一種高效分泌表達納豆激酶的重組菌的制作方法

一種高效分泌表達納豆激酶的重組菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可高效分泌表達納豆激酶的重組菌，可顯著提高納豆激酶的產(chǎn)量。本發(fā)明的重組菌是含有兩個拷貝以上納豆激酶Pro-NK基因和Hac1p調(diào)控因子基因的重組巴斯德畢赤酵母菌，該重組菌在搖瓶發(fā)酵96小時后，納豆激酶的酶活可達470IU/mL。
【專利說明】一種高效分泌表達納豆激酶的重組菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組菌，特別涉及一種能夠高效分泌表達納豆激酶的重組菌。
【背景技術(shù)】
[0002]納豆激酶(Nattokinase，NK)是一種在納豆發(fā)酵過程中由納豆菌或納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶。1980年，日本須見洋行教授首先發(fā)現(xiàn)該酶能溶解人造血栓，而后研究了該酶的作用機理，并將其命名為納豆激酶。
[0003]從1995年國內(nèi)第一篇有關(guān)納豆和納豆激酶的報道以來，至今已有多篇文章發(fā)表，而且研究與開發(fā)同時并進。目前對納豆激酶的性質(zhì)(納豆激酶基因序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列、活性中心及催化中心、p1、溫度及pH穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度及pH、抑制劑及激活劑以及納豆激酶的溶栓機制包括①納豆激酶的直接溶栓作用；②激活尿激酶原變成尿激酶；③激活血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生t-PA ;④納豆激酶的間接溶栓作用，通過降解和失活PA1-1，增加纖溶作用等均已闡明，而且已對該酶進行了分離純化，在體內(nèi)外溶栓動物試驗、急性毒性試驗及治療腦梗塞的初步臨床試驗等方面進行了大量研究工作。
[0004]目前，納豆激酶在日本已得到廣泛深入的研究，日本已有10余家大公司生產(chǎn)出多種以納豆激酶為主要成分的產(chǎn)品均已經(jīng)上市，美國國際醫(yī)衛(wèi)生技術(shù)制藥股份有限公司的納豆激酶膠囊也已面市，韓國和朝鮮也有類似產(chǎn)品問世。在我國，已有多家廠商生產(chǎn)納豆激酶膠囊制品，但由于生產(chǎn) 菌株產(chǎn)量過低致使市售納豆激酶保健品與日本進口產(chǎn)品相比，活力單位相差很大。因此有必要對納豆激酶生產(chǎn)菌株進行改造，以大幅增加菌株產(chǎn)量，提高最終廣品品質(zhì)。
[0005]與傳統(tǒng)育種相比，依靠基因工程手段，用模式宿主如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母以及畢赤酵母等來生產(chǎn)重組納豆激酶是短時間內(nèi)提高納豆激酶產(chǎn)量的捷徑。目前為止，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母表達的納豆激酶的案例都不是很成功。近些年，畢赤酵母以其安全、高效分泌表達，在醫(yī)藥和重要食品酶制劑的表達上取得了越來越多的應(yīng)用，因此，使用畢赤酵母來生產(chǎn)納豆激酶將是最具有應(yīng)用前景的方法之一。目前已有一些用畢赤酵母表達納豆激酶的報道，羅立新等人將納豆激酶成熟肽基因在畢赤酵母GS115，KM71中表達成功，發(fā)酵上清液中的酶活力為120U/mL (黃志立，羅立新，凌均建等.納豆激酶基因重組表達載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定性[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2000，16(4): 265-267)。王江波等將納豆激酶全肽基因在畢赤酵母GS115、KM71、SMDl 168中成功表達并比較分析(汪江波，許芳，張婧芳.納豆激酶原基因在畢赤酵母中的分泌表達[J].中國釀造，2008，19(196):40-41)ο蔡立濤等將NK基因克隆到畢赤酵母表達載體pHBM905A中，甲醇誘導(dǎo)表達，結(jié)果SDS-PAGE結(jié)果顯示NK成功表達，纖維蛋白平板實驗顯示表達產(chǎn)物具有較好的纖溶活性(蔡立濤，徐祥，王婷婷等.納豆激酶基因在畢赤酵母中的表達純化及抗體制備[J].中國生化藥物雜志，2010 (I))。但是上述文章中納豆激酶的表達水平仍然無法滿足產(chǎn)業(yè)化的需求，仍需要對于生產(chǎn)菌株做進一步的優(yōu)化和提升。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠高效分泌表達納豆激酶的重組菌。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]納豆激酶Pro-NK基因的重組載體，該重組載體是將兩個以上的納豆激酶Pro-NK基因插入真核表達載體后得到的。
