水合淫羊藿素的制備方法

專利名稱：水合淫羊藿素的制備方法
技術領域：
本發明涉及天然化合物的合成，特別是涉及一種中藥淫羊藿中的成分水合淫羊藿素的制備方法。
背景技術：
淫羊藿是常用的中藥材，是小檗科(Berberridaceae)淫羊藿屬(Epimedium genus)多 種植物的地上干燥部分，中華人民共和國藥典(2000版)收錄了如下五種淫羊藿藥材，即 淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim))、箭葉淫羊藿(Epimedium sagittatum)、柔毛 淫羊藿(Epimedium pubescens)、巫山淫羊藿(Epimedium 篇shanenes)、朝鮮淫羊藿 (Epimedium koreanum Nakai)等。淫羊藿具有補腎壯陽、強筋健骨、袪風除濕之功效， 常用于治療陽痿不舉、小便淋漓、腰膝無力以及冠心病、慢性支氣管炎、神經衰弱和小兒 麻痹等癥。現代藥理研究證明，淫羊藿含有特殊的化學成分和顯著的生物活性。
水合淫羊藿素，化學名3,5，7-三羥基-4'-甲氧基-8-(3-甲基-3-羥基)-丁基-黃酮。化學結 構(I)所示。<formula>complex formula see original document page 3</formula>(I)
天然水合淫羊藿素有兩種來源， 一種是游離的水合淫羊藿素，早期有報道可從朝鮮淫 羊藿中分離得到；另一種是來源于與糖結合的甙，經水解可得。但因其在植物中含量很低， 古女無法進^亍工業化制備(Chemical and pharmacological investigations of Epimedium species: a survey, Prog. Drug Res. 2003:60， 1-57。淫羊藿的研究新進展，中國藥學 雜志，1997， 32， 449-451)。

發明內容
淫羊藿苷，化學命名為3， 5， 7-三羥基-4'甲氧基-8-異戊烯基黃酮-3-0-α-L-吡喃
鼠李糖-7-"e-D-吡喃葡萄糖苷。其結構式如(II)所示
<formula>complex formula see original document page 4</formula>
(II)
因天然存在的淫羊藿苷在植物中含量豐富，故本發明提供一種從淫羊藿苷制備水合淫 羊藿素的方法，反應收率較高，整個工藝過程操作簡便，反應后處理方便，純化簡單。
一種水合淫羊藿素的制備方法，其特征在于包括由淫羊藿苷經鹽酸和纖維素酶兩步 水解反應得到。
上述水解反應步驟是淫羊藿苷經鹽酸水解后再用纖維素酶水解。
所述鹽酸水解反應中，鹽酸濃度為1N-5N，反應物比例為每lg淫羊藿苷與20-100mL 鹽酸液反應，反應溫度為50-100 °C，反應時間為0.5-2小時。
優選鹽酸濃度為3N，比例為每lg淫羊藿苷與50mL鹽酸液反應，反應溫度為80°C， 加熱時間為1小時。
所述纖維素酶水解反應中，反應條件為40-50°C， pH為4.8-5.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二 鈉緩沖液中將上述鹽酸反應產物用纖維素酶水解24-36小時，所述纖維素酶綜合酶活力^ 1.8萬u/mL。
優選反應條件為40'C，pH為5.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中將上述鹽酸反應產 物用纖維素酶水解36小時。
一種水合淫羊藿素的制備方法，還包括水合淫羊藿素的純化，所述純化包括用溶劑從 水解反應混合物中萃取、采用大孔吸附樹脂去除雜質和甲醇-水溶液重結晶三個步驟。
所述溶劑為乙酸乙酯。
所述大孔吸附樹脂上水合淫羊藿素的吸脫采用50%， 60%， 70%乙醇-水溶液依次洗脫。 所述甲醇-水溶液含甲醇95-98%(V/V)。
從淫羊藿苷到水合淫羊藿素，關鍵是不僅要將淫羊藿苷的3-， 7-上的糖取代基水解掉， 而且要在淫羊藿苷的8-異戊烯基上加合一分子水，使其生成水合淫羊藿素。發明人作了長 期的研究和探索，發現纖維素酶能水解7-葡萄糖取代基，但只水解少量的3-鼠李糖取代基。 鹽酸溶液能完全水解3-鼠李糖取代基，但部分水解7-葡萄糖取代基，同時鹽酸的水解反應 能在雙鍵上與一分子水形成加合反應。在不同濃度的鹽酸溶液中，不同的反應溫度下，以 及不同的鹽酸和纖維素酶水解順序中，其生成的水合淫羊藿素的得率是不同的。本發明優 選第一步用3N鹽酸與淫羊藿苷反應，第二步用纖維素酶水解，可得到比其他已嘗試的其他
