一種檢測番茄斑萎病毒的方法

一種檢測番茄斑萎病毒的方法
【專利摘要】本發明公開了一種焦磷酸測序技術檢測番茄斑萎病毒的方法，先依據番茄斑萎病毒N基因設計特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的核糖核酸，然后分別以N基因的特異性引物進行聚合酶鏈式反應擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為143bp，則制備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最后根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有番茄斑萎病毒。本發明適用于對番茄斑萎病毒進行快速檢測確證，可廣泛應用于農業生產及環境中的疫情監控及進出口貿易中該類病毒的確證，操作極為簡便，所需樣品量小。
【專利說明】一種檢測番茄斑萎病毒的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物病原的檢測【技術領域】，具體涉及一種檢測番茄斑萎病毒的方法。

【背景技術】
[0002] 近年來，番爺斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV)以其廣泛的寄主范圍 和造成的巨大經濟損失已被列為世界危害最大的十種植物病毒之一。TSWV是TosPovirus 屬中最重要的一種病毒，廣泛分布于世界各地的溫帶、亞熱帶及熱帶地區，侵染82科900多 種單、雙子葉植物，危害蔬菜、花卉及多種糧食作物如番茄、辣椒、馬鈴薯、花生、葛芭、豌豆、 煙草、菊花、銀蓮花、百日草、大巖桐、大麗花及仙客來等，對許多經濟作物及庭院植物造成 嚴重損失。據報道，該病曾造成80%的花生損失、50%-90%的葛芭死亡，而在法國和西班 牙等歐洲地區，隨著介體西花薊馬的定殖與擴散，該病能夠對番茄、辣椒及銀蓮花產生毀滅 性危害，損失可達100%。
[0003] 番茄斑萎病毒在寄主植物植株間的自然傳播主要是通過薊馬媒介以持久性方式 傳播，該病毒在媒介昆蟲體內自行復制增殖，提高了病毒的傳播效率。目前，番茄斑萎病毒 已在我國四川、廣州、云南等多個地域存在，隨著西花薊馬和番茄斑萎病毒交叉侵染越來越 頻繁，番茄斑萎病毒株系與西花薊馬的快速變異性都會導致因兩種有害物種相互作用而造 成嚴重經濟損失。只有建立番茄斑萎病毒的快速確證方法，通過及時診斷和提前介入并快 速處理，才能有效地在傳播源頭上遏制病毒的進一步擴散，在最短的時間內切斷傳播鏈。
[0004] 目前，用于TSWV的檢測及確證方法一般通過血清學、生物寄主、形態學試驗判定 植株是否具有植物病毒，這些方法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要，同時顯微鏡 檢分析多依賴于人員的經驗和專業背景知識，主觀性較大；應用PCR技術檢測確證時，如果 引物特異性不強，可能出現檢測假陽性；由于番茄斑萎病毒變異性較強，不同地理株系堿基 差異程度較大，已有報道的引物很容易因位點變異導致出現假陽性等問題，因此，需要保守 性更高、達到SNP級的檢測引物或檢測方法。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種檢測番茄斑萎病毒的方法，從而克服現有技術在確證 TSWV上存在的缺點，尋求提供一種TSWV焦磷酸測序技術確證方法，以克服現有檢測技術的 不足，為農業生產及生態環境監控提供一種快速、簡便、高效、實用的TSWV確證檢測方法。
[0006] 本發明首先提供一種用于檢測番茄斑萎病毒的引物組，序列信息如下：
[0007] Sequencing-F :5' -TAAGGCTTCCCTGGTGTCATAC-3，（SEQ ID N0:l)，5，進行生物 素標記；
[0008] Sequencing-R :5，-CCATAATGCTGGGAGGTAGCT-3，（SEQ ID N0:2)，
[0009] Sequencing-測序引物：5，-GTTGATAGCTTTGAGATGA-3，（SEQ ID NO:3)。
[0010] 本發明還提供用上述的引物組檢測樣品中是否存在番茄斑萎病毒，具體方法如 下：
[0011] 1)將提取的待測樣品RNA進行RT-PCR擴增，逆轉錄后，擴增溶液中加入2XPCR buffer 12. 5 μ L，lOpmol/ μ L上游引物和下游引物各0. 5 μ L，DEPC水補足體積至25 μ L， PCR循環條件為：94°C預變性5min后，進入94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共 循環50次；然后72°C再延伸lOmin ;
[0012] 2)將PCR擴增產物電泳檢測：取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分溶 化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為〇. 5 μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面 剛剛沒過凝膠；將3 μ L?6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9V/cm恒 壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。
[0013] 3)制備焦磷酸測序單鏈模板：使用50 μ 1標記有生物素的PCR產物與200 μ g鏈 霉親和素包被的磁珠，在室溫25°C下孵育20分鐘，用vacuum prep tool將與磁珠結合后的 PCR產物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s ;denatureation buffer洗5s ;最后移到washing buffer中清洗10s ;然后將vaccum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。 將樣品放入80°C烘箱2分鐘，再冷卻到室溫；
