基于dU或dI寡核苷酸探針的單核苷酸多態性檢測方法

專利名稱：基于dU或dI寡核苷酸探針的單核苷酸多態性檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種新的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP) 檢測方法，尤其涉及一種基于dU或dl寡核苷酸探針的SNP檢測方法，可以用 于基因多態性分析和物種分型等，屬于生物檢測技術領域。
背景技術：
SNP作為一種在基因組水平上由單個核苷酸的變異而導致的DNA序列多態 性，在遺傳病致病基因關聯分析、連鎖不平衡分析、藥物基因組學、患者個性 化治療、法醫鑒定、農作物遺傳育種等領域有著重要應用。鑒于SNP在現代生命 科學中的重要地位，開發了多種SNP測定方法。但是現有SNP測定方法或檢測成 本高[BMC Genomics, 2006， 7: 291-291]，或操作繁瑣，結果不準確，重現性差[Proc. Natl. Acad. Sci. U S A， 1994， 91: 2674-2678.]，或需要昂貴設備[Nucleic Acids Res.， 2005， 33: e38.]。現在看來，還沒有一種SNP檢測技術能夠達到結果準確、操作 簡便、成本低廉、檢測通量高的標準。
MutS蛋白特異性結合含有錯配堿基的雙鏈DNA，是一種極具潛力的SNP檢 測工具蛋白。其中來源于嗜熱微生物77 emw^ &^^; 7^的錯配修復蛋白 TthMutS,能在高達6(TC的溫度下有效識別所有8種類型的堿基錯配和1到3個堿 基缺失/插入引起的錯配。
pfoDNA聚合酶廣泛^用于聚合酶鏈式反應(PCR)，，用于擴增目標核酸。 然而基于pfo DNA聚合酶的SNP檢測技術報導很少。這主要是因為pfti DNA聚合 酶具有3'外切酶活性，因此引物的3'末端堿基與模板DNA待測SNP位點的堿基不 論配對與否，pfuDNA聚合酶均能延伸引物合成全長DNA片段。因此pfiaDNA聚 合酶不適合于3'末端引物延伸法檢測SNP。最近研究表明pfoDNA聚合酶特異性 緊密結合DNA中的脫氧尿嘧啶dU核苷酸與脫氨基腺嘌呤dl核苷酸，并停滯在dU 或dl處，造成DNA合成反應不能順利進行。

發明內容
本發明的目的在于針對現有SNP檢測技術的不足，提供一種新的SNP檢測 方法。該SNP檢測方法操作簡便，準確度高，不需要大型昂貴儀器，可用于測 定各種生物的SNP。
為實現這樣的目的，在本發明中，用于測定SNP的dU或dl寡核苷酸探針 具有如下特征全長30-40個核苷酸，其中5，端第15-25位的一個核苷酸為待檢 SNP位點，3'端第1-15位的一個核苷酸為dU或dl核苷酸，dU或dl核苷酸距 離待檢SNP位點5-15個核苷酸，輕條寡核苷酸探針與待測單鏈DNA的SNP位 點及其兩側核苷酸配對。SNP測定體系含有dU或dI寡核苷酸探針、待測單鏈 DNA、報告DNA模板分子、報告DNA的正向引物與反向引物、熱穩定性mutS 蛋白(例如Thermus thermophilus的熱穩定性MutS蛋白)和pfo DNA聚合酶等 組分。若dU或dl寡核苷酸探針與待測單鏈DNA雜交形成的DNA雙鏈含有錯 配堿基，則pfoDNA聚合酶不能結合錯配堿基附近的dU或dl核苷酸，使得pfu DNA聚合酶能夠催化報告DNA的PCR;若dU或dl寡核苷酸探針與待測單鏈 DNA雜交形成的DNA雙鏈不含有錯配堿基，則熱穩定性mutS蛋白不結合在該 雙鏈DNA上，而pfo DNA聚合酶可以牢牢結合寡核苷酸探針的dU或dl核苷酸， 使得pfo DNA聚合酶不能夠去催化報告DNA的PCR。
本發明的具體步驟如下
1) 設計合成測定單核苷酸多態性的dU或dl寡核苷酸探針，dU或dl寡核 苷酸探針的序列特征是探針全長30-40個核苷酸，5'端第15-25位的一個核苷 酸與待測單鏈DNA的待檢單核苷酸多態性位點配對，3'端第1-15位的一個核苷 酸為dU或dl核苷酸，dU或dl核苷酸距離待檢單核苷酸多態性位點5-15個核 苷酸，整條寡核苷酸探針與待測單鏈DNA的SNP位點及其兩側核苷酸配對；
