一種重組畢赤酵母工程菌和代謝的重組木聚糖酶及其制備方法

一種重組畢赤酵母工程菌和代謝的重組木聚糖酶及其制備方法
【專利摘要】本發明公開一種重組畢赤酵母工程菌和代謝的重組木聚糖酶及其制備，通過人工合成編碼的瘤胃厭氧真菌Neocallimastix?frontalis木聚糖酶基因Xyn11B優化的核苷酸序列Xyn11Bm，構建重組酵母表達載體pPIC9K-Xyn11Bm，轉化宿主細胞畢赤酵母GS115獲得重組基因工程菌巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）GS115/pPIC9K-Xyn11Bm?CGMCC?No.9398，并在酵母細胞中表達重組Xyn11Bm基因，進而經過純化代謝高酶活表達的重組木聚糖酶，對于用于非治療目的降解木聚糖的應用，具有廣泛的應用價值。
【專利說明】一種重組畢赤酵母工程菌和代謝的重組木聚糖酶及其制備

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物基因工程及酶工程的【技術領域】。具體的說，本發明涉及一種重組畢赤酵母工程菌和代謝的重組木聚糖酶及其制備【技術領域】。

【背景技術】
[0002]木聚糖是由多個吡喃木糖基通過β_1，3或β_1，4木糖苷鍵連接而成的多聚分子，其支鏈由乙酰基、L-阿拉伯糖殘基、4-甲基-D-葡糖醛酸等取代基構成，是植物半纖維素的主要成分之一(周晨妍，鄔敏辰.木聚糖酶的酶學特性與分子生物學.生物技術，2005，15(3): 89-92 -,Biely P.Microbial xylanolytic systems.Trends inB1technology, 1985，3(11): 286-290)。木聚糖的降解需要木聚糖酶的作用，木聚糖水解酶系主要包括主鏈上的水解酶P-D-l，4內切木聚糖酶(EC 3.2.1.8，簡稱木聚糖酶)、β-D-l，4外切木糖苷酶和側鏈上的水解酶a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等，這些酶中，木聚糖酶對木聚糖降解起主要作用(范志恒，李鸝.體外模擬消化研究不同來源木聚糖酶對麩皮降解的影響.飼料廣角，2011，(2): 33-34)。
[0003]由于木聚糖酶降解木聚糖纖維的作用，使得木聚糖酶在許多行業領域都有了很重要的應用:在造紙工業上，可以用于漂白紙漿、減少環境污染；在食品行業中，可以用來生產功能性低聚木糖、烘烤食品的發酵處理、釀酒澄清等；在飼料領域上:可以作為飼料添加劑加入飼料，消除飼料里木聚糖的抗營養作用，提高飼料的利用率及營養價值；在能源方面，可以降解木聚糖得到木單糖，進一步用木糖發酵生產燃料乙醇；在醫藥行業中，木聚糖經木聚糖酶降解的木單糖或二糖可以和其它物質共同使用延緩藥物成分的釋放。
[0004]目前，市售木聚糖酶主要來源于可培養的環境微生物，如白腐真菌、里氏木霉、黑曲霉、類芽孢桿菌等(李天歌，岳曉禹，李自剛，等.白腐真菌產木聚糖酶降解半纖維素及改善腸道微生態平衡作用.食品科學，2013，(17): 313-316;鄭麗麗，盛占武，韓冰瑩，等.不同誘變方法對黑曲霉產木聚糖酶能力的影響.生物技術通報，2013，(12):146-150;蔡少麗，楊章萍，黃建忠.里氏木霉木聚糖酶的分離純化及酶學性質.食品與發酵工業，2013，39(8): 113-118;包怡紅，李雪龍.木聚糖酶產生菌一類芽孢桿菌的篩選及其酶學性質研究.中國食品學報，2008，(2): 36-41)。普遍認為，可培養微生物只占自然界微生物的1%，那么剩余的99%的不可培養的微生物中蘊藏著大量的木聚糖酶資源，其中很可能存在高活力的木聚糖酶。反芻動物瘤胃是一個降解植物纖維的高效厭氧發酵罐，存在大量不可培養的微生物，包括細菌、真菌和原蟲等。瘤胃微生物通過產生纖維素酶和半纖維素酶來降解植物纖維，并未宿主提供能源。到目前為止，人們對來源于反芻動物瘤胃微生物木聚糖酶基因資源的研究寥寥無幾。
[0005]Xue (1993)在專利 W093/25671 中描述了從瘤胃厭氧真菌 Neocallimastixpatriciarum中分離木聚糖酶基因以及基因表達的方法，該木聚糖基因在大腸桿菌中表達的水平最高為672U/mg;經截短表達后，其中的一個克隆表達的木聚糖酶活力達到I 229U/mg ο Geoffrey et al (1993)則在 W093/25693 中記載了從瘤胃厭氧真菌 patriciarum中分離木聚糖酶基因XynA的過程，在大腸桿菌中表達后，純化的木聚糖酶比活力達到5980U/mg。雖然重組木聚糖酶的活力較原始出發菌有較大提高，但要用于工業化生產仍然還有一定距離。