[0009]進一步的優(yōu)選的重組載體是將兩個以上的納豆激酶Pro-NK基因同向插入真核表達載體后得到的。[0010]上述納豆激酶Pro-NK基因的編碼序列如序列表中SEQ ID N0.3所示。
[0011]每個納豆激酶Pro-NK基因具有一個與其相應(yīng)的啟動子。
[0012]上述啟動子為醇氧化酶I啟動子(P.)或甲醛脫氫酶啟動子(Ρ_)。
[0013]優(yōu)選的納豆激酶Pro-NK基因的重組載體，選用的真核表達載體為ρΑ0815表達載體；該ρΑ0815表達載體是通過將pPICZ α載體用SacI和EcoRI進行雙酶切得到的1000bp片段與同樣用SacI和EcoRI消化過的ρΑ0815載體連接所得到；每個納豆激酶Pro-NK基因處于一個與其相應(yīng)的醇氧化酶I啟動子之下表達，相鄰的納豆激酶Pro-NK基因之間依次串聯(lián)有醇氧化酶I終止子、醇氧化酶I啟動子與a -mating因子信號肽序列。
[0014]該重組載體是按以下方法構(gòu)建而得:
[0015](I)人工合成或PCR擴增納豆激酶Pro-NK基因，在其5’端上游添加XhoI酶切位點，3’端下游添加EcoRI酶切位點；將該基因片段用XhoI和EcoRI雙酶切處理后與同樣經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切消化的PA0815載體連接，得到含有單拷貝納豆激酶Pro-NK基因的重組載體pAO a -PNK ；
[0016]上述合成方法優(yōu)選為PCR擴增法，其具體步驟如下:提取納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp natto)的染色體DNA,以其作為模板,用序列表中SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的上、下游引物進行PCR，得到目的DNA片段；
[0017](2)用BamHI和BglII雙酶切消化處理步驟(1)中所得到的重組表達載體ρΑΟ α -PM,回收得到2589bp的片段，將其連接入重組表達載體pAO a -PNK的BamHI位點，即得到含有兩拷貝納豆激酶Pro-NK基因的重組表達載體ρΑΟ α -ΡΝΚ-2 ；
[0018](3)用同樣的方法依此類推，得到含有大于兩個拷貝納豆激酶Pro-NK基因的重組載體ρΑΟα -ΡΝΚ-η，其中η表示重組載體中納豆激酶Pro-NK基因的拷貝數(shù)，η > 2。
[0019]一種高效分泌表達納豆激酶的重組菌，是含有兩個拷貝以上的納豆激酶Pro-NK基因和Haclp調(diào)控因子基因的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
[0020]上述巴斯德畢赤酵母菌為巴斯德畢赤酵母菌GS115。
[0021 ] 上述納豆激酶Pro-NK基因是通過上述納豆激酶Pro-NK基因的重組載體導(dǎo)入到所述巴斯德畢赤酵母菌中，得到含有兩個拷貝以上的納豆激酶Pro-NK基因的重組巴斯德畢赤酵母菌。
[0022]繼續(xù)將Haclp調(diào)控因子基因是通過組成型表達載體導(dǎo)入到含有兩個拷貝以上的納豆激酶Pro-NK基因的重組巴斯德畢赤酵母菌中，得到的重組菌能夠產(chǎn)生Haclp調(diào)控因子，進一步提高了納豆激酶的分泌量；
[0023]上述組成型表達載體優(yōu)選為組成型表達載體pGAPZ-Haclp，該組成型表達載體是通過將Haclp調(diào)控因子基因插入到pGAPZA載體中構(gòu)建而得。[0024]本文中的“組成型表達載體”，表示其中的外源基因可以不受調(diào)控因子的調(diào)控，在適宜的條件下即可持續(xù)不斷的表達外源基因。上述載體PGAPZ-Haclp采用了組成型啟動子Pmp，其中的目的基因不需要誘導(dǎo)即可表達。
[0025]上述Haclp調(diào)控因子基因來源于酵母或霉菌。
[0026]上述Haclp調(diào)控因子基因的編碼序列如序列表中SEQ ID N0.5所示。
[0027]上述將重組載體導(dǎo)入到畢赤酵母菌中的方法為電轉(zhuǎn)化法。
[0028]本發(fā)明還提供了上述高效分泌表達納豆激酶的重組菌在保健品加工中的應(yīng)用以及在制備治療腦梗塞藥物中的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明的有益效果是:通過本發(fā)明所構(gòu)建的重組載體，所得到的重組菌在搖瓶中分泌表達納豆激酶的產(chǎn)量水平可達每毫升470IU (按照尿激酶活性檢測方法測定)，比現(xiàn)有技術(shù)顯著提高。本發(fā)明重組菌制備的納豆激酶，可以加工成保健品或作為療腦梗塞藥物的有效成分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為分泌型表達載體pA0815alpha的構(gòu)建不意圖。