2) 設計合成用于擴增報告DNA的特異性正向引物和反向引物，引物的序 列特征是整條引物與報告DNA模板分子中報告DNA兩端的堿基序列配對；
3) 采用熱穩定性DNA聚合酶催化的聚合酶鏈式反應擴增雙鏈DNA，聚 合酶鏈式反應體系組成熱穩定性DNA聚合酶反應緩沖液、待測單鏈DNA模 板分子、待測單鏈DNA特異性引物、dNTPs和熱穩定性DNA聚合酶，其中待 測單鏈DNA特異性引物中的一條采用5'端生物素標記；擴增雙鏈DNA后，將 雙鏈DNA變性，與采用鏈親和素包被的磁珠溫育，在變性條件下洗滌磁珠，再 用生物素溶液洗脫結合在磁珠上的待測單鏈DNA;
4) 在pfo DNA聚合酶催化的聚合酶鏈式反應緩沖液中，加入待測單鏈 DNA、 dU或dl寡核苷酸探針、熱穩定性mutS蛋白、報告DNA特異性的正向 引物與反向引物、報告DNA模板分子、dNTPs和pfli DNA聚合酶，配制單核
苷酸多態性測定反應混合物；
5) 將單核苷酸多態性測定反應混合物進行聚合酶鏈式反應，擴增報告 DNA，測定待測單鏈DNA待測位點的單核苷酸多態性；
6) 將聚合酶鏈式反應后的混合物置于質量濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠中， 水平電泳檢測報告DNA擴增結果；若加入的dU或dl寡核苷酸探針與待測單鏈 DNA在單核苷酸多態性位點處正確配對，則擴增不出報告DNA;若加入的dU 或dl寡核苷酸探針與待測單鏈DNA在單核苷酸多態性位點為錯配堿基，則可 以擴增出報告DNA;根據報告DNA擴增結果，推定待測單鏈DNA待測位點單 核苷酸多態性。
本發明與現有SNP測定技術相比有顯著的進步。主要優點如下(1)操作 簡便、結果穩定，只需要進行簡單可靠的PCR反應；(2)操作通量大，每次可 以做96/384個反應；(3)不需要大型昂貴設備，整個操作過程中僅需要熱循環 儀與水平凝膠電泳儀裝置。本發明可用于測定各種SNP，包括微生物、植物、 動物、人的SNP。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明的技術方案作進一步詳細描述。以下實施例不構 成對本發明的限定。
在本發明中，利用3'端第5位為dU或dl核苷酸的寡核苷酸探針、待測單
鏈DNA、報告DNA模板分子、報告DNA特異性的正向引物與反向引物、pfu DNA
聚合酶、熱穩定性mutS蛋白，測定待測單鏈DNA特定位點的SNP。
實施例衣原體內切核酸酶IV基因第21位核苷酸種類的測定
本實施例中，待測SNP位點為衣原體內切核酸酶IV基因第21位核苷酸種 類，熱穩定性mutS蛋白為TthmutS，報告DNA為氨芐青霉素抗性基因，報告 DNA模板分子為pUC18質粒，檢測探針為dU或dl寡核苷酸探針，此實施例為 dU寡核苷酸探針。具體實施步驟如下
第一步，設計合成用于測定衣原體內切核酸酶IV基因第21位核苷酸種類 的dU寡核苷酸探針。4條寡核苷酸探針分別為CpendoIV-21-T、 CpendoIV-21-A、 CpendoIV-21-C、 CpendoIV-21-G。 4條dU寡核苷酸探針堿基序列如下 CpendoIV陽21-T: 5 ， agtaagggaa tgga/ggagg aggaagtact xtcat Cpendol V-21 - A: 5 ， agtaagggaa tggaaggagg aggaagtact xtcat CpendoIV-21 -C: 5' agtaagggaa tggacggagg aggaagtact xtcat Cpendol V-21 -G: 5 ， agtaagggaa tggagggagg aggaagtact xtcat
其中，探針全長35個核苷酸，符號x表示dU核苷酸，5'端第15位的斜 黑體堿基與衣原體內切核酸酶IV基因的單鏈DNA的待測SNP位點配對，整條 寡核苷酸探針與衣原體內切核酸酶IV基因5'端的35個堿基互補配對。寡核苷 酸探針可以自己利用DNA合成儀合成或由各DNA合成公司合成。
