一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法

一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，以枯草芽孢桿菌表達(dá)通過(guò)易錯(cuò)PCR或定點(diǎn)飽和突變改造的L-氨基酸脫氨酶基因，提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率，L-氨基酸脫氨酶基因基因序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。此提高了轉(zhuǎn)化率的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的建立，解決了化學(xué)法合成α-酮戊二酸的步驟繁瑣、得率低、污染環(huán)境等問(wèn)題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了無(wú)污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn)α-酮戊二酸，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】—種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法，特別是一種通過(guò)易錯(cuò)PCR和定點(diǎn)飽和突變改造L-氨基酸脫氨酶基因，提高了重組枯草芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率。
【背景技術(shù)】
[0002]α -酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的重要中間體，對(duì)于協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)碳代謝和氮代謝發(fā)揮重要作用。α -苯丙酮酸有很多應(yīng)用，可用來(lái)合成抗腫瘤藥物的雜環(huán)化合物，可作為抗氧化劑及促進(jìn)傷口愈合。在生物醫(yī)學(xué)診斷中，α-酮戊二酸可作為酮戊二酸脫氫酶，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的底物。α -酮戊二酸可作為合成聚乙烯的原材料，這種聚合物具有生物降解能力。傳統(tǒng)α-酮戊二酸生產(chǎn)采用化學(xué)法，化學(xué)法的主要缺點(diǎn)是缺乏選擇性，采用有毒的氰化物及金屬銅，產(chǎn)率低，且污染環(huán)境。酶和全細(xì)胞生物催化劑越來(lái)越多的用于工業(yè)化生產(chǎn)。[0003]L-氨基酸脫氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脫氨基，生成相應(yīng)α -酮酸和氨，多為黃素蛋白，二聚體結(jié)構(gòu)。L-氨基酸脫氨酶主要存在于蛇毒和昆蟲毒素中，在細(xì)菌、真菌、藻類中也存在。蛇毒氨基酸脫氨酶是研究最好的脫氨酶，但是價(jià)格昂貴，難以大規(guī)模使用。P.mirabilisKCTC2566有兩種L-氨基酸脫氨酶，一種具有廣泛的底物特異性，能夠催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其對(duì)L-苯丙氨酸具有較高催化活性；另一種具有底物限制性，只對(duì)堿性氨基酸具有催化活性，尤其是L-組氨酸。大部分細(xì)菌L-氨基酸脫氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中兩種L-氨基酸脫氨酶都是膜蛋白。
[0004]定向進(jìn)化已被廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系及提高酶的特征。理性及半理性蛋白質(zhì)工程已用于提高酶的特性，比如對(duì)映選擇性、活性或穩(wěn)定性。通過(guò)定點(diǎn)飽和突變或迭代突變對(duì)這些突變位點(diǎn)進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高酶的特性。
[0005]全細(xì)胞轉(zhuǎn)化相比分離酶具有如下優(yōu)勢(shì):全細(xì)胞生物催化劑更容易制備，成本低；比分離酶更穩(wěn)定，不易受環(huán)境溫度、PH等因素影響，使用方便；轉(zhuǎn)化過(guò)程中不產(chǎn)生有毒害產(chǎn)品，不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物。有望實(shí)現(xiàn)低能耗、高效率、高純度、無(wú)污染的工業(yè)化PPA生產(chǎn)。之前的研究中我們已經(jīng)成功構(gòu)建了枯草芽孢桿菌全細(xì)胞催化劑，表達(dá)來(lái)源于P.mirabilisKCTC2566的脫氨酶，轉(zhuǎn)化率為26%，轉(zhuǎn)化效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高效生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，是將來(lái)源于P.mirabilisKCTC2566的第二種脫氨酶基因進(jìn)行易錯(cuò)PCR或定點(diǎn)飽和突變改造，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌構(gòu)建全細(xì)胞催化劑，以此菌株高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α -酮戊二酸，從而解決了工業(yè)化α -酮戊二酸生產(chǎn)高成本、低得率、污染嚴(yán)重的問(wèn)題。
[0007]所涉及到的微生物有:P.mirabilis KCTC2566、Ε.coli JM109、B.subtilisl68。