[0031 ] 圖2為重組表達載體pAO a -PNK的圖譜。
[0032]圖3為重組表達載體ρΑΟ α -ΡΝΚ-2的圖譜。
[0033]圖4為組成型表達載體pGAPZ-Haclp的圖譜。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。
[0035]下述實施例中所使用的培養(yǎng)基及緩沖液的配方如下:
[0036]LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基:10g/L 氯化鈉、10g/L 蛋白胨、5g/L 酵母粉，ρΗ7.4-7.6 ；
[0037]LLB培養(yǎng)基:5g/L氯化鈉、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，pH7.4-7.6 ；
[0038]BMGY液體培養(yǎng)基:10g/L酵母精提物、20g/L蛋白胨，121°C滅菌20分鐘后，溫度降至室溫時加入13.4g/LYNB、4X 10_4g/L生物素、10g/L甘油；
[0039]BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基:10g/L酵母精提物、20g/L蛋白胨，121°C滅菌20分鐘后，溫度降至室溫時加入13.4g/L YNB, 4X 10VL生物素及0.5% (V/V)甲醇；
[0040]Yro培養(yǎng)基:10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖；
[0041]YPD平板:10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、15g/L瓊脂糖；
[0042]MD 平板:13.4g/LYNB、4X 10_4g/L 生物素、20g/L 葡萄糖、15g/L 瓊脂糖；
[0043]200m mol/L三氯乙酸:稱取3.268g三氯乙酸，加水溶解后定容至IOOmL ；
[0044]STE 緩沖液:10m mol/L Tris-Cl，ρΗ8.0、0.Im mol/L NaClUm mol/L EDTA,ρΗ8.0 ；
[0045]TE 緩沖液:10m mol/L Tris-Cl, pH8.0、0.lmmol/L NaClUmmol/L EDTA, pH8.0 ；
[0046] 50m mol/L硼砂緩沖液:在19.07g四硼酸鈉加入9g氯化鈉，溶解后加水定容至lOOOmL，用硼酸調(diào)節(jié)pH為8.5。[0047]下述實施例中的實驗材料，如無特殊說明，均可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑購得。下述實施例中所采用的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048]實施例1、含有納豆激酶Pro-NK基因的重組表達載體的構(gòu)建
[0049](I)納豆枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp natto)染色體DNA的抽提
[0050]將_70°C保存的納豆枯草芽孢桿菌(保藏編號為CGMCC1.1086，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)的孢子懸液或斜面菌絲體接種至5mL LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)48小時。取3mL菌液離心，收集菌絲體，用500 μ L STE緩沖液洗滌菌絲體兩次。然后用500 μ LSTE使菌絲體充分懸浮，加溶菌酶至其終濃度為2mg/mL，此時菌體懸浮液變?yōu)榘胪该髂z狀，再加入250yL的2%SDS(Sodium dodecyl sulfate，十六烷基硫酸鈉)，震蕩混勻。然后加入250 μ L中性苯酚/氯仿混合溶液充分混勻，其中苯酚、氯仿的體積比為25:24。10000r/min離心5分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中，加入RNase至其終濃度為20-40 μ g/mL，37°C保溫30分鐘。然后采用相同的方法，用中性苯酚/氯仿重復(fù)抽提3_4次，直到兩相界面不再有變性蛋白存在，再用氯仿抽提兩次除去水溶液中的苯酚。向水溶液中加入1/10體積3mol/L的醋酸鈉和等體積的異丙醇,混勻后室溫放置30分鐘。10000r/min離心5分鐘，用70%乙醇洗滌、沉淀一次，將沉淀真空抽干后復(fù)溶于100-200 μ L TE緩沖液中，得到納豆枯草芽孢桿菌染色體DNA，將其作為合成納豆激酶Pro-NK基因所用的PCR反應(yīng)模板。
[0051](2)中間載體的構(gòu)建
