人非小細(xì)胞肺癌l858r+v834l基因突變?cè)[瘤移植瘤模型的應(yīng)用的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：人非小細(xì)胞肺癌l858r+v834l基因突變?cè)[瘤移植瘤模型的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥行業(yè)，尤指一種人非小細(xì)胞肺癌L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型在篩選治療非小細(xì)胞肺癌EGRF突變陽(yáng)性患者的靶向藥物中的應(yīng)用，并為探索表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生中的作用提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。
背景技術(shù)：
非小細(xì)胞肺癌患者EGFR酪氨酸激酶區(qū)域基因突變?cè)谖覈?guó)肺癌患者中的發(fā)生率約 為30%左右，突變主要發(fā)生在外顯子19和21，各占突變總數(shù)的54. 5%和40. 3%。其中外顯子21第858位密碼子發(fā)生堿基替換(T — G)突變，使得EGFR蛋白中該位點(diǎn)的氨基酸由亮氨酸(L)轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?R)，簡(jiǎn)稱(chēng)L858R突變，第834位密碼子發(fā)生堿基替換(G — T)突變，該位點(diǎn)的氨基酸由纈氨酸(V)轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?L)簡(jiǎn)稱(chēng)V834L突變。雖然目前國(guó)際上已有少數(shù)兩個(gè)EGFR L858R突變的細(xì)胞株，但目前還未見(jiàn)L858R+V834L雙基因突變細(xì)胞株。且目前認(rèn)為雖然腫瘤細(xì)胞株實(shí)用、可重復(fù)、易于操作，但是這些模型的治療結(jié)果與病人的臨床結(jié)果的一致性欠佳，主要由于只有極少數(shù)的原發(fā)性腫瘤能形成細(xì)胞株，且他們的生長(zhǎng)為單層不能反應(yīng)人類(lèi)腫瘤的微環(huán)境和在體內(nèi)對(duì)治療產(chǎn)生相同的反應(yīng)，而且這些在體外生長(zhǎng)的腫瘤代表了一組臨床預(yù)后更差的病人，從而需要其他的更多臨床相關(guān)非小細(xì)胞肺癌NSCLC模型，并將它們應(yīng)用在臨床實(shí)驗(yàn)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人非小細(xì)胞肺癌L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種人非小細(xì)胞肺癌L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型，表達(dá)L858R+V834L基因突變，且腫瘤能被吉非替尼抑制，該模型在篩選治療非小細(xì)胞肺癌EGRF突變陽(yáng)性患者的靶向藥物中的應(yīng)用，并為探索EGFR突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生中的作用提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。人非小細(xì)胞肺癌L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型的建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)驗(yàn)為5組3-4周齡SCID小鼠，每組10只，雌性，體重10 12g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，在SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。從手術(shù)室無(wú)菌取病人原代肺腫瘤組織轉(zhuǎn)移至含15 mL Hank’s液的無(wú)菌離心管中，4°C運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)中用O. OlM PBS緩沖液清洗3次，去除正常組織及壞死腫瘤組織，將瘤體剪成I. O I. 5mm3大小的瘤塊，24h內(nèi)用套管針接種于第一組免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接種ABCD四個(gè)點(diǎn)，見(jiàn)圖1，每點(diǎn)各接種I. O I. 5_3瘤塊兩塊，在小鼠背部中間兩側(cè)左右各剪一小口，用套管針將腫瘤組織送至AB⑶四個(gè)點(diǎn)。當(dāng)免疫缺陷鼠某一點(diǎn)的皮下移植瘤直徑大于I I. 5cm時(shí)，用戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉處死小鼠，剝離腫瘤，將瘤體剪成I. O I. 5mm3大小的瘤塊，再次用套管針接種于第二組免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接種AB兩個(gè)點(diǎn)，各接種I. O I. 5mm3瘤塊兩塊，如此接種至第四代。每一代均留標(biāo)本做HE染色、免疫組化、免疫印跡、DNA測(cè)序。