[0006]提高外源基因在宿主中的表達的途徑之一是對外源基因的密碼子進行優化。當外源基因中含有稀有密碼子時將嚴重制約其在宿主中的表達(5&W77 P M Tuohy TMF,Mosurski K R.Codon usage in yeast: Cluster analysis clearly differentiateshighly and lowly expressed genes.Nucleic Acids Research, 1986， 14(13):51255143;黃光瑞，田麗春，黃生平，等.密碼子優化的植酸酶基因appA-P在畢赤酵母中的高效表達.湖北大學學報:自然科學版，2007，29(3):290 - 293)。通過對外源基因密碼子優化后，大量外源基因在畢赤酵母中得到了高水平表達。如纖維素酶基因優化后酶活?生提高 1.24 fp iAkcapinar G B，Gul O，Sezerman U.Effect of codon optimizat1non the express1n of Trichodertm reesei endoglucanase I in Pichia pas tori s.B1technology Progress, 2011, 27(5): 1257-1263)。外切葡聚糖酶基因優化后表達水平提高了 17% (李國慶，范松，裴建軍，等.黑曲霉外切葡聚糖酶基因密碼子的優化及表達.南京林業大學學報:自然科學版，2012，36(4):84 - 88)。
[0007]目前對密碼子的優化主要限于根據畢赤酵母對密碼子的偏愛性對密碼子進行替換，大部分的密碼子優化工具和軟件也是基于上述原理而設計的。通過上述方法，一些基因的表達水平得到提高。然而，要使外源基因得到高水平的表達，僅僅依靠上述優化是不夠的，更多地考慮了基因的GC百分比、mRNA 二級結構最低自由能、限制性內切酶識別位點、mRNA隱蔽剪接位點等。而這些在目前的基因優化中并沒有得到充分考慮。


【發明內容】

[0008] 針對國內外現有已有木聚糖酶及其基因被提純或克隆技術水平普遍存在木聚糖酶酶活不高的現狀，能夠提供滿足工業生產用基因工程菌木聚糖酶的研究較少，至今還未有穩定的木聚糖酶的基因實現高水平的超量表達。本發明旨在于提供一種重組畢赤酵母工程菌和代謝的重組木聚糖酶及其制備的技術方案，根據酵母對密碼子的偏愛性、基因的GC百分比、mRNA 二級結構最低自由能、限制性內切酶識別位點、mRNA隱蔽剪接位點等對來源于反會動物瘤胃厭氧真菌frontalis木聚糖酶基因XynllB進行密碼子的不斷調整和優化，并通過人工合成優化后的核苷酸序列，構建重組酵母表達載體，轉化宿主細胞畢赤酵母獲得重組菌株，進而經過純化代謝高酶活表達的重組木聚糖酶，對于用于非治療目的降解木聚糖的應用，具有廣泛的應用價值。
[0009]本發明的技術方案:
通過人工合成編碼的瘤胃厭氧真菌AfeocaJJifflasiij: frontalis木聚糖酶基因XynllB優化的核苷酸序列7汝?，構建重組酵母表達載體pPIC9K-1>/?77汝?，轉化宿主細胞畢赤酵母獲得重組基因工程菌GS115/pPIC9K-XynllBm，并在酵母細胞中表達重組基因，進而經過純化代謝高酶活表達的重組木聚糖酶，對于用于非治療目的降解木聚糖的應用，具有廣泛的應用價值。
[0010]本發明提供了產木聚糖酶的一種高比活性木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-XynllBm及其獲得該基因工程菌代謝表達產物木聚糖酶的生產方法:本發明具體提供的能穩定高表達木聚糖酶的基因工程菌編號為GS115/pPIC9K-XynllBm。本發明根據酵母對密碼子的偏愛性、基因的GC百分比、mRNA 二級結構最低自由能、限制性內切酶識別位點、mRNA隱蔽剪接位點等，采用人工合成源于瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因XynllB優化的核苷酸序列XynllBm,通過構建重組酵母表達載體pPIC9K-XynllBm，轉化畢赤酵母GSl 15獲得基因工程菌株GSl 15/pPIC9K-XynllBm，并進行發酵生產，這是一條提高木聚糖酶的高酶活表達的有效途徑。
[0011]本發明具體提供了一種產木聚糖酶高比活性木聚糖酶的基因工程菌-巴斯德畢赤酵母 CPicAia pastoriS^) CGMCC N0.9398。
[0012]本發明還提供了獲得這種高比活性木聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母{Pichia pastoris^ CGMCC N0.9398的生產方法，該方法已具備規模工業化生產能力。
[0013]同時，本發明提供了高比活性木聚糖酶的基因工程菌基因序列是一種源于人工合成編碼的瘤胃厭氧真菌frontalis木聚糖酶基因XynllB優化的核苷酸序列，命名為XynllBm，長度為1014bp，序列如SEQ ID N0:1所示。
[0014]本發明提供一種能在畢赤酵母中高效表達的產木聚糖酶基因序列SEQ ID NO:1，此序列是在SEQ ID NO:2序列基礎上優化而成，所編碼的氨基酸密碼子可以在巴斯德畢赤酵母中有效表達，該人工合成的DNA共編碼337個氨基酸殘基，氨基酸殘基排列順序如SEQ ID N0.3 所示。