[0052]如圖1所示,將pPICZ α載體(購自Invitrogen公司)用SacI/EcoRI雙酶切,得到1000bp的片段,將小片段與同樣用SacI/EcoRI消化過的pA0815載體(購自Invitrogen公司)連接，即得到基于PA0815的分泌型載體pA0815alpha，該表達載體中的Paoti強啟動子可以調(diào)控插入目的基因的 表達，并含有a -mating信號肽序列，可以使插入的目的基因表達為胞外分泌蛋白。
[0053](3)納豆激酶Pro-NK基因的PCR擴增
[0054]根據(jù)GenBank中納豆枯草芽孢桿菌來源的納豆激酶Pro-NK基因(GenBank編號:AF368283.1)設(shè)計PCR引物，上、下游引物分別如序列表中SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示,納豆激酶Pro-NK基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3所示。
[0055]上游引物:5’-GACTCTCGAGAAAAGAGCCGGAAAAAGCAGTACA-3，
[0056]下游引物:5’-GGTCGAATTCTATTATTGTGCAGCTGCTT-3’
[0057]在分泌型載體pA0815alpha的a -mating因子信號肽編碼序列下游有一個XhoI酶切位點(CTCGAG，對應(yīng)氨基酸為Leu-Glu)，其后緊跟一個Kex2蛋白酶識別位點(AAAAGA，對應(yīng)氨基酸序列Lys-Arg)，因此，上游引物的設(shè)計是在納豆激酶Pro-NK基因之前引入XhoI位點和Kex2蛋白酶識別位點序列。通過該設(shè)計，即可將納豆激酶Pro-NK基因直接連接在信號肽序列之后，這樣蛋白翻譯后，在畢赤酵母自身Kex2蛋白酶的作用下，即可最終表達出與目的蛋白相比氨基酸不變的成熟蛋白，而不會因添加酶切位點的原因引入額外的氨基酸殘基。下游引物包含終止密碼子TAT，并引入一個EcoRI酶切位點(GAATTC)。
[0058]以步驟(1)得到的納豆枯草芽孢桿菌染色體DNA為模板，加入上游引物、下游引物、Prime star DNA聚合酶(購自TaKaRa公司)及dNTP混合物，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下:在98°C下預(yù)變形3min ;循環(huán)擴增30次:98°C 15s，55°C 15s,72°C 70s ;最后在72°C延伸90s。擴增后得到的產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定，得到大小為IOSObp的基因片段，其含有納豆激酶Pro-NK基因的編碼序列，且在該序列的5’端上游有XhoI酶切位點，3’端下游有EcoRI酶切位點。
[0059](4)含有單拷貝納豆激酶Pro-NK基因的重組表達載體的構(gòu)建
[0060]將步驟(3)所得的PCR產(chǎn)物用XhoI和EcoRI雙酶切后，與同樣經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切消化后的分泌型載體pA0815alpha相連接，得到含有單拷貝納豆激酶Pro-NK基因的重組表達載體pAO a -PNK,該載體的圖譜如圖2所示。
[0061]將得到的重組表達載體ρΑΟα-ΡΝΚ轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，用含有10 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基篩選出所需重組子并進行測序分析，經(jīng)過測序鑒定，得到的重組載體中插入片段的序列和結(jié)構(gòu)均正確,將此重組表達載體命名為pAOa -PNK。
[0062](5)含有兩拷貝納豆激酶基因的重組表達載體的構(gòu)建
[0063]將步驟(4)中所得到的重組表達載體pAO a-PNK用BamHI和BglII雙酶切，回收2589bp的BamH1-PNK-BglII片段，連接入表達載體pAO a -PNK的BamHI位點，即可得含有兩拷貝納豆激酶基因的表達載體ρΑΟ α -ΡΝΚ-2，該載體的圖譜如圖3所示。
[0064]將得到的重組表達載體ρΑ0α-ΡΝΚ-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，用含有10 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基篩選出所需重組子并進行測序分析，經(jīng)過測序鑒定，得到的重組載體中插入片段的序列和結(jié)構(gòu)均正確,將此重組表達載體命名為pAOa -PNK-2。
[0065](6)組成型表達載體pGAPZ-Haclp的構(gòu)建 [0066]首先人工合成Haclp調(diào)控因子基因，其編碼序列如序列表SEQ ID N0.5所示，并在其序列的5’端和3’端各引入一個EcoRI和NotI位點，酶切處理后，將Haclp基因連接到同樣經(jīng)EcoRI和NotI酶切的pGAPZA載體(購自Invitrogen公司)上,得到pGAPZ-Haclp組成型表達載體，該載體的圖譜如圖4所示。
