啟動子及其應用的制作方法

專利名稱：啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種啟動子及其應用，特別涉及一種來源于巴西橡膠樹的啟動子及其應用。
背景技術：
在高等植物中，蔗糖是光合作用的主要產物。在由源到庫的長距離運輸過程中，鹿糖是作為植物體內碳水化合物運輸的主要甚至是唯一的形式(Williams, L. E.，etal.，Sugar transporters in higher plants—a diversity of roles and complexregulation. Trends Plant Sci，2000，5，283-290 ;Sylvie L，et al. The dual functionof sugar carriers: transport and sugar sensing. Plant Cell，1999，11:707-726)。鹿糖分子進出韌皮部篩分子通過兩種不同的途徑進行，即共質體途徑和質外體途徑(Buchanan B.B.,et al. , Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Rockville:AmericanSociety of Plant Physiologists，2000，748-776)。由于在很多種類的作物中，質外體途徑占有極其重要的地位，蔗糖的跨膜運輸及其在植物中的分配需要依賴于膜上的蔗糖轉運蛋白進行介導，蔗糖轉運蛋白作為植物所特有的一類載體蛋白，在蔗糖的分配中具有重要的生理作用，主要是在蔗糖進出韌皮部，庫組織的蔗糖供給，蔗糖的貯藏，蔗糖轉運調控以及其它小分子物質轉運等多種生理過程中發揮重要作用(Gahrtz M.，et al.，Aphloem-specific sucrose-H+symporter from Plantago major L supports the modelof apoplastic phloem loading Plant J，1994，6 (5)，697-706;Truernit E.,et al. , Thepromoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+symporter gene directsexpression of β -glucuronidase to the phloem:evidence for phloem loading andunloading by SUC2. Plantaj 1995，196: 564-570 ; Kiihn C.，Companion cell-specificinhibition of the potato sucrose transporter SUTl. Plant Cell Environ, 1996, 19，1115_1123;Biirkle L，et al. , The H+_sucrose cotransporter NtSUTl is essentialfor sugar expurt from tobacco leaves. Plant Physiol，1988，118，59—68;HackelA, et al.，Sucrose transporter LeSUTl and LeSUT2 inhibition affects tomatofruit development in different ways.The Plant Journal，2006，45，180-192;Gabriel-Neumann E，et al.，Constitutive overexpression of the sucrosetransporter SoSUTl in potato plants increases arbuscular mycorrhiza fungalroot colonization under high,but not under low,soil phosphorus availability. JPlant Physiol，2011，168(9):911-9;Siahpoosha M. R.，et al. , Modification of OsSUTlgene expression modulates the salt response of rice Oryza sativa cv.Taipei309. Plant Science 2011)。一些實驗結果表明鹿糖轉運蛋白還參與了對非生物脅迫和生物脅迫的口向應(Sakr S.，et al.，Cutting，ageing and expression of plant membranetransporters. Biochim. Biophys. Acta, 1997，1330:207-216;Meyer S.，AtSUC3，a geneencoding a new Arabidopsis sucrose transporter, is expressed in cells adjacentto the vascular tissue and in a carpel cell layer. Plant J, 2000，24:869-882),以及鹿糖信號感應與轉運效率的調控(Barker L. , et al. , SUT2, a putative sucrose sensorin sieve elements. Plant Cell,2000，12，1153-1164;Schulze ff. , et al. , Function ofthe cytosolic N-terminus of sucrose transporter AtSUT2 in substrate affinity.FEBS Lett,2000,485:189-194;Reinders, A. , Schulze, ff. , et al., Protein - proteininteractions between sucrose transporters of different affinities colocalizedin the same enucleate sieve element. Plant Cell,2002，14，1567 - 1577)。