[0008]所述L-氨基酸脫氨酶基因(pml)的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增方法為:以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-pml為模板,Mutazyme II DNA polymerase低保真酶擴(kuò)增pml基因。PCR產(chǎn)物純化、酶切后，與載體pET-20b (+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109構(gòu)建突變體文庫(kù)。挑取氨芐抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落接種到LB，在96孔板中37°C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，接種到另一塊96孔板的TB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)5h。
[0009]所述L-氨基酸脫氨酶基因(pml)的定點(diǎn)突變方法為:以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-pml為模板，Prime-STAR HS DNA polymerase高保真酶及設(shè)計(jì)的突變引物一步法擴(kuò)增，DpnI限制性內(nèi)切酶消化模板DNA，然后磷酸化，連接為全質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168。
[0010]通過(guò)易錯(cuò)PCR或定點(diǎn)飽和突變改造獲得的L-氨基酸脫氨酶基因序列如SEQ IDN0.1所示或SEQ ID N0.2所示。
[0011]SEQ ID N0.1
[0012]ATGGCAATAAGTAGAAGAAAATTTATTCTTGGTGGCACAGTGGTTGCTGTTGCTGCAGGCGCTGGGGTTTTAACACCTATGTTAACGCGAGAAGGGCGTTTTGTTCCTGGTACGCCGAGACATGGTTTTGTTGAGGGAACTGGCGGTCCATTACCGAAACAAGATGATGTTGTTGTAATTGGTGCGGGTATTTTAGGTATCATGACCGCGATTAACCTTGCTGAGCGTGGCTTATCTGTCACAATCGTTGAAAAAGGAAATATTGCCGGCGAACAATCATCTCGATTCTATGGTCAAGCTATTAGCTATAAAATGCCAGATGAAACCATCTTATTACATCACCTCGGGAAGCACCGCTGGCGTGAGATGAACGCTAAAGTTGGTATTGATACCACTTATCGTACACAAGGTCGTGTAGAAGTTCCTTTAGATGAAGAAGATTTAGAAAACGTAAGAAAATGGATTGATGCTAAAAGCAAAGATGTTGGCTCAGACATTCCATTTAGAACAAAAATGATTGAAGGCGCTGAGTTAAAACAGCGTTTACGTGGCGCTACCACTGATTGGAAAATTGCTGGTTTCGAAGAAGACTCAGGAAGCTTCGATCCTGAAGTTGCGACTTTTGTGATGGCAGAATATGCCAAAAAAATGGGTATCAAAATTTTCACAAACTGTGCAGCCTTTGGTTTAGAAACGCAAGCTGGTGTTATTTCTGATGTTGTAACAGAAAAAGGACCAATTAAACTCTCTCGTGTTGTTGTCCGCGGTGGTGTTGGGTCACGTTTATTTATGCAGAACCTAAATGTTGATGTACCAACATTACCTGCTTATCAATCACAGCAATTAATTAGCGCAGCACCAAATGCGCCAGGTGGAAACGTTGCTTTACCCGGCGGAATTTTCTTTCGTGATCAAGCGGATGGAACGTATGCAACTTCTCCTCGTGTCATTGTTGCTCCGGTAGTAAAAGAATCATTTACTTACGGCTATAAATATTTACCTCTGCTGGCTTTACCTGATTTCCCAGTACATATTTCGTTAAATGATCAGTTGGCTAATTCCTTTATGCAATCAACACATTGGGATCTTAATGAAGAGTCGCCATTTGAAAAATATCGTGATATGACCGCTCTGCCTGATCTGCCAGAATTAAATGCCTCACTGGAAAAACTGAAAAAAGAGTTCCCAGC
[0013]SEQID N0.2
[0014]ATGGCAATAAGTAGAAGAAAATTTATTCTTGGTGGCACAGTGGTTGCTGTTGCTGCAGGCGCTGGGGTTTTAACACCTATGTTAACGCGAGAAGGGCGTTTTGTTCCTGGTACGCCGAGACATGGTTTTGTTGAGGGAACTGGCGGTCCATTACCGAAACAAGATGATGTTGTTGTAATTGGTGCGGGTATTTTAGGTATCATGACCGCGATTAACCTTGCTGAGCGTGGCTTATCTGTCACAATCGTTGAAAAAGGAAATATTGCCGGCGAACAATCATCTCGATTCTATGGTCAAGCTATTAGCTATAAAATGCCAGATGAAACCATCTTATTACATCACCTCGGGAAGCACCGCTGGCGTGAGATGAACGCTAAAGTTGGTATTGATACCACTTATCGTACACAAGGTCGTGTAGAAGTTCCTTTAGATGAAGAAGATTTAGAAAACGTAAGAAAATGGATTGATGCTAAAAGCAAAGATGTTGGCTCAGACATTCCATTTAGAACAAAAATGATTGAAGGCGCTGAGTTAAAACAGCGTTTACGTGGCGCTACCACTGATTGGAAAATTGCTGGTTTCGAAGAAGACTCAGGAAGCTTCGATCCTGAAGTTGCGACTTTTGTGATGGCAGAATATGCCAAAAAAATGGGTATCAAAATTTTCACAAACTGTGCAGCCTGCGGTTTAGAAACGCAAGCTGGTGTTATTTCTGATGTTGTAACAGAAAAAGGACCAATTAAATCTTCTCGTGTTGTTGTCACCGGTGGTGTTGGGTCACGTTTATTTATGCAGAACCTAAATGTTGATGTACCAACATTACCTGCTTATCAATCACAGCAATTAATTAGCGCAGCACCAAATGCGCCAGGTGGAAACGTTGCTTTACCCGGCGGAATTTTCTTTCGTGATCAAGCGGATGGAACGTATGCAACTTCTCCTCGTGTCATTGTTGCTCCGGTAGTAAAAGAATCATTTACTTACGGCTATAAA