[0067]將得到的重組表達載體pGAPZ-Haclp轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，用含有25 μ g/mL博來霉素(Zeocin)的LLB培養(yǎng)基篩選出所需重組子并進行測序分析，經(jīng)過測序鑒定，得到的重組載體中插入片段的序列和結(jié)構(gòu)均正確，將此重組表達載體命名為pGAPZ-Haclpo
[0068]實施例2、表達納豆激酶的酵母菌株的制備及其功能檢測
[0069]1.表達納豆激酶的菌株的制備
[0070](I)電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母細胞的制備
[0071]接種畢赤酵母菌株GS115 (購自Invitrogen公司，CA.18100)于500mL YI3D培養(yǎng)基中，30°C、200r/min培養(yǎng)至OD600 = 1.3-1.5。在4°C、4500r/min條件下離心5分鐘收集菌體，分別用500mL、250mL預(yù)冷的滅菌水和20mL預(yù)冷的lmol/L山梨醇各洗滌一次。每次洗后均在4°C、4500r/min離心5分鐘收集菌體，最后用ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇懸浮，即獲得電擊感受態(tài)細胞。
[0072](2)含有重組表達載體pAO a -PNK的重組巴斯德畢赤酵母菌株的制備
[0073]取實施例1中得到的重組表達載體ρΑΟ a -PNK約10 μ g左右，用StuI酶切線性化，用乙醇沉淀，回收線性DNA并溶解于10 μ L無菌水中。將上述線性化DNA與80 μ L GS115感受態(tài)細胞混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電擊杯中。根據(jù)所使用電轉(zhuǎn)化儀(Gene pulser XCelI?,購自BIO-RAD公司)進行電擊。電擊結(jié)束后立即加入ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇至電擊杯中，然后將電擊杯中的溶液全部轉(zhuǎn)移至一無菌離心管中，直接取200-300 μ L菌液涂布MD平板。30°C倒置培養(yǎng)2-4天直至菌落出現(xiàn)，獲得表達納豆激酶的單拷貝菌株，命名為GSPNK。
[0074](3)含有重組表達載體ρΑΟ α -ΡΝΚ-2的重組巴斯德畢赤酵母菌株的制備
[0075]按照步驟(2)所提供的方法，將實施例1中得到的重組表達載體ρΑΟα-ΡΝΚ-2進行線性化及電轉(zhuǎn)化處理，得到含納豆激酶兩拷貝基因的重組畢赤酵母，平板篩選后獲得表達納豆激酶的兩拷貝菌株，命名為GS2PNK。
[0076](4)同時含有表達載體ρΑΟ α -ΡΝΚ-2和組成型表達載體pGAPZ-Haclp的重組巴斯德畢赤酵母菌株的制備
[0077]取實施例1中得到的組成型表達載體pGAPZ-Haclp約10 μ g，用AvrII酶切線性化，按照步驟(2)中所提供的方法將其電轉(zhuǎn)化重組菌株GS2PNK，電擊結(jié)束后立即加入ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇至電擊杯中，然后將電擊杯中的溶液全部轉(zhuǎn)移至一無菌離心管中，于30°C溫浴2小時，然后取500 μ L菌液涂布在含有50 μ g/mL博來霉素(Zeocin)的YPD平板上。30°C倒置培養(yǎng)2-4天直至菌落出現(xiàn)，通過菌落PCR鑒定，即可獲得含Haclp蛋白調(diào)控因子的重組畢赤酵母菌株，命名為GS2PNK-H。
[0078]2.功能檢測
[0079](I)重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0080]將上述得到的重組菌株GSPNK、GS2PNK和GS2PNK-H分別接種于25mLBMGY液體培養(yǎng)基中，平行設(shè)置三組，于30°C、200r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)至OD6tltl= 10-20，3000r/min離心5分鐘收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1-2次。將菌體用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋至0D_=10,用4層紗布代替棉花塞,于30°C、200r/min搖床培養(yǎng),每天補加甲醇至其終濃度為 0.5% (V/V)。
[0081](2)胞外酶活的測定