巴西橡膠樹是一種在世界經濟和軍事發展中均扮演重要角色的熱帶樹種，其生產的天然橡膠是一種重要的工業原料和戰略物資。天然橡膠的生物合成是以蔗糖為原料，以乳管為加工場所進行，乳管中蔗糖的供給能力與橡膠產量密切相關。早期，Bouteau等人通過同位素標記和電生理試驗首次證明在乳管的原生質體膜上存在參與乳管糖吸收的糖-質子共轉運系統(sugar-H+symport system) (Bouteau F. , Evidence of multiplesugar uptake across the plasma membrane of lacticifer protoplasts from Hevea.Bioelectrochem Bioenerg,1999, 48 (I):135-139)。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物啟動子及其應用。該啟動子具有組織特異性表達特性并可被多種因素誘導表達，可以用于培育轉基因植物并控制外源基因的表達特異性和表達量。本發明所提供的啟動子，來源于大戟科橡膠屬的巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis),名稱為PrHb5,可以是下述核苷酸序列之一I)序列表中序列I的DNA序列；2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在0. IXSSPE (或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液中，在65° C下雜交并洗膜。其中，序列表中序列I是由1440個脫氧核苷酸組成。
結果顯示自序列表中序列I的V端第20廣251位核苷酸，序列I的V端第626飛76位核苷酸，序列I的5'端第1057 1107位核苷酸處存在可能的基礎啟動子區域(表1)，特別是1057-1107基礎啟動子區域的得分值接近1.0，表明是核心啟動子區的可靠性很高。該序列中還含有激素、脅迫、及其他作用元件如表2所示。含有上述啟動子的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。在所述表達盒中，所述植物啟動子的下游連接結構基因，或調節基因，或結構基因或調節基因的反義基因，或者能夠干擾內源基因表達的小RNA，用于驅動結構基因，或調節基因，或結構基因或調節基因的反義基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表達。所述重組表達載體是上述表達盒與質粒、病毒或運載體表達載體所構建的重組載體，所述重組表達載體為重組植物表達載體，所述重組植物表達載體含有上述表達盒并且能夠將所述的表達盒轉送進入植物宿主細胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。上述重組表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導或基因槍等常規生物學方法轉化植物細胞或組織或器官，得到轉基因植物細胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無性系或其后代。本發明的啟動子存在著大量的可能與激素應答相關、脅迫應答相關(生物脅迫與非生物脅迫)、光應答相關、發育相關、糖應答相關的順式作用元件，其中激素應答及根特異表達調控相關的作用元件最為廣泛。構建該啟動子的GUS融合表達載體，通過轉基因擬南芥對其進行功能驗證，發現該啟動子在根中活性最高，同時發現該啟動子活性受多種激素及脅迫調節。為了驗證該啟動子的功能，構建了 GUS融合表達載體，并對其進行了本發明的啟動子進行擬南芥轉基因分析，確定了該啟動子的活性，該啟動子為根特異表達及誘導型啟動子。 實驗證明，本發明的啟動子存在著大量的可能與激素應答相關、脅迫應答相關(生物脅迫與非生物脅迫)、光應答相關、發育相關、糖應答相關的順式作用元件，其中激素應答及根特異表達調控相關的作用元件最為廣泛。構建該啟動子的GUS融合表達載體，通過煙草瞬時表達及轉基因擬南芥對其進行功能驗證，發現該啟動子在根中活性最高，同時發現該啟動子活性受多種激素調節，如生長素、乙烯利前體I-氨基環丙烷-I-羧酸(ACC)、細胞分裂素、水楊酸、脫落酸、赤霉素；并且，該啟動子可以被非生物環境脅迫誘導，如干旱脅迫、高溫脅迫(37°C)、低溫脅迫(4°C)或機械傷害；且大部分屬于誘導下調。因此，該啟動子在橡膠樹以外的其他植物及微生物工程中得到廣泛的應用。綜上所述，該啟動子能指導外源基因在植物發育過程中特定時空表達，它不僅能使目的基因的表達產物在一定空間積累，增加或降低區域表達量，調節表達產物的表達空間和表達量。因此，該啟動子在橡膠樹以外的其他植物及微生物工程中得到廣泛的應用。


圖I.橡膠樹蔗糖轉運蛋白基因啟動子順式作用元件統計分析。圖2.轉基因擬南芥陽性植株(轉pPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)組織染色分析；A:擬南芥陽性植株幼苗期及其各組織的染色結果B:轉基因擬南芥陽性植株成熟期各組織的染色結果。圖3.轉基因擬南芥陽性植株各組織中⑶S熒光定量分析，其中，橫坐標中，1-6依次為PrHb5啟動子轉基因擬南芥(轉pPPrHb5-GUS擬南芥陽性植株)的根、蓮座葉、莖、莖生葉、種子、花；7_12依次為轉對照質粒PCK擬南芥根、蓮座葉、莖、莖生葉、種子、花。圖4.乙烯利前體對PrHb5啟動子轉基因擬南芥(轉pPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)GUS表達活性熒光定量分析；圖5.生長素對PrHb5啟動子轉基因擬南芥(轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)⑶S表達活性熒光定量分析；圖6.細胞分裂素對PrHb5啟動子轉基因擬南芥(轉pPPrHb5-GUS擬南芥陽性植株)GUS表達活性熒光定量分析；