結(jié)果分別如圖2、圖3、圖4和圖5所示，從圖2HE染色可以看出P1、P2、P3、P4各代均保持PO患者腫瘤的病理特性。圖3為L(zhǎng)858R突變單克隆抗體免疫組化染色，AEC染色，陽(yáng)性為紅色，從圖中可以看出PO、P1、P2、P3、P4各代均表達(dá)EGFR L858R突變蛋白。圖4為L(zhǎng)858R突變單克隆抗體免疫印跡，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，β-actin是內(nèi)參蛋白，從圖中可以看出P0、P1、P2、P3、P4各代均表達(dá)EGFR L858R突變蛋白，圖5為L(zhǎng)858R+V834L突變測(cè)序，圖中左邊箭頭為V834L突變，右邊 箭頭為L(zhǎng)858R突變，從圖中可以看出P0、P1、P2、P3、P4各代均有L858R+V834L突變。如此，通過(guò)取病人的小片腫瘤直接移植至免疫缺陷鼠體內(nèi)建立該原代腫瘤移植瘤模型，該模型均保持非小細(xì)胞肺癌、腺癌、EGFR高表達(dá)、L858R及V834L雙突變的特征，能產(chǎn)生比細(xì)胞株和鼠類(lèi)異體移植更好的代表原始腫瘤異質(zhì)性的模型，該模型移植瘤能被吉非替尼(Iressa)抑制，可用于篩選治療非小細(xì)胞肺癌EGRF突變陽(yáng)性患者的靶向藥物，為探索EGFR突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生中的作用提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。


圖I是肺腫瘤組織接種示意圖。圖2是各代移植瘤HE染色圖。圖3是各代L858R單克隆抗體免疫組化圖。圖4是各代L858R免疫印跡圖。圖5是各代L858R+V834L基因突變測(cè)序圖。其中圖2-圖5各圖中P0代表患者腫瘤(其所代表的圖為PO代圖，以此類(lèi)推)，Pl代表第一代移植瘤，P2代表第二代移植瘤，P3代表第三代移植瘤，P4代表第四代移植瘤。圖6是移植瘤Iressa藥物試驗(yàn)圖，圖中HKI為吉非替尼溶劑對(duì)照組，Irresa為吉非替尼藥物組。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)動(dòng)驗(yàn)為3 4周齡SCID小鼠共12只，雌性，體重10 12g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，在SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。取P3代的新鮮移植瘤，將瘤體剪成I. O I. 5mm3大小的瘤塊，用套管針接種于免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接種一個(gè)點(diǎn)(ABCD四點(diǎn)中的B點(diǎn))，每個(gè)點(diǎn)接種I. O
I.5mm3瘤塊一塊，當(dāng)瘤體直徑達(dá)到3mm時(shí)，把動(dòng)物分成2組，一組喂吉非替尼，另一組為對(duì)照組，喂吉非替尼的溶劑HKI，每周測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑、短徑兩次，喂藥兩周，兩周后處死動(dòng)物，取瘤體稱(chēng)重，瘤體數(shù)據(jù)按V = O. 5a2b (V為體積，a為短徑，b為長(zhǎng)徑)作圖，見(jiàn)圖6。結(jié)果表明該移植瘤能很好的被吉非替尼抑制，能作為篩選治療非小細(xì)胞肺癌EGFR突變陽(yáng)性患者的靶向藥物的模型。
權(quán)利要求
1.一種人非小細(xì)胞肺癌原代腫瘤移植瘤模型，表達(dá)L858R+V834L基因突變，且腫瘤能被吉非替尼抑制。
2.如權(quán)利要求I所述的人非小細(xì)胞肺癌L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型在篩選治療非小細(xì)胞肺癌EGRF突變陽(yáng)性患者的靶向藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求I所述的人非小細(xì)胞肺癌L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型為EGFR突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生中的作用提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。
全文摘要
一種人非小細(xì)胞肺癌L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型產(chǎn)生的移植瘤能被吉非替尼(Iressa)抑制，本發(fā)明的L858R+V834L基因突變?cè)[瘤移植瘤模型可用于篩選治療非小細(xì)胞肺癌EGRF突變陽(yáng)性患者的靶向藥物，并為深入探索表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生中的作用提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102660507SQ20121013449
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月3日
發(fā)明者周新民, 李建明, 胡野榮 申請(qǐng)人:中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院