方法更高的水合淫羊素得率。
本發明制備的水合淫羊藿素的純化在酶解反應后直接用乙酸乙酯從反應液中萃取出水 合淫羊藿素。乙酸乙酯層經過濾可除去不溶雜質，作為第一次純化，并可用于下一步的純 化處理。
下步純化步驟包括將上述含有反應產物的乙酸乙酯層用大孔吸附樹脂拌樣，回收乙
酸乙酯，反應產物吸附于樹脂上，拌樣后的樹脂加于大孔吸附樹脂柱上，用50%， 60%， 70%乙醇溶液依次洗脫，收集含有水合淫羊藿素的餾分，濃縮回收乙醇至小體積，即有水合 淫羊藿素沉淀析出。析出的水合淫羊藿素用95-98%甲醇反復多次溶解，過濾，濃縮，析出， 可得到99%以上的純度，并使水合淫羊藿素呈針狀結晶。
本發明采用鹽酸和纖維素酶對水合淫羊藿苷進行反應，其去糖水解完全，并可改變淫 羊藿苷元的化學結構，使其成為水合淫羊藿素，且收率較高。反應后處理方便，產物純度 完全符合藥用標準。


圖1 實施例1制得的水合淫羊藿素HPLC圖譜
圖2 實施例1制得的水合淫羊藿素X散射圖譜
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1
1.1淫羊藿苷與鹽酸溶液的反應
取淫羊藿苷5g (含量90%以上)，加入至250mL 3N的鹽酸溶液中(濃鹽酸與水按3:7 的體積比配制)，攪拌，逐步升溫至80°C，并維持1小時。反應結束后，冷卻，放置，使 沉淀完全。過濾，沉淀物用水洗滌數次至中性(如無法洗至中性，可用少量NaOH溶液中 和酸性)。濾液棄去或留至下次反應用。
1.2鹽酸反應產物與纖維素酶的反應
將上述的鹽酸反應產物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH5.0， 50uM)的緩沖液中，再 加入纖維素酶(綜合酶活力》1.8萬u/mL)約5mL,于40。C攪拌36小時。反應結束后， 冷卻，加入等量乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯層，過濾，除去不溶性雜質。
1.3反應液的后處理
上述乙酸乙酯溶液中加入約50gDM130樹脂拌樣，回收乙酸乙酯至干。拌樣后的樹脂 加于200g大孔吸附樹脂柱上，用50%， 60%， 70%乙醇溶液依次洗脫，收集含有水合淫羊 藿素的餾分，濃縮回收乙醇至小體積，既有水合淫羊藿素沉淀析出。過濾，得水合淫羊藿 素粗品約2g，得率約為40%。
1.4水合淫羊藿素純品制備
收集到的水合淫羊藿素粗品，用95-98%甲醇600mL加熱溶解，過濾除去雜質，濃縮至 約150mL，有結晶析出。如此反復用甲醇結晶約6-10次，并用高效液相監測純度，直至達 到藥用標準。可得水合淫羊藿素純品約1.5g。高效液相流動相為乙腈和0.3%磷酸水溶液， 比例為52:48，色譜柱為C18， 200 X 4.6mm， 5um。水合淫羊藿素保留時間約為18min。見圖1。
1.5結構確證及理化參數
1.5.1水合淫羊藿素，甲醇-水重結晶，得黃色針狀晶體，熔點為238-9℃。
1.5.2 NMR數據
NMR儀器Brucker AM-400 NMR Spectrometer.
溶劑DMSO
測試項目1H， 13C， DEPT-135。
測試結果:力-NMR: L18(6H，s); 1.55(2H,m); 2.50(2H，m); 3.85(3H, s); 4.31 (1H， s); 6.28(1H, s); 7.09 (2H， d, J=9Hz); 8.23 (2H, d， J=9Hz); 9.50(1H, s); 10.61 (1H,s); 12.33 (1H, s)。 13C-NMR: 18.09; 29.81; 43.58; 56.03; 69.53; 98.46; 103.72; 107.52; 114.64; 124.31; 129.94; 136.55; 146.62; 154.13; 158.75; 161.13; 162.02; 176.95。
1.5.3 Mass數據
MS儀器Agilent LC/MS Apparatus. 測定條件ESI Source.