圖7.赤霉素對PrHb5啟動子轉基因擬南芥⑶S (轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)表達活性熒光定量分析；圖8.水楊酸對PrHb5啟動子轉基因擬南芥⑶S (轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)表達活性熒光定量分析；圖9.脫落酸對PrHb5啟動子轉基因擬南芥⑶S (轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)表達活性熒光定量分析；圖10.低溫脅迫對PrHb5啟動子轉基因擬南芥⑶S (轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)表達活性熒光定量分析；圖11.高溫脅迫對PrHb5啟動子轉基因擬南芥⑶S (轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)表達活性熒光定量分析；圖12.傷害脅迫對PrHb5啟動子轉基因擬南芥(轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株) GUS表達活性熒光定量分析；圖13.干旱脅迫對PrHb5啟動子轉基因擬南芥(轉PPPrHb5_GUS擬南芥陽性植株)GUS表達活性熒光定量分析。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例I、橡膠樹啟動子獲得一 .構建橡I父樹啟動子克隆文庫為了更好的構建橡膠樹啟動子克隆文庫，對Clontech的Genome Walker Universal Kit中的接頭長鏈進行了修改，短鏈未做修改，接頭的短鏈與長鏈分別溶解于TE溶液，濃度為10(^11101/1，長鏈和短鏈1:1混合，變性退火(951 5min，37°C lOmin，室溫放置30min)形成接頭，接頭濃度為50 μ mol/1。以橡膠樹品系熱研7_33_97的葉片為材料提取基因組DNA，方法采用安澤偉等人改進的CTAB法。選取25種限制性內切酶對橡膠樹熱研7-33-97 (中國熱帶農業科學院橡膠研究所培育，中國熱帶農業科學院橡膠研究所長期有種苗出售)基因組基因進行完全酶切，其中酶切產物為粘性末端的限制性內切酶包括BamH I、Bcl I,Bcu I、Bgl 11,BspT I,EcoR I,Hind III,Kpn I,Nco I,Nde I,Sty I和 Xba I ;產物為平末端的包括 BseJ I、Bstll07I、Dra I、Ecol05I、Ecol47I、Eco72I、EcoR V, HincII,KspA I、Pvu II、Sca I、Ssp I 和 Xap I。酶切體系如下，5. Ομ I IOx 酶切 buffer, 5· O μ g基因組DNA，37°C或者對應內切酶的最佳酶切溫度，酶切16h ;對酶切產物進行酚氯仿抽提，乙醇-醋酸鈉沉淀回收酶切后的基因組DNA。利用T4DNA Polymerase對酶切產物進行末端平端化處理，反應結束后，酚氯仿抽提，乙醇-醋酸鈉沉淀回收平端化酶切產物，分別與接頭連接。連接體系如下1·0μ1 IOx ligase buffer, I. O μ I 50%PEG4000，I. O μ g 酶切產物，Ι.ΟμΙ 50μπιο1/1 接頭，2. 5U T4DNA ligase，加滅菌水至 10. 0 μ 1，16°C 連接 24h ;65°C，IOmin滅活連接酶，稀釋10倍后即可作為啟動子克隆的模板。橡膠樹啟動子克隆文庫包括由25種限制性內切酶的基因組DNA酶切產物加上接頭而形成的啟動子克隆模板。二.橡膠樹膠乳蔗糖轉運蛋白啟動子序列的獲得根據本實驗室獲得的橡膠樹蔗糖轉運蛋白的cDNA序列設計巢式PCR引物兩條PrHb5-GSPl 5’ -TTGAAGTCACACGTAGTAGTTGACGCAACC-3’
PrHb5-GSP2 5’ -AACCGGACTCTGCGGACCACCGGTGGTCT-3’利用設計的兩條基因特異性引物(GSP1和GSP2)，結合接頭引物(ADP1和ADP2)，以步驟一獲得的文庫為模板，進行巢式PCR擴增，以獲得基因的啟動子序列。第一輪PCR擴增使用高保真的熱啟動DNA聚合酶primeSTAR HS DNA Ploymerase進行Touch Down PCR,反應體系如下5. O μ I 5 XPrimeSTAR buffer (Mg2+plus), 2. O μ I 2. 5mM dNTP Mixture,I. Ομ I 稀釋 10 倍·的文庫(取 25 個模板之一)，0. 5μ I ADPl (10 μ Μ), O. 5μ I GSPl(IOyM),
0.25 μ I PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/μ I)，加滅菌水至 25. O μ I.反應程序如下94°C 3分鐘；98°C 10秒，72°C 5分鐘，7個循環；98°C 10秒，68°C 5分鐘，32個循環；68°C 7分鐘。第二輪PCR擴增采用LA Taq DNA Polymerase進行兩步法PCR，并以第一輪擴增產物為模板，反應體系如下2. 5μ 15 X LA PCR buffer (Mg2+plus), 2. O μ I 2. 5mM dNTP Mixture,