[0015]具體地，本發明提供了一種高比活性木聚糖酶的基因工程菌菌株，編號為GS115/pPIC9K-XynllBm。根據酵母對密碼子的偏愛性、基因的GC百分比、mRNA 二級結構最低自由能、限制性內切酶識別位點、mRNA隱蔽剪接位點等對來源于反芻動物瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因XynllB進行密碼子調整和優化,通過人工合成方法獲得木聚糖酶基因XynlIBm，并將其克隆到表達載體pPIC9K_XynllBm上，獲得基因工程菌株GS115/pPIC9K-XynllBm，經微生物學鑒定，屬于高比活性木聚糖酶的巴斯德畢赤酵母工程菌巴斯德畢赤酵母 CPicAia pas tori s ) GS115/pPIC9K_XynllBm。
[0016]本發明提供菌株GS115/pPIC9K_XynllBm已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期是2014年6月30日，保藏號是CGMCC N0.9398。經微生物學鑒定為巴斯德畢赤酵母iPichia pastoris)。該菌株能在YPD培養基表面生長，菌落呈白色，突起于培養基表面，菌落表面濕潤，有油脂光澤。該菌種可在28-32°C及pH 4.5-8.5范圍內均可生長。該菌種能表達高比活性木聚糖酶，獲得重組木聚糖酶XynllBm的最適反應溫度為50°C，最適反應pH為5.0，比活力為7780.8U/mg。該酶在pH4.0~10.6之間具有較好的穩定性，耐酸堿性較強。XynllBm可以水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖，但不水解地衣多糖和大麥β -葡聚糖。
[0017]同時，本發明提供了一種獲得高比活性木聚糖酶的基因工程菌菌株的技術方案。具體的獲得高表達木聚糖酶的基因工程菌菌株工藝步驟如下:
(I)根據酵母密碼子偏愛性對XynllB的密碼子進行初步替換。
[0018](2)采用Oligo 6.0分析替換后基因序列中的限制性內切酶切割位點，通過密碼子調整，消除基因序列中的Bgl Il.Sac 1、Sal I, EcoR I和Not I的切割位點。
[0019](3)采用B1Edit 7.0分析調整后基因序列中mRNA隱蔽剪接位點，并再次對密碼子進行調整，以消除其中的隱蔽剪接位點GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、PolyT和PolyA。并計算GC百分比，再根據GC百分比對密碼子最進一步調整，使其處于40-50%之間。
[0020](4)采用RNA Structure 3.2對mRNA 二級結構的自由能進行分析，篩選獲得自由能最低的基因序列SEQ ID N0.1，并命名為XynllBm。
[0021](5)采用全基因合成方法獲得SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
[0022](6)構建含有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的重組載體pPIC9K_XynllBm。
[0023](7)將重組載體pPIC9K_XynllBm轉化宿主細胞畢赤酵母GS115，獲得重組菌株GS115/pPIC9K-XynllBm,并在酵母細胞中表達重組XynllBm基因。
[0024]以及，本發明根據上述提供的獲得高比活性木聚糖酶的基因工程菌菌株純化所表達的木聚糖酶XynllBm。該酶蛋白分子的理論等電點PI為6.82，分子量為36.7KD。經檢測，表達的重組木聚糖酶XynllBm在搖瓶中表達84h時，酶活性達到4874.8 U/mL。經1L發酵罐高密度發酵，超濾濃縮后發酵液酶活性最高可達30838 U/mL,與現有技術記載的水平相比有明顯提高。
[0025]進一步，本發明還提供能將高效表達的產木聚糖酶基因分泌表達到酵母細胞外的重組表達載體pPIC9K_XynllBm。
[0026]本發明所述的獲得高比活性木聚糖酶的基因分泌表達到酵母細胞外的重組載體pPIC9K-XynllBm，本發明將合成的XynllBm基因和畢赤酵母表達載體pPIC9K用EcoRI和Not I雙酶切，回收純化酶切產物。純化的目的基因和表達載體采用T4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌DH5 α，經菌落PCR和限制性內切酶鑒定獲得重組表達載體pPIC9K-XynllBm。
[0027]本發明還提供高比活性木聚糖酶的基因工程菌的篩選方法。
[0028](I)用無菌牙簽挑取單菌落有25ml BMGY培養基的三角瓶中，250rpm，30°C，培養24h，使 OD6tltl 介于 3-5。
[0029](2)取上述菌液接種于50ml BMGY培養基的三角瓶中，250rpm，30°C，培養24h，使0D600 介于 3-5。
