本發明涉及肌酐檢測試劑。
背景技術：
1、隨著社會的發展和城市化進程的加快，人們的工作生活節奏也逐漸加快，缺乏運動、睡眠不足都會導致腎病發病率增高，如何盡早地、精準地診斷出腎病對于患者的治療至關重要。血清中和尿液中肌酐的測定可為臨床評價腎小球濾過功能提供客觀指標，同時肌酐檢測也是人體血液常規檢測的主要項目之一。肌酐降解酶系檢測肌酐，具有抗干擾能力強、特異性好、線性范圍寬、靈敏度高和操作簡單等特點。國內外對酶法檢測肌酐已開展了一定的研究，成功研制了肌酐檢測試劑盒，在臨床診斷中正逐漸推廣使用。其中，肌酐酶(creatininase,ca,ec?3.5.2.10)、肌酸酶(creatinase,ci,ec?3.5.3.3)、肌氨酸氧化酶(sarcosine?oxidase,sox,ec?1.5.3.1)是用于酶法檢測肌酐的關鍵工具酶。酶法肌酐檢測對酶的純度和穩定性要求高，國內還不能實現肌酐檢測用酶的工業化生產，大部分依賴進口。肌酐檢測用酶價格高昂，嚴重阻礙了酶法測定肌酐在國內的應用。因此，研究高活性、穩定的肌酐檢測用酶的生產，對控制檢測成本，減輕患者負擔、實現肌酐酶法測定的廣泛應用具有重要的研究意義。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了肌酐檢測試劑。肌酐酶(creatininase,ca,ec?3.5.2.10)、肌酸酶(creatinase,ci,ec?3.5.3.3)、肌氨酸氧化酶(sarcosine?oxidase,sox,ec?1.5.3.1)是用于酶法檢測肌酐的關鍵工具酶，本發明通過在ncbi基因庫中篩選得到三個肌酐檢測工具酶的基因序列或蛋白序列，分別構建了重組表達工程菌，對其進行誘導產酶，通過優化發酵和誘導條件，提高表達量，并對三種酶的酶學性質進行了研究，為降低肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的生產成本，實現工業化生產提供了理論基礎。并進行了發酵條件的研究，在5l發酵罐中對三種酶進行放大生產，以期得到規模化的工業用酶，并驗證了三酶級聯檢測肌酐的性能。
2、本發明提供肌酐檢測試劑，所述肌酐檢測試劑包括重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶；
3、所述重組肌酐酶的氨基酸序列為序列表中seq?id?no.2；所述重組肌酸酶的氨基酸序列為序列表中seq?id?no.4；所述重組肌氨酸氧化酶的氨基酸序列為序列表中seq?idno.6。
4、作為優選，所述重組肌酐酶的核苷酸序列為序列表中seq?id?no.1；所述重組肌酸酶的核苷酸序列為序列表中seq?id?no.3；所述重組肌氨酸氧化酶的核苷酸序列為序列表中seq?id?no.5。
5、作為優選，所述重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶的制備方法為：
6、(1)分別將序列表中seq?id?no.1、seq?id?no.3和seq?id?no.5構建到質粒載體上，得到三種重組質粒；
7、(2)分別將三種重組質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞，得到三種重組大腸桿菌，分別進行重組蛋白誘導表達，并將細胞破碎收集上清液，將上清液進行發酵培養，分別得到重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶的粗酶液；
8、(3)分別將三種粗酶液進行純化，得到重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶。
9、作為優選，步驟(2)中，所述重組肌酐酶的發酵培養方法為：將重組肌酐酶上清液接種至培養基中，iptg濃度為0.2mmol/l，接種量為4％，溶氧值控制在30％，在25℃下誘導18h進行發酵培養；
10、所述培養基配方為：葡萄糖10.30g/l、酵母浸粉21.80g/l、磷酸鹽137.60mmol/l、胰蛋白胨15.60g/l。
11、作為優選，步驟(2)中，所述重組肌酸酶的發酵培養方法為：將重組肌酸酶上清液接種至培養基中，接種4h后添加iptg，iptg終濃度為0.4mmol/l，接種量為4％，溶氧值控制在35％，在30℃下誘導20h進行發酵培養；
12、所述培養基為tb培養基。
13、作為優選，步驟(2)中，所述重組肌氨酸氧化酶的發酵培養方法為：將重組肌氨酸氧化酶上清液接種至培養基中，接種5h后添加iptg，iptg終濃度為0.6mmol/l，接種量為6％，溶氧值控制在30％，在25℃下誘導21h進行發酵培養；
14、所述培養基為tb培養基。
