據圖2A的承載體由波浪形金屬片組成，其移動或者在使用時其間排列的平面彼此連接，從而形成多個直通道41，通道41沿承載體的軸向通過。根據圖2B的承載體具有無序的蜂窩結構。圖2C是有序的蜂窩結構，同樣具有軸向延伸的通道43。
圖2A示意地表示出懸浮樣品10的填充高度。承載體31高于該高度的閑置區域需要與周圍進行熱交換。為了進一步改進在承載體全部填充時的熱交換，可以至少配備一個突出的熱交換元件51。熱交換元件51例如由與承載體相同的材料組成。例如，可提供一個突出的設置成突入空間中的或者在樣品容器壁的表面上的條狀物。
如圖2B、2C所示，可以采用熱交換元件52、53作為承載體樣品容器之間的連接。通過熱交換元件52、53，可以由多個承載體32、33構成復合結構，借此可以同時配備大量樣品容器。根據本發明，例如對應于微滴定板或納滴定板的尺寸設置并且通過熱交換元件彼此相連的承載體形成承載體復合結構。
將冷卻劑與根據
圖1或圖2的樣品載具1接觸以進行低溫保藏，其借助承載體直接進行熱交換或者經過樣品容器的壁材料和/或熱交換元件的幫助間接聯接。
實施例圖3和圖4中所示的試驗結果在以下實驗條件下確定。對呈指數增長狀態的細胞系SP2的細胞進行低溫保藏。使用90％FCS和10％DMSO組成的混合物或者含海藻糖的溶液作為低溫介質。使用根據圖2的具有6個樣品容器的細胞培養板作為樣品載具。在每一容器中使用由催化劑材料得到的、具有約0.5*2*2cm3體積的圓片。該承載體以酒精消毒并且在它的底邊用塑料膜封住。
為了制備懸浮樣品，首先，將SP2細胞收集到培養瓶中并且借助CASY測量分析細胞大小及細胞數量。形成8.2*105細胞/ml的懸浮樣品。懸浮樣品在低溫保藏之前約10分鐘以1000rpm進行離心分離。這種情況下形成的細胞球團在每1ml預冷的冷卻劑中重新懸浮，并吸移進承載體中。
可以實現不同的冷凍和解凍規程。快速冷凍意味著即時轉換到-80℃的箱中。緩慢冷凍意味著在-20℃的箱子中預冷凍1小時，接著轉換到-80℃的箱中。快速解凍意味著直接從箱子的-80℃轉換到環境溫度。緩慢解凍包括首先在-20℃的箱子中持續1小時的升溫，接著在10ml CGM(37℃)的吸移量下在冰上保存30分鐘，而后反復進行樣品的重新懸浮。
為了檢驗低溫保藏結果，對解凍的樣品進行離心分離，并且在CGM中重新懸浮，在37℃和5％的CO2條件下培養24小時后，進行CASY測量以計算低溫保藏之后的細胞數量、細胞大小以及細胞活性。圖3和圖4表示對于不同冷凍和解凍規程，將根據本發明的樣品載具與對照樣品(在試管中低溫保藏)相比較的結果。對于所有實驗條件，尤其是快速冷凍過程，根據本發明的樣品載具的低溫保藏可以顯著地提高細胞的活性以及活細胞的數量。
權利要求
1.一種用于低溫保藏、特別是用于生物材料低溫保藏的樣品載具，包括至少一個用于容納生物樣品的樣品容器(2，21，22，23)，其特征在于，在所述樣品容器(2，21，22，23)中設置由具有容積結構的材料制成的承載體(3，31，32，33)，該容積結構具有大量敞口的、可以填充樣品的內部空腔(41，43)。
2.根據權利要求1的樣品載具，其中所述承載體(3，31，32，33)由導熱率與金屬導熱率相同的材料組成。
3.根據權利要求1的樣品載具，其中所述承載體由復合材料組成，其中內部空腔至少部分鍍有導熱率與金屬導熱率相同的材料。
4.根據前述權利要求中任一項的樣品載具，其中所述承載體(3，31，32，33)具有蜂窩、孔道、溝槽或者類似海綿或泡沫狀的空腔。
5.根據前述權利要求中任一項的樣品載具，其中所述承載體(3，31，32，33)的形狀與所述樣品容器(2，21，22，23)的內部形狀相適應或者稍大。
6.根據權利要求5的樣品載具，其中所述承載體(3，31，32，33)在彈性變形作用下緊密安裝在所述樣品容器(2，21，22，23)中。
7.根據前述權利要求中任一項的樣品載具，其中所述承載體(3，31，32，33)由機動車的催化劑材料制成。
8.根據權利要求1-5中任一項的樣品載具，其中所述承載體(3，31，32，33)由生物形態陶瓷制成。
9.根據前述權利要求中任一項的樣品載具，其配備至少一種熱交換元件(51，52，53)。
10.根據權利要求9的樣品載具，其具有多個樣品容器，并且各個所屬的承載體通過熱交換元件(52，53)彼此連接。
11.一種低溫保藏方法，尤其是生物材料的低溫保藏方法，其中將生物樣品加入到根據前述權利要求中任一項的樣品載具中，并且使所述樣品載具經歷冷凍過程。
12.根據權利要求11的方法，其中使用預冷的承載體。
13.一種機動車催化劑結構或生物形態陶瓷在制造用于在低溫保藏時容納樣品的承載體中的用途。
全文摘要
本發明描述了一種用于低溫保藏，特別是用于生物材料的低溫保藏的方法和樣品載具，其包括至少一個用于容納生物樣品的樣品容器(2)，其中在樣品容器(2)中設置由具有容積結構的材料制成的承載體(3)，該容積結構具有多個敞口的、可以填充樣品的內部空腔。本發明也描述了一種機動車催化劑結構或生物形態陶瓷在制造用于在低溫保藏時容納樣品的承載體中的用途。
文檔編號A01N1/02GK1625684SQ03802972
公開日2005年6月8日 申請日期2003年1月29日 優先權日2002年1月30日
發明者烏爾里希·齊默爾曼, 海科·齊默爾曼 申請人:弗勞恩霍弗應用技術研究院