[0030](3)將(2)中菌液用20ml離心管中，3000rpm離心10min，離心收集菌體。
[0031](4)棄上清，用BMMY培養基重懸菌體，使0D600為I左右，250rpm，30°C，培養至96h。
[0032](5)每24h添加甲醇,維持終濃度0.5%,并且每12h取5ml樣品，于12000rpm離心5min,收集上清和沉淀,并且記錄其OD值。
[0033](6)在最佳試驗條件下，參照GB/T 23874-2009測定上清液中木聚糖酶的活性。
[0034]本發明還提供了一種純化所表達的葡聚糖酶XynllBm的方法。
[0035](I)發酵產物經離心后，取6ml上清加入超濾離心管Vivaspin 6中，放入低溫高速離心機4°C、12000rpm離心，直到上清超濾濃縮至Iml為止。
[0036](2)濃縮上清經G-75葡聚糖凝膠進行層析純化，采用部分收集器對洗脫組分進行收集，采用PH5.0的0.2M磷酸氫二鈉/0.1M檸檬酸緩沖液作為洗脫液。調節適合的流速，每個收集管處停留I min，每管取2μ I樣品采用Infinite M2000于280 nm處測定吸光度，直至0D280回至基線后停止收集。根據0D280值將處于同一吸收峰的樣品進行合并，并測定合并樣品的酶活力。
[0037]純化后重組木聚糖酶XynllBm的最適反應溫度為50°C，最適反應pH為5.0,比活力為7 780.8U/mg。該酶在pH4.0~10.6之間具有較好的穩定性，耐酸堿性較強。XynllBm可以水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖，但不水解地衣多糖和大麥β -葡聚糖，具有廣泛的應用價值。
[0038]本發明具體提供上述優化的厭氧真菌木聚糖酶用于非治療目的降解木聚糖的應用。
[0039]通過實施本發明具體的技術指標，實現本
【發明內容】
，可以達到以下有益效果。
[0040](I)本發明提供了一種高比活性木聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母
GS115/pPIC9K-XynllBm CGMCC N0.9398。
[0041](2)本發明提供了獲得基因工程菌巴斯德畢赤酵母O0ZcAia pastoris) GSllh/pPIC9K-XynllBm CGMCC N0.9398高表達木聚糖酶的生產方法:本發明提供的反芻動物瘤胃厭氧真菌frontalis木聚糖酶基因XynllB優化核苷酸序列，長度為1014bp，序列如SEQ ID N0.1所示，命名為XynllBm。該人工合成的DNA共編碼337個氨基酸殘基，氨基酸殘基排列順序如SEQ ID N0.3所示。該酶蛋白分子的理論等電點PI為
6.82，分子量為36.7KD。經檢測，表達的重組木聚糖酶XynllBm在試搖瓶中表達84h時，酶活性達到4 874.8 U/mL。經1L發酵罐高密度發酵，超濾濃縮后發酵液酶活性最高可達30838 U/mL，與現有技術記載的水平相比有明顯提高。
[0042](3)本發明還提供了一種純化所表達的葡聚糖酶XynllBm的方法。純化后重組木聚糖酶XynlIBm的最適反應溫度為50°C，最適反應pH為5.0，比活力為7 780.8U/mg。該酶在pH4.0~10.6之間具有較好的穩定性，耐酸堿性較強。XynlIBm可以水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖，但不水解地衣多糖和大麥β -葡聚糖。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1顯示為瘤胃厭氧真菌木聚糖酶基因的優化前和優化后序列的比較圖。
[0044]圖2顯示為不同重組酵母菌株酶活性對比圖。
[0045]圖3顯示為重組畢赤酵母PCR鑒定電泳圖譜。
[0046]圖4顯示為平板剛果紅法鑒定XynllBm-12木聚糖酶活力圖。
[0047]圖5顯示為XynllBm-12在搖瓶水平酶活力變化曲線圖。
[0048]圖6顯示為XynllBm-12在1L發酵罐中菌體濕重、干重的變化圖。
[0049]圖7顯示為XynllBm-12培養上清的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0050]圖8顯示為XynllBm-12在發酵罐水平酶活力和比活力變化曲線圖。
[0051]圖9顯示為XynllBm的凝膠過濾層析過程中A28tl的吸光值。
[0052]圖10顯不為XynllBm的最適pH值和pH穩定性。
[0053]圖11顯示為XynllBm的最適反應溫度和溫度穩定性。
[0054]圖12顯示為XynllBm的底物特異性。

【具體實施方式】
[0055]下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。