[0014] 焦磷酸測序反應：測序反應在室溫下于焦磷酸測序儀上檢測，加樣使用600毫巴 /8毫秒的加樣壓力和時間，每輪反應時間65秒，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨著 核酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號，讀出DNA序列。
[0015] 本發明所述的關于根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有 TSWV :PCR反應為陽性的，進行焦磷酸測序分析，測序片段與N基因目標片段完全相同的，確 定為TSWV ;PCR反應為陽性的，測序片段與目標片段有一個以上堿基不同判定為非TSWV ; PCR反應為陰性的判定為非TSWV。
[0016] 本發明適用于對TSWV進行快速檢測確證，可廣泛應用于生產和環境中的病害監 控、進出口貿易中該病毒的確證。
[0017] 與現有技術相比，本發明的有益效果包括：
[0018] 第一，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短核酸序列分析，便于構建標 準化操作流程；
[0019] 第二，具有高通量、低成本的特點，PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化 等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。
[0020] 第三，靈敏度及精確度較高，在與RT-PCR相同的靈敏度下，可直接讀取核酸序列， 其檢測精度可達到單堿基的水平，實現對SNP (單核苷酸多態性）位點檢測與識別。
[0021] 第四，將PCR和產物測序二者合并，改變了傳統的有害生物分子檢測及送往生物 公司測序的模式，將檢測流程由4?7天縮短至2?4個小時。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1 :為本發明對病株樣品中N基因的擴增圖譜，其中M:DL2000，1，2:病株樣 品，3、4 :健康植株樣品；
[0023] 圖2 :為本發明對病株樣品中N基因焦磷酸測序結果。

【具體實施方式】
[0024] 本發明通過測序引物和聚合酶鏈式反應擴增單鏈脫氧核糖核酸模板雜交，與脫氧 核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP)硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和底 物（APS)、熒光素孵育，逐一加入四種三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs):(三磷酸腺嘌呤脫氧 核苷酸dATP ;三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸dTTP ;三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸dCTP ;三磷酸鳥 嘌呤脫氧核苷酸dGTP)，如與模板配對，此三磷酸堿基脫氧核苷酸與引物的末端形成共價 鍵，釋放焦磷酸基團（PPi);腺嘌呤核苷三磷酸（ATP)硫酸化酶在底物（APS)存在的情況下 催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化 熒光素轉化，氧化熒光素發出與腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可見光信號；光信號由電荷 耦合器件（CCD)收集并由軟件轉化為峰；每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數目成 正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未摻入的三磷酸堿基脫氧核苷酸由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解， 淬滅光信號，并再生反應體系，利用光信號轉化得到的峰圖，對樣品中的番茄斑萎病毒進行 準確的檢測。
[0025] 下面通過具體實施例并結合附圖進一步闡述本發明。
[0026] 實施例1 :檢測田間樣品中是否含有TSWV
[0027] 1、設計特異性引物序列
[0028] 通過Internet登陸美國國立生物信息技術中心（NCBI)，查詢檢索已公布的TSWV 的N基因核苷酸序列，不包含不明堿基成分序列，對同源性較近的同年份同地點的病株，用 DNAStar 7. 1軟件包中的Editseq和MegAlign軟件對所選樣本的N基因核苷酸序列進行編 輯，逐一比對，用Clustal W Method(軟件）默認參數對所選的N核苷酸序列進行同源性比 較，找到表征該病毒的特異核苷酸序列（目標檢測序列）。
[0029] PCR擴增引物設計和測序引物設計均可以通過Assay Design SW軟件來進行，使用 得分較高的一組引物進行實驗，根據DNASTAR的同源性分析結果，選取樣本基因中較保守 的序列區域，設計擴增引物，以便于擴增出特異性單一條帶，為后續測序奠定基礎。同時為 各個擴增區域中包含的特異核苷酸序列（目標序列）設計測序引物，N基因擴增片段長度 為 143bp。
[0030] TSWV PCR及測序引物為：
[0031] Sequencing_F:5，-TAAGGCTTCCCTGGTGTCATAC-3'，5' 進行生物素標記
[0032] Sequencing-R ：5/ -CCATAATGCTGGGAGGTAGCT-3;,
[0033] Sequencing 測序引物：5，-GTTGATAGCTTTGAGATGA-3，。
[0034] 2、提取待測番茄樣品的RNA
[0035] 利用田間發病的病株，用酚-氯仿法抽提而得；亦可用商業化的RNA提取試劑盒提 取。
[0036] 3、以TSWV N基因引物進行RT-PCR擴增
[0037] 擴增溶液中加入2XRT-PCR buffer(10倍聚合酶鏈式Mix反應 液）12. 5 μ L，lOpmol/ μ L上游引物和下游引物各0. 5 μ L，將提取的待測樣品RNA加入反應 體系中，DEPC水補足體積至25 μ L，PCR循環條件為：48°C 30min，94°C預變性5min后，進入 94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共循環50次；然后72°C再延伸lOmin.
