運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法

專利名稱：運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵工程技術領域，具體涉及一種運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法。
背景技術：
2009年我國石油凈進口量21，888. 5萬噸，原油凈進口量19，862.0萬噸。原油進口對外依存度達到52. 5 %，石油進口依存度達到53.6%，雙雙超過50 %的“國際警戒線”。 在石油消耗中，車用燃油消耗所占的比例逐年增加。因此，利用可再生的生物質資源發酵生產乙醇等交通運輸用液體燃料來代替或部分代替石油成為研究熱點。燃料乙醇作為清潔能源，在日益重視環保的今天，更是倍受關注。而目前，由于生產水平不高，燃料乙醇在市場上推廣還需要國家財政和政策補貼，為提高其市場競爭力，必須切實地降低燃料乙醇生產成本。原料成本占乙醇生產成本的一半以上，甘薯、芭蕉芋等非糧作物成本非常低廉，我國占世界產量的絕大部分。但是，這些原料季節性強，含水量大，收獲時間比較集中，且主要分布在溫帶、亞熱帶地區，不易干燥，保藏很困難。原料腐爛后黏度大、輸送困難，還會產生許多抑制發酵的成分，淀粉損耗更是驚人。因此，開發快速乙醇發酵技術，在收獲季節及時利用價格低廉的原料，可避免原料資源的不必要浪費，減輕后期原料儲存壓力，同時可以降低生產原料成本，對于乙醇生產具有相當重要作用。而實現快速乙醇發酵的重要環節之一就是選用快速發酵產乙醇的菌株。運動發酵單胞菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌，具有很強的產乙醇能力，利用葡萄糖生產乙醇的速度比酵母快3 4倍，乙醇產量可以達到理論值的97 %，而且生長不需要氧氣，能忍耐^OgI/1的葡萄糖溶液，在13% (ν/ν)乙醇濃度中可以生存，因此運動發酵單胞菌很適合作為乙醇快速發酵的生產菌種。但是，受現有的乙醇發酵工藝水平限制，生產9% 12% (ν/ν)的乙醇，發酵時間通常在40 7 之間，發酵效率也不高。若應用于工業生產，則因發酵周期長而不利于降低生產成本，使得乙醇生產缺乏競爭力。運動發酵單胞菌耐酸性較差可能是其乙醇發酵水平不高的主要原因。但是，目前還沒有利用緩沖劑調節運動發酵單胞菌乙醇發酵體系PH的報道，因此，開發緩沖劑，緩解乙醇發酵過程中隨發酵進行PH降低對運動發酵單胞菌的抑制作用，從而提高菌種代謝活性，縮短發酵時間，提高發酵液乙醇濃度，將可能極大提高乙醇生產效能，增強乙醇生產的競爭力。

發明內容
本發明的目的是針對現有快速乙醇發酵工藝的不足，發明一種運動發酵單胞菌快速發酵生產乙醇的新方法，以降低乙醇生產成本。本發明所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現本發明以廉價的甘薯為原料，主要包括如下工藝單元發酵培養基的配制；種子培養基的制備；運動發酵單胞菌種子液的制備；發酵。具體步驟如下1.發酵培養基制備葡萄糖發酵培養基的配方每升培養基中含葡萄糖150g 200g，酵母膏5g， (NH4)2SO4Ig, KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g，0. 2mol L-1 的 Ph5. 4 醋酸鹽緩沖液 200mL 或碳酸鈣粉末5 7. 5g，自來水配制后115°C滅菌20min備用。淀粉質原料發酵培養基的配方原料打漿或打粉，加水拌料使初始糖濃度為180g kgH-^Og kg—1，80°C蒸煮，添加α-淀粉酶液化至碘反應為紅棕色，添加(NH4)#04或尿素， 其在發酵培養基中的終濃度分別為1 1. 5g kg—1和0. 6 2. Og kg—1，添加W1為5. 4醋酸鹽緩沖液或碳酸鈣粉末作為緩沖劑，其在發酵培養基中的終濃度分別為40mmol L—1和57. SgL—1，裝發酵醪于三角瓶或發酵罐中，115°C滅菌20min備用或不滅菌直接接種發酵。2.種子培養基的配方每升培養基中含葡萄糖100g，酵母膏5g，(NH4)2SO4 lg, KH2PO4Ig, MgSO4 0. 5g，自來水配制后115°C滅菌20min備用。3.