[0056]主要試驗材料與試劑:分泌型表達載體pPIC9k及其宿主菌畢赤酵母OcYcAiapas tor is ) GS115，大腸桿菌DH5 α為本實驗室保存；限制性內切酶購自大連TaKaRa公司；培養基購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；木聚糖酶底物均購自Sigma公司；Sephadex G-75購自美國B1-Rad公司；超濾離心管Vivaspin 6購自Millipore公司；DNA純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。
[0057]培養基:
(I) YB)液體培養基:50g，加水定容到1000 mL，高壓120°C滅菌20 min待用。
[0058](2) YPD固體培養基:65g，加水定容到1000 mL，高壓120°C滅菌20 min待用。
[0059](3) 10XYNB:稱取 13.4g YNB 溶于 100mL 水中，過濾除菌。
[0060](4)誘導表達培養基BMGY:酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，高壓120°C滅菌20min，然后待溫度降至手可握溫度以后在超凈臺上加入 10XYNB 10mL(13.4 g/L), 500X 生物素 lmL(4X l(T4g/L)，甘油 1mL0
[0061](5)誘導表達培養基BMMY:酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，高壓120°C滅菌20min，然后待溫度降至手可握溫度以后在超凈臺上加入 10XYNB 10mL (13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL(4X l(T4g/L)，甲醇 5mL。
[0062](6)FM22 培養基(g/L):42.9g KH2P04,5.0g (NH4)2SO4,1.0g CaS04.2H20，14.3gK2SO4,11.7g MgS04*7H20,40.0g 甘油。
[0063](7)微量元素溶液 PMT4(g/L):2.0g CuSO4.5Η20，0.08g Nal，3.0g MnSO4.H20,0.2gNa2 MoO4.2Η20，0.02g H3BO3,0.5g CaSO4.2Η20，0.5g CoCl2,7.0g ZnCl2, 22.0g FeSO4.7Η20，
0.2g b1tin, ImL 濃硫酸，ImL FM22。
[0064]所用主要設備:
ECM399型電轉化儀(BTX公司)；高速冷凍離心機(SorvalI公司)；移液器(Eppendorf公司);凝膠成像儀(B1-Rad公司);pH儀和PL2002型電子天平(為梅特勒一托利多儀器有限公司)；GeneQuant型核酸蛋白檢測儀(Anersham B1sciences公司);GUJS_10L型全自動發酵罐(鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司)。
[0065]本發明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器、設備都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。
[0066]實施例一:高表達木聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母O0ZcAia pastoris^GS115/pPIC9K-XynllBm CGMCC N0.9398 的優化木聚糖酶基因 XynllBm 的獲得
在GenBank中檢索出Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因序列(登錄號:AY131336.1)，根據下述方法進行密碼子的調整和優化:
(I)根據酵母密碼子偏愛性對XynllB的密碼子進行初步替換。
[0067](2)采用Oligo 6.0分析替換后基因序列中的限制性內切酶切割位點，通過密碼子調整，消除基因序列中的Bgl Il.Sac 1、Sal I, EcoR I和Not I的切割位點。
[0068](3)采用B1Edit 7.0分析調整后基因序列中mRNA隱蔽剪接位點，并再次對密碼子進行調整 ，以消除其中的隱蔽剪接位點GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、PolyT和PolyA。并計算GC百分比，再根據GC百分比對密碼子最進一步調整，使其處于40-50%之間。
[0069](4)采用RNA Structure 3.2對mRNA 二級結構的自由能進行分析，篩選獲得自由能最低的基因序列SEQ ID N0.1，并命名為XynllBm。