[0038] 4、進行瓊脂糖凝膠電泳
[0039] 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分 溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為〇. 5 μ g/mL，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液 面剛剛沒過凝膠；將3 μ L?6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9V/cm 恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果，待檢田間樣品 能夠擴增出特異性條帶，擴增條帶為143bp，電泳結果見圖1。
[0040] 5、制備焦磷酸測序單鏈模板
[0041] 使用50 μ 1標記有生物素的PCR產物與200 μ g鏈霉親和素包被的磁珠，在室溫 25°C下孵育20分鐘，用vacuum pr印tool將與磁珠結合后的PCR產物吸起，然后在70%乙 醇中清洗 5s ;denatureation buffer 洗 5s ;最后移到 washing buffer 中清洗 10s ;vaccum prep tool放入含有N基因測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入80°C烘箱2分鐘， 再冷卻到室溫。
[0042] 6、焦磷酸測序
[0043] 在焦磷酸測序儀（PYROMARK ID)上進行反應，室溫條件下，加樣使用600毫巴/8 毫秒的加樣壓力和時間，每輪反應時間65秒，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸；隨著核 酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號，N基因焦磷酸測序結果見圖2,讀取的序列為 TCAGTGTTGT CTTGGCTATA T。
[0044] 7、結果判定
[0045] 田間樣品的N基因擴增片段長度為143bp，與預期一致；經過焦磷酸測序，測定的N 序列與TSWV目標序列一致，因此判定樣品中含有TSWV。
[0046] 實施例2 :檢測進口番茄種子中是否含有TSWV
[0047] 1、設計特異性引物序列
[0048] 同實施例1。
[0049] 2、提取待測樣品的RNA :
[0050] 同實施例1。
[0051] 3、以TSWV N引物進行RT-PCR擴增
[0052] 同實施例1。
[0053] 4、進行瓊脂糖凝膠電泳：
[0054] 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分 溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為〇. 5 μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液 面剛剛沒過凝膠；將3 μ L?6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9V/cm 恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果。
[0055] 待檢樣品PCR擴增未擴增出特異性條帶，因此判定進口番茄種子的樣品中不含有 TSWV。
[0056] 實施例3 :檢測不同病毒樣品中是否含有TSWV基因
[0057] 用本發明的焦磷酸測序確證技術，按檢測步驟對分離自進口日本甜葉菊的煙草環 斑病毒（TRSV)、分離于意大利黃瓜種子的番茄黑環病毒（TBRV)、分離于智利西瓜種子的黃 瓜花葉病毒（CMV)與番爺花葉病毒（ToMV)、分尚于青島番爺種植區的番爺黃化曲葉病毒 (ToYCLV)及番茄斑萎病毒屬病毒--鳳仙花壞死斑病毒（INSV)和鳶尾花黃斑病毒（IYSV) 等8種與TSWV遺傳背景相近的毒株進行檢測，沒有檢測到TSWV-N基因特有的擴增片段及 相應序列。從而證明對非TSWV的病毒進行檢測的時候不會出現假陽性結果。
[0058] 實施例4 :檢測不同濃度的TSWV病毒核酸標準品
[0059] 1、設計特異性引物序列
[0060] 同實施例1。
[0061] 2、RNA標準品的制備：
[0062] 按照常規分子克隆操作方法，首先PCR產物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用 Tiangen公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體4°C過夜連接，轉化感受態細胞，轉 化產物涂平板培養，挑取白斑PCR產物鑒定陽性后送華大基因公司測序，根據測序結果將 篩選的陽性克隆接種到含氨芐青霉素的LB培養基過夜培養，制備質粒DNA純化后，經過 Eco I酶切后，利用T7啟動子體外轉錄制備RNA模板，乙醇沉淀后于紫外核酸分析儀測定 〇D26Q值，定量測定濃度為5X 106拷貝/ μ L。