測定結果(M+H)+ m/z 387.2 。
1.5.4X散射圖譜見圖2.
實施例2
2.1淫羊藿苷與纖維素酶的反應
取淫羊藿苷5g (含量90%以上)，加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH4.8， 50uM)的緩沖 液中，再加入纖維素酶(綜合酶活力》1.8萬u/mL)約5mL,于50。C攪拌24小時。反應結 束后，冷卻，放置，使沉淀完全。過濾，沉淀物用水洗滌數次。
2.2酶解產物與鹽酸溶液的反應
將上述的酶解產物加入至500mL 1N的鹽酸溶液中(濃鹽酸與水按1:10的體積比配制)， 攪拌，逐步升溫至60。C，并維持8小時。反應結束后，冷卻，放置，使沉淀完全，過濾。 沉淀物用水洗至中性。
2.3反應液的后處理(同實施例l)，得率約為10%。
2.4水合淫羊藿素純品制備(同實施例l)
實施例3
3.1淫羊藿苷與鹽酸溶液的反應
取淫羊藿苷5g (含量90%以上)，加入至500mL 1N的鹽酸溶液中(濃鹽酸與水按1:10 的體積比配制)，攪拌，逐步升溫至80°C，并維持8小時。反應結束后，冷卻，放置，使 沉淀完全。過濾，沉淀物用水洗滌數次至中性(如無法洗至中性，可用少量NaOH溶液中 和酸性)。濾液棄去或留至下次反應用。
3.2鹽酸反應產物與纖維素酶的反應
將上述的鹽酸反應產物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH5.5， 50uM)的緩沖液中，再 加入纖維素酶(綜合酶活力》1.8萬u/mL)約5mL，于40。C攪拌32小時。反應結束后，冷 卻，加入等量乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯層，過濾，除去不溶性雜質。 3.3 反應液的后處理(同實施例l)，得率約為20%。 3.4水合淫羊藿素純品制備(同實施例l)
權利要求
1、一種水合淫羊藿素的制備方法，其特征在于包括由淫羊藿苷經鹽酸和纖維素酶兩步水解反應得到。
2、 根據權利要求1所述的制備方法，所述水解反應歩驟的順序是淫羊藿苷經鹽酸水解 后再用纖維素酶水解。
3、 根據權利要求2所述的制備方法，所述鹽酸水解反應中，鹽酸濃度為1N-5N，反應 物比例為每lg淫羊藿苷與20-100mL鹽酸液反應，反應溫度為50-100 °C，反應時間為0.5-2 小時。
4、 根據權利要求3所述的制備方法，所述鹽酸濃度為3N，反應物比例為每lg淫羊藿 苷與50mL鹽酸液反應，反應溫度為80°C，加熱時間為1小時。
5、 根據權利要求2所述的制備方法，所述纖維素酶水解反應中，反應條件為40-50'C， pH為4.8-5.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中將鹽酸水解反應產物用纖維素酶水解 24-36小時，所述纖維素酶綜合酶活力^1.8萬u/mL。
6、 根據權利要求5所述的制備方法，所述反應條件為40'C， pH為5.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中將鹽酸水解反應產物用纖維素酶水解36小時。
7、 根據權利要求1所述的制備方法，還包括水合淫羊藿素的純化，所述純化包括用溶 劑從水解反應混合物中萃取、采用大孔吸附樹脂去除雜質和甲醇-水溶液重結晶三個步驟。
8、 根據權利要求7所述的制備方法，所述溶劑為乙酸乙酯。
9、 根據權利要求7所述的制備方法，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂，水合 淫羊藿素的洗脫采用50%， 60%， 70%乙醇-水溶液依次洗脫。
10、 根據權利要求7所述的制備方法，所述甲醇-水溶液含甲醇95-98% (V/V)。
全文摘要
本發明涉及“水合淫羊藿素的制備方法”，屬于天然化合物的合成領域。一種水合淫羊藿素的制備方法，其特征在于包括由淫羊藿苷經鹽酸和纖維素酶兩步水解反應得到。其去糖水解完全，并可改變淫羊藿苷元的化學結構，使其成為水合淫羊藿素，且收率較高。反應后處理方便，產物純度完全符合藥用標準。
文檔編號C12P17/02GK101200743SQ20071017967
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月17日 優先權日2007年12月17日
發明者坤 孟, 靖 李 申請人:北京珅奧基醫藥科技有限公司