[0070]經Jcat軟件計算，優化后的核苷酸序列相對優化度(CAI)由0.31提高到0.90，GC含量由44.1%下降到42.2%ο優化后的序列進行合成，DNA測序確認合成的序列為1014 bp,優化前后序列比對參見附圖1所示。優化后序列與優化前序列的相似性為85.07%。與優化前序列相比，優化后序列中共對121個氨基酸殘基的密碼子進行了優化，有151個核苷酸被替換。
[0071]實施例二:高表達木聚糖酶的基因工程菌巴斯德畢赤酵母O0ZcAia pastoris^GS115/pPIC9K-XynllBm CGMCC N0.9398 的構建
將合成的辦汝?基因和畢赤酵母表達載體PPIC9K用I和I雙酶切，回收純化酶切產物。純化的目的基因和表達載體采用Τ4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌DH5 α，經菌落PCR和限制性內切酶鑒定獲得重組表達載體pPIC9K-1>/?77汝?。采用Sal I對mC^-XynllBm線性化，電擊轉化畢赤酵母GS115感受態細胞。將轉化后的菌液涂布在MD平板上，于28~30°C培養48 h。挑選生長正常的菌落進行甲醇利用表型鑒定。對甲醇利用表型正確的克隆通過遺傳霉素G418硫酸鹽篩選獲得含高拷貝目的基因的重組酵母工程菌。通過G418硫酸的篩選，共獲得抗4 mg/mL的菌株共有7個。
[0072]實施例三:重組XynllBm畢赤酵母木聚糖酶活性初篩
將抗4 mg/mL遺傳霉素G418的7個菌株分別接種于含有5 mL BMGY培養基的50 mL試管中，29°C振蕩培養24 h后離心用BMMY培養基重懸，每24h加入甲醇使終點濃度保持在
0.5%，誘導培養48 h。培養結束后離心收集上清以燕麥木聚糖為底物測定酶活力。
[0073]7個菌株的酶活力參見附圖2所示。7個抗4 mg/mL遺傳霉素G418的菌株都具有木聚糖酶活力，其中最高的是12號(命名為XynllBm-12)，為2541U/mL。
[0074]實施例四:重組XynllBm畢赤酵母木聚糖酶的驗證和分子生物學功能驗證
取I mL菌液4000 rpm離心5 min ;棄上清,加入500 μ LPBS懸浮細胞,4000 rpm離心4 min;棄上清， 加100 μ L TE緩沖液懸浮；將上述懸濁液在沸水中煮10 min，然后_70°C冷凍30 min，最后再沸水煮10 min ；3000 rpm離心5 min，上清為酵母染色體DNA溶液。
[0075]將獲得的上清作為PCR的模板，按畢赤酵母表達載體PPIC9K的序列設計引物5’ A0X1 (5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)與 3’ -AOXl (5，-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)進行PCR 驗證。PCR 體系為 dNTP 2μ LUOXPCR Buffer 2.5yL、5，A0Xl 2yL、3，A0Xl 2 μ L、Taq 酶 I μ L、DNA 2 μ L、ddH20 13.5 yL，總體積 20 μ L。
[0076]PCR 反應條件為:95°C預變性 5 min ;然后 94°C，60 s、65°C，60 s、72°C，60 s 運行30 cycle ;最后72°C延伸5 min。5 μ L樣品點于1%瓊脂糖膠檢測。
[0077]由附圖3顯示,來源于木聚糖酶基因被整合到畢赤酵母GSl 15的染色體DNA中。
[0078]實施例五:重組XynllBm木聚糖酶活性的測定
采用DNS法測定木聚糖酶活力。取適當稀釋的酶液200 μ L，1.0%的樺木木聚糖400yL，于50°C反應5~10 min，立即加入I mL DNS，振蕩混勻后于95°C水浴5min顯色。冷卻后加入3.4 mL去離子水,振蕩混勻后于540 nm處測定吸光度。
[0079]同時，設置對照樣品，即取適當稀釋的酶液200 UL,DNS I mL，1.0%的樺木木聚糖400 μ L,于50°C反應5~10 min后于95°C水浴5min顯色。冷卻后加入3.4 mL去離子水，振蕩混勻后于540 nm處測定吸光度。參照GB/T 23874-2009測定木聚糖酶的活性。
[0080]實施例六:XynllBm_12在搖瓶水平條件下的表達
將XynllBm-12重組酵母菌種劃線接種于YPD固體培養基，29°C培養兩天至菌落出現。用無菌牙簽挑取單菌落有25mL BMGY培養基的三角瓶中，250rpm，30°C，培養24h。取上述菌液接種于50mL BMGY培養基的三角瓶中，250rpm，30°C，在培養24h ;菌液3000rpm離心lOmin，離心收集菌體。棄上清，用BMMY培養基重懸菌體，使(?6(|(|為I左右，250rpm，30°C，培養至96h ;每24h添加甲醇，維持終濃度0.5%，并且每12h取5mL樣品，于12000rpm離心5min,分別收集上清液。
[0081]取20ul上清液加入到含有0.5%樺木木聚糖的瓊脂平板的孔學中，37°C過夜培養，然后用0.1%剛果紅染色30min，再用lmol/L NaCl脫色30min以定性判斷酶活性。取各時間點收集的上清液，按照實施例4的方法測定各時間點樣品的酶活性。