[0063] 3、以TSWV Ν引物進行RT-PCR擴增
[0064] 將標準品進行系列稀釋，分別得到濃度為5Χ 106、5Χ 105、5Χ 104、5Χ 103、5Χ 102、 5Χ 10\25拷貝/ μ L、20拷貝/ μ L、10拷貝/ μ L、5拷貝/ μ L的標準品，以不同濃度梯度的 標準品為模板，每個濃度設重復，進行RT-PCR及焦磷酸測序反應，反應體系和反應程序同 實施例1。
[0065] 4、進行瓊脂糖凝膠電泳：
[0066] 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分 溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為〇. 5 μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液 面剛剛沒過凝膠；將3 μ L?6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9V/cm 恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果。
[0067] 當核酸標準品的濃度下降到10拷貝/μ L時，無法檢測到TSWV特有的擴增片段， 焦磷酸測序也無法讀取相應序列。從而證明該方法對TSWV的病毒進行檢測的時候，靈敏度 可以達到20拷貝/ μ L。這表明焦磷酸測序技術的靈敏度及精確度較高，在具有與RT-PCR 相同的靈敏度的情況下，可讀取病毒核酸序列，其精確度更高，可達到單堿基的水平。該發 明能夠實現對病毒SNP(單核苷酸多態性）位點的檢測與識別。
【權利要求】
1. 一種用于檢測番茄斑萎病毒的引物組，其特征在于，所述的引物組中引物的序列信 息如下：Sequencing-Fl :5' -TAAGGCTTCCCTGGTGTCATAC-3，，Sequencing-Rl ：5/ -CCATAATGCTGGGAGGTAGCT-3;,Sequencing-測序引物：5' -GirGATAGCTirGAGATGA-S'。
2. 如權利要求1所述的引物組，其特征在于所述的Sequencing-Fl的5'進行生物素 記。
3. 權利要求1所述的引物組在制備檢測番茄斑萎病毒的制品中的應用。
4. 一種用于檢測番茄斑萎病毒的制品，其特征在于，所述的制備為試劑盒，包含有權利 要求1所述的引物組。
5. -種應用權利要求1所述的引物組檢測測番茄斑萎病毒的方法，其特征在于，所述 的方法包括如下的步驟： 1) 將提取的待測樣品RNA進行RT-PCR擴增，逆轉錄后，擴增溶液中加入2XPCR buffer 12. 5 μ L，lOpmol/μ L上游引物和下游引物各0. 5 μ L，DEPC水補足體積至25 μ L，PCR循環條 件為：941：預變性51^11后，進入941：變性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8，共循環50次 ；然后72°C再延伸lOmin ;2) 將PCR擴增產物電泳檢測：取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加 入溴化乙錠貯存液至終濃度為〇. 5 μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛 沒過凝膠；將3 μ L?6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9V/cm恒壓電 泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄；3) 制備焦磷酸測序單鏈模板：使用50 μ 1標記有生物素的PCR產物與200 μ g鏈霉親 和素包被的磁珠，在室溫25°C下孵育20分鐘，用vacuum pr印tool將與磁珠結合后的PCR 產物吸起，然后在70 %乙醇中清洗5s ;denatureation buffer洗5s ;最后移到washing buffer中清洗10s ;然后將vaccum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。 將樣品放入80°C烘箱2分鐘，再冷卻到室溫；其中焦磷酸測序反應具體如下：測序反應在室溫下于焦磷酸測序儀上檢測，加樣使用 600毫巴/8毫秒的加樣壓力和時間，每輪反應時間65秒，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延 伸，隨著核酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號，讀出DNA序列。
【文檔編號】C12Q1/70GK104195269SQ201410465241
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】吳興海, 陳長法, 封立平, 魏曉棠, 馮黎霞, 張京宣, 王簡 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心