種子液的制備從保存種子培養液吸取運動發酵單胞菌，按15 17(體積體積)的比例接種到裝有新配制的種子培養基的三角瓶中，瓶口封塑料紙，培養溫度 30°C, IOOrpm振蕩或攪拌培養11乩。4.發酵種子培養基制備完成之后，立即向每升發酵培養基接入IOOmL 120mL 種子液，瓶口或發酵罐口封塑料紙，培養溫度30°C 33°C，IOOrpm 150rpm振蕩或攪拌下發酵，控制溶氧低于6mg L—1，經17h 30h發酵結束。所述的甘薯為淀粉含量高、無腐爛、無病蟲害的新鮮甘薯。所述的α-淀粉酶為Liquozyme Supra，購自諾維信公司。標準酶活力為 90KNU -g^,KNU為諾維信液化酶的專有單位，IKNU是指在37°C，pH 5. 6時，每小時水解5. 26 克淀粉的酶量。所述的糖化酶為Suhong GAII，購自諾維信公司。標準酶活500AGU · πιΓ1。AGU為諾維信液化酶的專有單位，IAGU是指在25°C、pH 4. 3、反應時間30分鐘條件下，每分鐘水解 1微克分子麥芽糖所需的酶量。所述的菌種為運動發酵單胞菌Zymomonas mobilis 10232B，申請人已于2010年6 月21日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC M 2010151。本發明發酵工藝簡單，發酵17h 30h，乙醇濃度達9. % 16. 19% (ν/ν)，乙醇生產周期縮短2倍以上，可以在收獲季節大量利用甘薯、芭蕉芋等廉價原料，減少保藏費用。同時提高單位設備的生產能力，降低設備運行費用，從而降低乙醇生產成本，具有良好的經濟效益。
具體實施例方式以下以具體實施例來說明本發明的技術方案，但并非是對本發明的技術方案的限制，本領域技術人員應該理解，依然可以對發明進行修改或等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的保護范圍之中。對照例1.不添加緩沖劑葡萄糖發酵培養基初始糖濃度lSOgL—1，不添加緩沖劑。取5mL保存有運動發酵單胞菌的種子液接種到IOOmL新配制的種子培養基中，瓶口封塑料紙，培養溫度30°C，IOOrpm振蕩培養2 后立即取IOmL種子液接種到IOOmL發酵培養基中，瓶口封塑料紙，培養溫度 31°C，IOOrpm振蕩，控制溶氧低于6mg L—1，經48h發酵，乙醇濃度達11. 09% (ν/ν)。對照例2.緩沖劑為Wi5. 4磷酸鹽緩沖液葡萄糖發酵培養基初始糖濃度lSOgL—1，緩沖劑為0. 2mol Γ1的拖5. 4磷酸鹽緩沖液，其在培養基中的終濃度為40mmol L—1。取5mL保存有運動發酵單胞菌的種子培養液接種到IOOmL新配制的種子培養基中，瓶口封塑料紙，培養溫度30°C，IOOrpm振蕩培養1 后立即取IOmL種子液接種到IOOmL發酵培養基中，瓶口封塑料紙，培養溫度30°C，120rpm振蕩，控制溶氧低于6mg L—1，經20h發酵，乙醇濃度10. 15% (ν/ν)，發酵效率89. 36%。實施例1 緩沖劑為Wi5. 4醋酸鹽緩沖液葡萄糖發酵培養基初始糖濃度lSOgL—1，緩沖劑為Wi5. 4醋酸鹽緩沖液，其在培養基中的終濃度為40mmol L—1。種子液的制備和接種及發酵培養方式同對照例2，經20h發酵，乙醇濃度11. 17% (ν/ν)，發酵效率92. 73%。實施例2.緩沖劑為碳酸鈣種子液的制備同對照例2。葡萄糖發酵培養基初始糖濃度KOgL+緩沖劑選用碳酸鈣，其在發酵培養基中的終濃度為5. Og L1，接種及培養方式同對照例2，經Hh發酵，乙醇濃度9. 28 % (ν/ν)，發酵效率94. 43 %。實施例3.緩沖劑為碳酸鈣種子液的制備同對照例2。葡萄糖發酵培養基初始糖濃度lSOgL—1，緩沖劑選用碳酸鈣，其在發酵培養基中的終濃度為7. 5g L—1，接種及培養方式同對照例2，經20h發酵，乙醇濃度11. 36% (ν/ν)，發酵效率93. 88%。實施例4.緩沖劑為碳酸鈣種子液的制備同對照例2。葡萄糖發酵培養基初始糖濃度20(^171,緩沖劑選用碳酸鈣，其在發酵培養基中的終濃度為5. Og L—1，接種及培養方式同對照例2，經24h發酵，乙醇濃度12.70% (ν/ν)，發酵效率94. 50%。實施例5. 10L發酵罐中的乙醇發酵葡萄糖發酵培養基初始糖濃度lSOgL—1，體積7. 8L，緩沖劑選用碳酸鈣，添加量為 40g。種子液的制備同對照例2。