[0082]平板剛果紅法定性判斷木聚糖酶活力的結果參見附圖4所示。宿主菌畢赤酵母GSl 15和轉化空載體pPIC9K的重組酵母培養上清液均未產生透明圈，而XynllBm-12的培養上清液產生明顯的透明圈，表明在搖瓶水平添加下，XynllBm-12可表達重組木聚糖酶。
[0083]隨誘導時間，酶活性的變化曲線參見附圖5所示。各時間點樣品的酶活性逐漸增加，到誘導后84h時，酶活性達到最大值，為4874.8U/mL。
[0084]實施例七:XynllBm-12在1L發酵罐中的高效表達
(I)種子液的準備:從_80°C冰箱中取菌種劃線方式接種于YPD固體培養板上，在培養箱中28°C培養2天直到菌落出現；挑取單菌落接種于5mL YH)培養基中30°C震蕩培養24h，然后接種于600mL YPD液體培養基中繼續培養24h。
[0085](2)發酵罐培養基的準備和酵罐滅菌:6L FM22培養基高壓滅菌后備用。按照自動機械攪拌不銹鋼發酵罐(GUJS-10C型)說明書上操作步驟來進行嚴格的發酵罐罐體及管道的滅菌。
[0086](3)發酵罐擴大培養:菌體生長階段:在發酵罐中加入6L FM22培養基，用Imol/L的KOH調至pH5.0 ;加入培養好的種子液。設置發酵罐參數:D0 35%，，通氣量1.25vvm,培養溫度28°C，罐壓0.05MPa, 500rpm攪拌培養20h。
[0087]添加甘油生長階段:流加甘油(50%，w/v)的速度15mL/L.h，持續4h，手動控制DO在30-35%之間。培養溫度28°C，罐壓0.05MPa，pH5.0，有泡沫時，可滴加1-2滴消泡劑。
[0088]誘導階段:發酵參數設置為800rpm，30°C，ρΗ5.0，60%>0D>35%，通氣量為>9 L/min。甲醇流加的初始速度為3.5mL/L*h (含4ml PMT4/L)，持續2_5h，使酵母菌適應甲醇碳源。在適應過程中，DO由100%穩定下降至40% (約需l-3h)，當DO穩定一定時間后又出現增長時，表明出現甲醇饑餓。當DO達到60%時，可增加甲醇流速。
[0089](4)樣品采集與分析:發酵罐試驗一共持續6天，每12h取樣I次，取樣時用酒精燈燒取樣口滅菌，而后用1mL離心管接取發酵液，立即放倒_80°C冰箱保存備用。
[0090]發酵物濕重、干重和上清蛋白含量的測定:用移液器準確吸取發酵液ImL20000 Xg離心10min，移去上清后稱量菌體沉淀質量，即為濕重。將上述盛有菌體沉淀的離心管放入烘箱中，于80°C烘干至恒重即為干重。以牛血清白蛋白為標準,采用Bradford法測定發酵上清液中的蛋白質含量。
[0091]SDS-PAGE分析:分別為誘導前、誘導后12、24、36、48、60、72、84和96h的濃縮培養上清進行SDS-PAGE電泳。
[0092]酶活性測定:取6mL上清液加入超濾離心管Vivaspin 6中于4°C、12000rpm離心，超濾濃縮至lmL。按照實施例4的方法測定各時間點樣品的酶活性。
[0093]XynllBm-12工程菌在1L發酵罐中菌體濕重和干重的變化趨勢參見附圖6所示。隨著誘導時間的增加，發酵液的菌體濕重和干重含量都在逐漸增加，并且在誘導96h時發酵液的菌體濕重和干重達到最大值216.70g/L和117.30g/L。
[0094]不同時間點樣品的SDS-PAGE結果參見附圖7所示，隨著誘導時間的延長培養上清中分子量介于44.30~29.00 KD有一條蛋白質條帶,接近XynllBm酶蛋白的理論分子量。
[0095]XynllBm-12工程菌在1L發酵罐中木聚糖酶的活性和比活性參見附圖8所示，在誘導96h之前，木聚糖酶活力和比活力都隨著隨著誘導時間的延長而不斷增加，誘導到第96h時濃縮發酵液中重組木聚糖酶的酶活力達到最高為30 838U/mL,比活力達到7780.8U/
mg ο
[0096]實施例八=XynllBm的純化
取適量充分膨脹的G-75葡聚糖凝膠裝柱，濃縮培養上清液經G-75葡聚糖凝膠進行層析純化，采用部分收集器對洗脫組分進行收集，采用PH5.0的0.2M磷酸氫二鈉/0.1M檸檬酸緩沖液作為洗脫液。調節適合的流速，每個收集管處停留I min，每管取2yL樣品采用Infinite M2000于280 nm處測定吸光度，直至A28tl回至基線后停止收集。根據A28tl值將處于同一吸收峰的樣品進行合并，并測定合并樣品的酶活力。
[0097]參見附圖9所示，層析后出現了 2個比較大的分離峰。其中木聚糖酶活力均集中在第一個峰中。
[0098]實施例九=XynllBm的酶學特性
(I)酶促反應最適pH及酶的pH穩定性
最適PH的測定:取適量純化后的酶液在50°C下，以樺木木聚糖為底物，分別在pH 2.2、
3、4、5、6、7、8、9、10和10.6條件下以樺木木聚糖為底物反應5min，通過測定酶活性判斷反應的最適pH。