第二步，設計合成用于擴增報告DNA的特異性引物。正向、反向引物分別 為pUC18-amp-F、 pUC18-amp-R。引物堿基序列如下
pUC18-amp-F: 5" atgagtattc aacatttccg t
pUC18-amp-R: 5' cgtcaatacg ggataatacc
弓l物分別與報告DNA模板分子pUC18質粒的氨芐青霉素抗性基因5'端的 一段250bp的DNA序列的兩端互補配對，報告DNA長250bp。引物可以自己 利用DNA合成儀合成或由各DNA合成公司合成。
第三步，衣原體內切核酸酶IV基因單鏈DNA的制備。首先采用Taq DNA 聚合酶催化的PCR制備雙鏈形式的衣原體內切核酸酶IV基因，然后用鏈親和素 包被的磁珠制備單鏈DNA。衣原體內切核酸酶IV基因的PCR反應混合物組成 (50微升)正向引物(CpendoIV-F: 5，Batgaaagtacttcctcctcc，引物采用5'端生 物素標記，用于回收單鏈DNA)與反向引物(CpendoIV-R: 5'gtttctttgagcgctgcttt
g) ， 0.5 DNA模板分子，50納克衣原體基因組DNA; dNTPs， 200 TaqDNA聚合酶，2.5單位；10xTaq DNA聚合酶反應緩沖液，5微升；補加去 離子水至總體積為50微升。PCR反應條件95°Cx5分鐘；(95°Cx30秒，50°Cx30 秒，72。Cxl5秒)x30循環；72。Cx2分鐘。擴增DNA片段長度為200 bp， SNP 檢測位點為生物素標記引物(長20nt)延伸的第一個核苷酸，即衣原體內切核 酸酶IV基因5'端的第21個核苷酸。將擴增的雙鏈DNA變性，然后與磁珠溫育， 并在變性條件下洗滌磁珠，ft后用生物素溶液洗脫結合在磁珠上的衣原體內切 核酸酶IV基因單鏈DNA。
第四步，配制SNP測定反應混合物。SNP測定反應混合物組成(IO微升) dU寡核苷酸探針(CpendoIV-21-T或CpendoIV-21-A或CpendoIV-21-C或 CpendoIV-21-G，共四個反應管，每個反應管只加入一種探針)，O.lpM;衣原體 內切核酸酶IV基因單鏈DNA， 100納克；TthmutS蛋白，5微克；報告DNA特 異性的正向引物與反向引物(pUC18-amp-F和pUC18-amp-R)， 0.3 報告DNA
模板分子，l納克pUC18質粒；dNTPs， 200 pfUDNA聚合酶，0.25單位； 10xpfo DNA聚合酶反應緩沖液，1.0微升；補加去離子水至總體積為10微升。
第五步，PCR檢測衣原體內切核酸酶IV基因21位SNP。衣原體內切核酸 酶IV21位SNP測定反應混合物在下列條件下進行PCR，擴增報告DNA。 PCR 條件95。Cx5分鐘；(95。Cx30秒，50。Cx30秒，72'O30秒)x30循環；72T>3 分鐘。
第六步，報告DNA的PCR擴增結果檢測。將PCR后的SNP測定混合物 置于質量濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠中，凝膠中添加了終濃度為0.5微克/毫升的 溴化乙啶，水平電泳檢測報告DNA擴增結果；利用水平電泳儀，在200V電壓 下電泳10-20分鐘，在紫外光下或凝膠成像系統中觀測報告DNA的擴增結果。 加入寡核苷酸探針CpendoIV-21A、 CpendoIV-21T、 CpendoIV-21C的3個反應管 可以擴增出250 bp的報告DNA;加入寡核苷酸探針CpendoIV-21G的反應管無 任何長度的DNA擴增片斷，包括250 bp的報告DNA。根據報告DNA的這一 擴增結果，推定衣原體內切核酸酶IV第21位的單核苷酸為C。