15、作為優選，步驟(3)中，所述重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶的純化方法為：將粗酶液過濾，濾液上樣至histrap?hp親和柱，使用4％洗脫緩沖液洗滌親和柱，直至基線趨于0，然后使用60％的洗脫緩沖液洗脫重組蛋白，最后，使用脫鹽柱對洗脫液進行脫鹽處理，得到純化的重組肌酐酶。
16、作為優選，所述重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶的用量比為1:3:3。
17、作為優選，所述肌酐檢測試劑還包括色原，所述色原為0.4mmol/l的3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸；和/或
18、所述肌酐檢測試劑還包括復合保護劑，所述復合保護劑由蔗糖、山梨醇、tween20和甘油組成，所述蔗糖、山梨醇、tween20和甘油在肌酐檢測試劑中的濃度依次為2.0g/l、1.5g/l、0.5g/l、2.0g/l；和/或
19、所述肌酐檢測試劑還包括防腐劑，所述防腐劑為山梨酸鉀，所述山梨酸鉀在肌酐檢測試劑中的濃度為1.0g/l。
20、本發明還提供上述的肌酐檢測試劑在制備肌酐檢測試劑盒中的應用。
21、本發明的肌酐檢測試劑的肌酐檢測限為90.75μm，與市售的肌酐檢測試劑盒的檢測性能進行比較，在檢測范圍內相對誤差優于市售試劑盒，準確度較好，為開發國產體外診斷肌酐的酶制劑奠定了基礎。
1.肌酐檢測試劑，其特征在于：所述肌酐檢測試劑包括重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶；
2.根據權利要求1所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：所述重組肌酐酶的核苷酸序列為序列表中seq?id?no.1；所述重組肌酸酶的核苷酸序列為序列表中seq?id?no.3；所述重組肌氨酸氧化酶的核苷酸序列為序列表中seq?id?no.5。
3.根據權利要求2所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：所述重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶的制備方法為：
4.根據權利要求3所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：步驟(2)中，所述重組肌酐酶的發酵培養方法為：將重組肌酐酶上清液接種至培養基中，iptg濃度為0.2mmol/l，接種量為4％，溶氧值控制在30％，在25℃下誘導18h進行發酵培養；
5.根據權利要求3所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：步驟(2)中，所述重組肌酸酶的發酵培養方法為：將重組肌酸酶上清液接種至培養基中，接種4h后添加iptg，iptg終濃度為0.4mmol/l，接種量為4％，溶氧值控制在35％，在30℃下誘導20h進行發酵培養；
6.根據權利要求3所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：步驟(2)中，所述重組肌氨酸氧化酶的發酵培養方法為：將重組肌氨酸氧化酶上清液接種至培養基中，接種5h后添加iptg，iptg終濃度為0.6mmol/l，接種量為6％，溶氧值控制在30％，在25℃下誘導21h進行發酵培養；
7.根據權利要求3-6任一項所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：步驟(3)中，所述重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶的純化方法為：將粗酶液過濾，濾液上樣至histraphp親和柱，使用4％洗脫緩沖液洗滌親和柱，直至基線趨于0，然后使用60％的洗脫緩沖液洗脫重組蛋白，最后，使用脫鹽柱對洗脫液進行脫鹽處理，得到純化的重組肌酐酶。
8.根據權利要求1-7任一項所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：所述重組肌酐酶、重組肌酸酶和重組肌氨酸氧化酶的用量比為1:3:3。
9.根據權利要求8所述的肌酐檢測試劑，其特征在于：所述肌酐檢測試劑還包括色原，所述色原為0.4mmol/l的3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸；和/或
10.權利要求1-9任一項所述的肌酐檢測試劑在制備肌酐檢測試劑盒中的應用。