接種0.78L種子液于發酵培養基，培養溫度33°C，攪拌漿轉速120rpm，控制溶氧低于6mg/L，發酵18h，乙醇的最終濃度達到11. 22% (ν/ν)，發酵效率 93. 60%。實施例6.以鮮甘薯為原料的乙醇發酵(滅菌)鮮甘薯打漿、加水、液化后使甘薯醪初始糖濃度為180g kg—1，裝IOOg于250mL三角瓶中，同時加入0. 13g (NH4)2SO4和0. 5g碳酸鈣，115°C滅菌20min。種子液的制備和培養方式同對照例1，培養14h后立即接種運動發酵單胞菌種子液IOmL于發酵培養基中，同時添加 leOAGUkg—1淀粉的糖化酶，32°C、攪拌lOOrpm，控制溶氧低于6mg廠1，經21h發酵，乙醇濃度 12. 06% (ν/ν)，發酵效率 94%。實施例7.以鮮甘薯為原料的乙醇發酵(不滅菌)種子液和發酵培養基的制備和培養方式同實施例7，發酵培養基不滅菌。接種和發酵培養方式同實施例6，經21h發酵，乙醇濃度11. 76% (ν/ν)，發酵效率93. 76%。實施例8.以木薯為原料的乙醇發酵
20kg木薯粉加水40kg，裝入100L發酵罐中，液化后補水使初始糖濃度為276. 20g kg"1,同時加入0. 2g尿素和0. 5g碳酸鈣，115°C滅菌20min。接種和發酵培養方式同實施例 6，發酵30h，乙醇濃度達16. 19%，發酵效率90. 86%。
權利要求
1.運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法，包括種子培養和發酵培養，其特征是菌種為運動發酵單胞菌，種子培養基的成分和各成分在培養基中的濃度為葡萄糖IOOg L—1，酵母膏5g ΙΛ (NH4)2SO4Ig Γ1, KH2PO4Ig Γ1, MgSO4O. 5g L—1，運動發酵單胞菌種子液培養時間為116h ；發酵培養基配制方法為將淀粉質原料打漿或打粉，加水拌料使初始糖濃度為 180g kgH-^Og kg^scrc蒸煮，添加α-淀粉酶液化至碘反應為紅棕色，發酵培養基中添加緩沖劑，每升發酵培養基接入IOOmL 120mL種子液，發酵培養時間為Hh 30h，發酵過程中控制溶氧低于6mg L—1。
2.根據權利要求1所述的運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法，其特征是所述的緩沖劑為醋酸鹽緩沖液或碳酸鈣粉末。
3.根據權利要求2所述的運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法，其特征是添加的醋酸鹽緩沖液Wi為5. 4，其在發酵培養基中的終濃度為40mmol Γ1 ；添加的碳酸鈣粉末，其在發酵培養基中的終濃度為5 7. SgL—1。
4.根據權利要求1所述的運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法，其特征是甘薯或木薯發酵培養基中添加(NH4)2SO4或尿素，其在發酵培養基中的終濃度分別為1 1. 5g kg—1 和 0· 62. Og kg-1。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵工程技術領域，具體涉及一種運動發酵單胞菌快速生產乙醇的方法。菌種為運動發酵單胞菌，種子培養基的成分和各成分在培養基中的濃度為葡萄糖100gL-1，酵母膏5g L-1，(NH4)2SO41g L-1，KH2PO41g L-1，MgSO40.5g L-1，運動發酵單胞菌種子液培養時間為12h～16h；發酵培養基配制方法為將淀粉質原料打漿或打粉，加水拌料使初始糖濃度為180g kg-1～280g kg-1，80℃蒸煮，添加a-淀粉酶液化至碘反應為紅棕色，發酵培養基中添加緩沖劑，每升發酵培養基接入100mL～120mL種子液，發酵培養時間為17h～30h，發酵過程中控制溶氧低于6mg L-1。本發明工藝簡單，可操作性強，最終乙醇濃度高，發酵效率高，發酵速度快，乙醇生產周期縮短2倍以上，可以在收獲季節大量利用甘薯、芭蕉芋等廉價原料，減少保藏費用，同時提高單位設備的生產能力，降低設備運行費用，從而降低乙醇生產成本，具有良好的經濟效益。
文檔編號C12R1/01GK102337304SQ20101023775
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者方揚, 趙海, 靳艷玲 申請人:中國科學院成都生物研究所