基于dU或dl寡核苷酸探針的單核苷酸多態性檢測方法原理dU或dl寡 核苷酸探針的序列特征是全長30-40個核苷酸，其中5，端第15-25位的一個核 苷酸與待檢SNP位點配對，3'端第1-15位的一個核苷酸為dU或dl核苷酸，dU 或dl核苷酸距離待檢SNP位點5-15個核苷酸，整條寡核苷酸探針與待測單鏈 DNA的SNP位點及其兩側核苷酸完全配對(SNP位點除外)。dU或dl寡核苷 酸與待測DNA雜交后，若SNP位點處形成錯配堿基，則mutS結合在錯配堿基 上，而pfti DNA聚合酶游離出來，可以擴增出報告DNA;若SNP位點處形成 正確配對堿基，則mutS不能結合在正確配對堿基上，而pfti DNA聚合酶結合在 dU或dl寡核苷酸探針上，不能擴增出報告DNA。根據與待測SNP位點配對的 dU或dl寡核苷酸探針上的堿基種類及報告DNA擴增結果，可以推定待測SNP 位點堿基種類。
權利要求
1、一種基于dU或dI寡核苷酸探針的單核苷酸多態性檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)設計合成測定單核苷酸多態性的dU或dI寡核苷酸探針，dU或dI寡核苷酸探針的序列特征是探針全長30-40個核苷酸，5’端第15-25位的一個核苷酸與待測單鏈DNA的待檢單核苷酸多態性位點配對，3’端第1-15位的一個核苷酸為dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距離待檢單核苷酸多態性位點5-15個核苷酸，整條寡核苷酸探針與待測單鏈DNA的SNP位點及其兩側核苷酸配對；2)設計合成用于擴增報告DNA的特異性正向引物和反向引物，引物的序列特征是整條引物與報告DNA模板分子中報告DNA兩端的堿基序列配對；3)采用熱穩定性DNA聚合酶催化的聚合酶鏈式反應擴增雙鏈DNA，聚合酶鏈式反應體系組成熱穩定性DNA聚合酶反應緩沖液、待測單鏈DNA模板分子、待測單鏈DNA特異性引物、dNTPs和熱穩定性DNA聚合酶，其中待測單鏈DNA特異性引物中的一條采用5’端生物素標記；擴增雙鏈DNA后，將雙鏈DNA變性，與采用鏈親和素包被的磁珠溫育，在變性條件下洗滌磁珠，再用生物素溶液洗脫結合在磁珠上的待測單鏈DNA；4)在pfu DNA聚合酶催化的聚合酶鏈式反應緩沖液中，加入待測單鏈DNA、dU或dI寡核苷酸探針、熱穩定性mutS蛋白、報告DNA特異性的正向引物與反向引物、報告DNA模板分子、dNTPs和pfu DNA聚合酶，配制單核苷酸多態性測定反應混合物；5)將單核苷酸多態性測定反應混合物進行聚合酶鏈式反應，擴增報告DNA，測定待測單鏈DNA待測位點的單核苷酸多態性；6)將聚合酶鏈式反應后的混合物置于質量濃度為1.5％的瓊脂糖凝膠中，水平電泳檢測報告DNA擴增結果；若加入的dU或dI寡核苷酸探針與待測單鏈DNA在單核苷酸多態性位點處正確配對，則擴增不出報告DNA；若加入的dU或dI寡核苷酸探針與待測單鏈DNA在單核苷酸多態性位點為錯配堿基，則可以擴增出報告DNA；根據報告DNA擴增結果，推定待測單鏈DNA待測位點單核苷酸多態性。
全文摘要
本發明涉及一種基于dU或dI寡核苷酸探針的單核苷酸多態性檢測方法。dU或dI寡核苷酸探針序列特征是全長30-40個核苷酸，5’端第15-25位的一個核苷酸與待檢SNP位點配對，3’端第1-15位的一個核苷酸為dU或dI，dU或dI距離待檢SNP位點5-15個核苷酸，整條寡核苷酸探針與待檢SNP位點及其兩側核苷酸配對。反應組份包括dU或dI寡核苷酸探針，待測單鏈DNA，熱穩定性mutS蛋白，報告DNA模板分子、報告DNA特異性的引物，dNTPs，pfuDNA聚合酶及其反應緩沖液。dU或dI寡核苷酸探針與待測單鏈DNA雜交后，若SNP位點處形成錯配堿基，則PCR可擴增出報告DNA，若SNP位點處形成正確配對堿基，則不能擴增出報告DNA。根據報告DNA擴增結果，可推定待測SNP位點堿基種類。
文檔編號C12Q1/68GK101168769SQ20071004795
公開日2008年4月30日 申請日期2007年11月8日 優先權日2007年11月8日
發明者劉喜朋, 劉建華 申請人:上海交通大學