TATTTACCTCTGCTGGCTTTACCTGATTTCCCAGTACATATTTCGTTAAATGATCAGTTGGCTAATTCCTTTATGCA
ATCAACACATTGGGATCTTAATGAAGAGTCGCCATTTGAAAAATATCGTGATATGACCGCTCTGCCTGATCTGCCAG
AATTAAATGCCTCACTGGAAAAACTGAAAAAAGAGTTCCCAGCATTTAAAGAATCAACGTTAATTGATCAGTGGAGT
GGTGCGATGGCGATTGCACCAGATGAAAACCCAATTATCTCTGATGTTAAAGAGTATCCAGGTCTAGTTATTAATAC
TGCAACAGGTTGGGGAATGACTGAAAGCCCTGTATCAGCAGAAATTACAGCAGATTTATTATTAGGCAAAAAACCAG
TATTAGATGCCAAACCATTTAGTCTGTATCGTTTCTAA
[0015]改造獲得的L-氨基酸脫氨酶基因編碼突變體為F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T 或 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
[0016]所述微生物菌株的種子培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCllg,自來(lái)水定容至100mL。發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加IOOmL滅菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，終體積為IOOmL,高壓滅菌)。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明成功實(shí)現(xiàn)了 P.mirabilis中L-氨基酸脫氨酶的改造，提高了利用枯草芽孢桿菌重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率。得到的易錯(cuò)PCR突變體為Fl 10I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α -酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率為59.72%，定點(diǎn)飽和突變得到的突變體F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/Ι351Τ，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率為85.25%。此提高了轉(zhuǎn)化率的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的建立，解決了化學(xué)法合成α -酮戊二酸的步驟繁瑣、得率低、污染環(huán)境等問(wèn)題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了無(wú)污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn)α -酮戊二酸，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]材料與方法
[0019]種子培養(yǎng)基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,自來(lái)水定容至100mL。
[0020]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到 60°C，再加 IOOmL 滅菌的 17mmol/L KH2PO4 和 72mmol/LK2HP04 的溶液。
[0021]α-酮戊二酸含量測(cè)定:將轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行離心，棄上清，離心向細(xì)胞中加入50 μ IL-谷氨酸(IOOmM)，30min后，加入45 μ I三氯乙酸(20%)，室溫放置30min，終止反應(yīng)。加入20yL DNP (20mM)，室溫放置15min，加入400 μ L NaOH (0.8Μ)終止反應(yīng)。離心，取上清，酶標(biāo)儀測(cè)定520nm的吸光度。
[0022]實(shí)施例1易錯(cuò)PCR對(duì)L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行改造
[0023]以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-pml [I]為模板,Mutazyme II DNA polymerase低保真酶擴(kuò)增pml基因。PCR產(chǎn)物純化、酶切后，與載體pET-20b(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109構(gòu)建突變體文庫(kù)。挑取氨芐抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落接種到LB，在96孔板中37°C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，接種到另一塊96孔板的TB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)5h。進(jìn)行篩選后，對(duì)酶活高的菌株提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化B.subtilisl68，構(gòu)建全細(xì)胞催化劑，進(jìn)一步測(cè)試轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率高的菌株，提取質(zhì)粒，作為下一輪易錯(cuò)PCR的模板。經(jīng)過(guò)三輪易錯(cuò)PCR得到了轉(zhuǎn)化率較高的突變體