1.0μ I 稀釋 100 倍的第一輪PCR擴增產物，0· 5μ I ADP2 (10 μ Μ)，O. 5 μ 11 GSP2(10yM),O. 2μ I PrimeSTAR HS DNA Polymerase (5. OU/μ I)，加滅菌水至 25. O μ I.反應程序如下94°C 3分鐘；94°C 30秒，68°C 5分鐘30個循環；68°C 7分鐘。PCR獲得大小1500bp左右的核苷酸序列片段，并將其克隆到PMD18-T載體進行測序，對其序列進行分析確定該序列為蔗糖轉運蛋白基因的啟動子，啟動子長度為1440bp命名為PrHb5。實施例2、橡膠樹膠乳蔗糖轉運蛋白啟動子序列分析一.橡膠樹膠乳蔗糖轉運蛋白核心啟動子位點預測利用 promoter Prediction 軟件(http://www. fruitfly. org/seq_tools/promoter, html)對鹿糖轉運蛋白(PrHb5)啟動子的基礎啟動子進行預測,結果顯示自序列表中序列I的5'端第20廣251位核苷酸，序列I的5'端第626飛76位核苷酸，序列I的5'端第1057 1107位核苷酸處存在可能的基礎啟動子區域(表1)，特別是1057-1107基礎啟動子區域的得分值接近1.0，表明是核心啟動子區的可靠性很高。同時序列中陰影處為預測的轉錄起始位點。表IBDGP (Berkeley Drosophila Genome Project)數據庫啟動子預測結果
Start_End_Score_Promoter Sequence_
201 251 o. 92 aaattaaaattagtgttgaattatmaaggcgtaamtttTatgcttttc
626676 0.87GTAT^GTGTTATGATTACTTTACATAGAGCCtCGTGGATGGTCCCACTAC
1057 1107 0.99TCACTTTMCGGGGAMTGGCCTTMAACCCCCCC.4AAACAMTACAACT二.橡膠樹啟動子順式元件預測利用Plantcare 軟件(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)軟件在線分析啟動子的順式作用元件。分析結果表明，該啟動子除存在啟動子的基礎轉錄元件TATA-Box和CAAT-Box外，同時存在著大量的可能與激素應答相關、脅迫應答相關(生物脅迫與非生物脅迫)、光應答相關、發育相關的順式作用元件(表2)。其中與光應答作用元件最多，其次為脅迫應答、激素應答及發育相關的順式作用元件(圖I)。甲基茉莉酸應答順式作用元件(CGTCA-motif、TGACG-motif )，乙烯應答順式作用元件(ERE)，生長素應答順式作用元件(TGA-motif)，赤霉素應答順式作用元件(P-box)及水楊酸應答順式作用元件(TCA-element)，這些激素分別或相互協調地調控植物的生長、發育與分化。在脅迫應答相關的順式作用元件中，主要包括了厭氧脅迫應答順式作用元件(ARE)，高低溫脅迫應答相關的順式作用元件(HSE，LTR)及干旱脅迫作用元件(MBS)。在發育相關的順式作用元件中主要包括了分生組織(CAT-box)，柵欄葉肉細胞(HD-Zip1，HD-Zip 2)及胚乳發育相關的順式作用元件。光應答的相關順式作用元件廣泛分布于PrHb5 啟動子(GA-motif, BoxI, Spl, GTl-motif 等)。表2. PrHb5啟動子區域順勢作用元件預測
權利要求
1.一種DNA分子,其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列I的DNA序列；2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求I所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為啟動子。
3.含有權利要求I或2所述的DNA分子的表達盒。
4.含有權利要求I或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子的重組表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。
5.權利要求I所述的DNA分子為作為植物啟動子中的應用。
6.權利要求I所述的DNA分子在培育轉基因植物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述轉基因植物中，所述權利要求I所述的DNA分子的下游連接外源基因，所述外源基因在根中特異性表達。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述外源基因受植物激素和非生物環境脅迫誘導表達。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述植物激素為乙烯利前體I-氨基環丙燒-I-羧酸和/或細胞分裂素和/或水楊酸和/或脫落酸和/或赤霉素。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述非生物環境脅迫為高溫脅迫、低溫脅迫或機械傷害。
全文摘要
本發明公開了一種啟動子及其應用。該啟動子，1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明的啟動子根特異表達調控及多種激素誘導啟動子，如乙烯利前體1-氨基環丙烷-1-羧酸、細胞分裂素、水楊酸、脫落酸、赤霉素GA；并且，該啟動子可以被非生物環境脅迫誘導，如干旱高溫脅迫(37℃)、低溫脅迫(4℃)或機械傷害。
文檔編號C12N5/10GK102776197SQ20121026210
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者唐朝榮, 戚繼艷, 方永軍, 辛魯生, 陽江華, 龍翔宇 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所