[0099] pH穩定性測定:取適量純化后的酶液分別在pH值2.2、3、4、5、6、7、8、9、10和10.6的緩沖液中下保持30min后，在最適pH和最適溫度的條件下以樺木木聚糖為底物測定剩余酶活性。
[0100](2)酶促反應最適溫度及酶的熱穩定性
最適溫度的測定:取適量純化后的酶液，以PH5.0的緩沖液配制樺木木聚糖，分別于20、30、40、50、60、70、80和90 V反應5min，通過測定酶活性以確定反應的最適溫度。
[0101]熱穩定性測定:取適量純化后的酶液分別在30、40、50、60、70和80°C下保持30min后，在最適pH和最適溫度的條件下以樺木木聚糖為底物測定剩余酶活性。
[0102]參見附圖10所示，XynllBm的最適反應pH為5.0,并且在pH 6.0^10.6條件下也有比較高的活力，在10.6時相對酶活性為96.95%。XynllBm酶在pH 4.0~8.0的條件下具有較好的穩定性 ，剩余的活力在80%以上，在更低或更高的pH條件下也有最低40%的剩余酶活，具有較強的耐酸堿性。
[0103]參見附圖11所示，XynllBm的最適反應溫度為50°C。但溫度穩定性表明該酶對溫度的穩定性較差。
[0104]實施例十=XynllBm的底物特異性
取適量純化后XynllBm酶液，分別以1.0%的大麥β -葡聚糖、地衣多糖、燕麥木聚糖，樺木木聚糖和可溶性木聚糖4-0-Me-D-glucurono-D-xylan為底物在最適條件下測定XynllBm的酶活性。
[0105]如圖12所示，XynllBm可水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖4-0-Me-D-glucurono-D-xylan,不降解地衣多糖和大麥β -葡聚糖卻沒有任何的降解作用。
【權利要求】
1.一種高表達木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-XynllBm，該基因工程菌GS115/pPIC9K_Xynl IBm 菌種保藏編號為巴斯德畢赤酵母 CPicAia pas tori s ) CGMCC N0.9398。
2.一種如權利要求1所述高表達木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-XynllBm的基因序列，其特征在于，所述基因序列是一種源于人工合成編碼的瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因XynllB優化的核苷酸序列XynllBm,長度為1014bp，序列如 SEQ ID NO:1 所示。
3.—種能在畢赤酵母中高效表達的產木聚糖酶基因序列SEQ ID NO:1，此序列是在SEQ ID NO:2序列基礎上定點誘變而成，所編碼的氨基酸密碼子可以在巴斯德畢赤酵母中有效表達，該人工合成的DNA共編碼337個氨基酸殘基，氨基酸殘基排列順序如SEQ IDN0.3所示。
4.根據權利要求2所述優化的frontalis木聚糖酶基因XynllBm的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9K-Xynl lBm。
5.一種優化的AfeocaBifflasiijr木聚糖酶的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)根據酵母密碼子偏愛性對XynllB的密碼子進行初步替換；(2)采用Oligo6.0分析替換后基因序列中的限制性內切酶切割位點，通過密碼子調整，消除基因序列中的Bgl Il.Sac 1、Sal I, EcoR I和Not I的切割位點；(3)采用B1Edit7.0分析調整后基因序列中mRNA隱蔽剪接位點，并再次對密碼子進行調整，以消除其中的隱蔽剪接位點GGTAAG、GGTGAT, AATAAA, ATTTA, PolyT和PolyA，并計算GC百分比，再根據GC百分比對密碼子最進一步調整，使其處于40-50%之間；(4)采用RNAStructure 3.2對mRNA 二級結構的自由能進行分析，篩選獲得自由能最低的基因序列SEQ ID N0.1，并命名為XynllBm ;(5)采用全基因合成方法獲得SEQID N0.1所示核苷酸序列； (6)構建含有SEQID N0.1所示核苷酸序列的重組載體pPIC9K_XynllBm ；(7)將重組載體pPIC9K-XynllBm轉化宿主細胞GS115，獲得重組菌株并在酵母細胞中表達；(8)純化所表達的木聚糖酶。
6.一種如權利要求5所述獲得AfeocaBifflasiijr木聚糖酶。
7.權利要 求5所述優化的AfeocaBifflasiij:木聚糖酶用于非治療目的降解木聚糖的應用。
【文檔編號】C12N15/56GK104130951SQ201410383350
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】陳勇, 張慧玲, 李曉 申請人:新疆農業大學, 陳勇