[0024]F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T。[0025][l]Hossain GS, Li J, Shin H-d, Chen RR, Du G, Liu L, Chen J.Bioconversion ofL-glutamic acid to a-ketoglutaric acid by an immobilized whole-cell biocatalystexpressing L—amino acid deaminase from Proteus mirabilis.J Biotechnol2013.[0026]實(shí)施例2定點(diǎn)突變對(duì)L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行改造
[0027]對(duì)實(shí)施例1得到的突變位點(diǎn)逐個(gè)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-pml為模板，Prime-STAR HS DNA polymerase高保真酶及設(shè)計(jì)的突變引物一步法擴(kuò)增，DpnI限制性內(nèi)切酶消化模板DNA，然后磷酸化，連接為全質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168。每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)量最高的突變體為:F110I，A255T，E31D，R228C，L249S，I351T。將這幾個(gè)突變位點(diǎn)組合在一起，構(gòu)建 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
[0028]實(shí)施例3全細(xì)胞催化劑的制備及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程
[0029]實(shí)施例1和實(shí)施例2的重組枯草芽孢桿菌168接種種子培養(yǎng)基(氯霉素IOmg/L)，37°C，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)。發(fā)酵在3L NBS發(fā)酵罐中進(jìn)行，1%接種量到1.8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和溫度分別為400rpm、l.0vvm和28。。，當(dāng)OD600達(dá)到0.6，加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)L-氨基酸脫氨酶表達(dá)。誘導(dǎo)5h后，8，OOOrpm低溫離心10min，收集菌體，用20mMTris-HCl (pH8.0)緩沖液洗兩遍菌體。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為:L_谷氨酸15g/L，全細(xì)胞催化劑20.0g/L,反應(yīng)在 20mMTris-HCl (pH8.0)中進(jìn)行，37°C，200rpm 轉(zhuǎn)化 24h。
[0030]F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn) α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率為59.72%，定點(diǎn)飽和突變得到的突變體F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α -酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率為85.25%。
[0031]雖然本發(fā)明已 以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其特征在于以枯草芽孢桿菌表達(dá)通過(guò)易錯(cuò)PCR或定點(diǎn)飽和突變改造的L-氨基酸脫氨酶基因，提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述枯草芽孢桿菌為168。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述L-氨基酸脫氨酶基因基因序列如SEQ ID N0.1 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述L-氨基酸脫氨酶基因基因序列如SEQ ID N0.2 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述易錯(cuò)PCR方法:使用MutazymeIIDNApolymerase低保真酶擴(kuò)增L-氨基酸脫氨酶基因，產(chǎn)生隨機(jī)突變，克隆到表達(dá)載體pET20b+，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109進(jìn)行篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述定點(diǎn)飽和突變方法:使用Prime-STARHS DNA polymerase高保真酶及設(shè)計(jì)的突變引物一步法擴(kuò)增,然后磷酸化及自連接為全質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述改造的脫氨酶基因編碼突變體為F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述改造的脫氨酶基因編碼突變體為F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103911400SQ201410132063
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 劉龍, 堵國(guó)成, 李江華, 嘎子·侯賽因, 侯穎 申請(qǐng)人:江南大學(xué)