[0082]重組菌在30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4天后，吸取發(fā)酵液ImL于離心管中，10000r/min離心10分鐘，吸取上清液于試管中備用。在另一支試管中加入50m mol/L硼砂緩沖液1.4mL及纖維蛋白原溶液(Fibrinogen,購自Sigma,貨號為T8630,規(guī)格為IOOmg/支)0.4mL,在37°C的恒溫水浴鍋中加熱5分鐘后,加入凝血酶(Thrombin,購自Sigma,貨號為T4648,規(guī)格為1000U/支)0.1mL,混勻。37°C水浴中保溫10分鐘，再加入0.1mL樣品溶液，混勻5秒鐘，保溫60分鐘，在保溫第20分鐘及第40分鐘時，分別取出振蕩。保溫結(jié)束后，往試管中加入200m mol/L三氯乙酸2mL,再放入水浴鍋保溫20分鐘，15000r/min離心5分鐘。取上清液在275nm處測定吸光值。加入相同量的滅活的酶液作空白對照，空白對照的處理方法與樣品的處理方法一樣。每組均設(shè)3個平行樣品，最終測定結(jié)果為3個測定值的平均值。
[0083]納豆激酶的酶活單位定義為:在37°C，pH為8.5的硼砂緩沖液中每分解Img的纖維蛋白所需要的酶量為一個酶活力單位IU。
[0084]測試結(jié)果如表1所示，誘導(dǎo)發(fā)酵96小時后，GSPNK, GS2PNK和GS2PNK-H重組菌株的搖瓶發(fā)酵液的平均酶活分別可達180，230及470IU/mL (以尿激酶為測量標準)，說明拷貝數(shù)的增加顯著提高了納豆 激酶表達水平，在導(dǎo)入來源于釀酒酵母的Haclp調(diào)控因子基因后，酶活又進一步提升，證明了該能因子能夠使納豆激酶的分泌表達水平顯著得到加強。
[0085]表1不同重組酵母菌株的納豆激酶酶活(IU/ml)
【權(quán)利要求】
1.納豆激酶Pr0-NK基因的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將兩個以上的納豆激酶Pro-NK基因插入真核表達載體后得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納豆激酶Pro-NK基因的重組載體，其特征在于，每個納豆激酶Pro-NK基因處于一個與其相應(yīng)的啟動子之下表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納豆激酶Pro-NK基因的重組載體，其特征在于，所述啟動子為醇氧化酶I啟動子或甲醛脫氫酶啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納豆激酶Pro-NK基因的重組載體，其特征在于，每個納豆激酶Pro-NK基因處于一個與其相應(yīng)的醇氧化酶I啟動子之下表達，相鄰的納豆激酶Pro-NK基因之間依次串聯(lián)有醇氧化酶I終止子、醇氧化酶I啟動子與a -mating因子信號肽序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納豆激酶Pro-NK基因的重組載體，其特征在于，所述真核表達載體為PA0815表達載體；所述pA0815表達載體是通過將pPICZ α載體用SacI和EcoRI進行雙酶切得到的1000bp片段與同樣用SacI和EcoRI消化過的ρΑ0815載體連接所得。
6.一種高效分泌表達納豆激酶的重組菌，其同時含有兩個拷貝以上納豆激酶Pro-NK基因和Haclp調(diào)控因子基因的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效分泌表達納豆激酶的重組菌，其特征在于，所述納豆激酶Pro-NK基因是通過權(quán)利要求1所述的重組載體導(dǎo)入到巴斯德畢赤酵母菌中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效分泌表達納豆激酶的重組菌，其特征在于，所述Haclp調(diào)控因子基因是通過組成型表達載體導(dǎo)入到有兩個拷貝以上的納豆激酶Pro-NK基因的重組巴斯德畢赤酵母菌中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高效分泌表達納豆激酶的重組菌，其特征在于，所述組成型表達載體為組成型表達載體pGAPZ-Haclp，該組成型表達載體是通過將Haclp調(diào)控因子基因插入到pGAPZA載體中構(gòu)建而得。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效分泌表達納豆激酶的重組菌，其特征在于，所述Haclp調(diào)控因子基因來源于酵母或霉菌。
【文檔編號】C12N15/81GK103937830SQ201410109952
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】朱泰承, 孫紅兵, 李鵬飛, 李寅, 鄧啟華, 沈建國, 陸英, 林智平, 賈鳳超 申請人:北京燕京啤酒股份有限公司, 中國科學(xué)院微生物研究所