本發明涉及生物，尤其是涉及一種基于重組藻酸鹽裂解酶的粘液型銅綠假單胞菌噬菌體分離方法。
背景技術：
1、銅綠假單胞菌（ pseudomonas?aeruginosa， p.?aeruginosa，pa）在環境中分布廣泛，是臨床中常見的革蘭氏陰性細菌。銅綠假單胞菌有粘液型（mucoid pseudomonas? aeruginosa，mpa）和非粘液型，粘液型和非粘液型銅綠假單胞菌可以相互轉變，非粘液型銅綠假單胞菌在滲透壓高、氯化鈉水平高以及磷酸鹽水平較低等條件刺激下，向高產藻酸鹽狀態轉化，進而導致粘液表型銅綠假單胞菌的形成。
2、粘液型銅綠假單胞菌產生特殊的耐藥性，主要原因是mpa的胞外基質以藻酸鹽為主，大量的粘多糖使mpa形成厚度更大、更為致密的生物膜。生物膜的形成有助于細菌逃避免疫細胞（如巨噬細胞）的吞噬；其次，生物膜形成的物理屏障會阻礙或延緩抗生素等抗菌藥物的滲透，使其難以直接接觸并作用于細菌；再者，生物膜內部的細菌由于代謝活動降低，對抗菌藥物的敏感性也顯著下降，從而進一步增加了其生存能力。然而，細菌耐藥性增加，由粘液型銅綠假單胞菌引起的相關感染疾病就會逐步發展為慢性的、持續性的、反復發作的難以治療的疾病。
3、噬菌體療法通過裂解性噬菌體裂解細菌治療病原菌感染。與抗生素相比，噬菌體可同時破壞微生物群，具有高度宿主特異性、安全性高、成本低廉，對全球日益嚴峻的銅綠耐藥菌威脅及抗生素失效具有重要意義。粘液型銅綠假單胞菌分泌大量的藻酸鹽多糖等粘性物質：①在菌外形成粘液層“屏障”，阻止了噬菌體與宿主菌的直接接觸；②限制噬菌體擴散，從而影響噬菌體對宿主菌的感染和裂解，影響噬菌體的分離和鑒定。然而，mpa以藻酸鹽為主的胞外基質導致mpa噬菌體分離困難，且即使分離得到噬菌體，殺菌效果也并不理想。因此，迫切需要探索有效的mpa噬菌體分離策略獲取殺菌效果顯著的粘液型銅綠假單胞菌噬菌體。
技術實現思路
1、有鑒于此，本發明提出了一種重組藻酸鹽裂解酶，本發明還提出了一種基于重組藻酸鹽裂解酶的粘液型銅綠假單胞菌噬菌體分離方法。
2、為實現上述目的，本發明采取下述技術方案：
3、本發明所述的重組藻酸鹽裂解酶，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示，其編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。有益效果是：本發明的重組重組藻酸鹽裂解酶具有很好的藻酸鹽降解活性，可用于粘液型銅綠假單胞菌噬菌體的篩選。
4、本發明還提出了重組藻酸鹽裂解酶的制備方法，所述制備方法是先采用重組同源構建表達藻酸鹽裂解酶的重組質粒，將構建正確的重組質粒轉入轉化進大腸桿菌dh5α進行擴增，然后轉入bl21(de3)中進行誘導表達獲取粗酶液，將粗酶液柱層析純化，獲取重組藻酸鹽裂解酶。其中，本發明中重組藻酸鹽裂解酶的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，其編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
5、有益效果是：本發明以銅綠假單胞菌標準株pao1基因組dna中的藻酸鹽裂解酶基因 algl作為目的基因，構建了重組質粒，并在大腸桿菌?bl21(de3)中完成誘導表達，獲得了高純度的重組藻酸鹽裂解酶，進而確保其藻酸鹽降解活性。
6、本發明還提出了一種基于重組藻酸鹽裂解酶的粘液型銅綠假單胞菌噬菌體分離方法，包括以下步驟：第一步，將粘液型銅綠假單胞菌菌株接種在lb液體培養基中培養過夜，獲取粘液型銅綠假單胞菌菌株的種子液；將種子液接種在添加有重組藻酸鹽裂解酶（氨基酸序列如seq?id?no.2所示）的lb液體培養基中加入污水培養，富集得到噬菌體；用雙層瓊脂平板分離獲取噬菌斑；
7、第二步，將第一步分離得到的噬菌斑進行連續噬菌斑挑選并進行噬菌體成斑率測定，獲得裂解粘液型銅綠假單胞菌的噬菌體p1030，該噬菌體保藏于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：cgmcc?no.46655。本發明的噬菌體p1030具有完整的結構蛋白、復制調控及裂解系統基因模塊，基因組組織緊湊、功能分區明確，遺傳特征與其高效裂解粘液型銅綠假單胞菌的表型高度一致，為其在制備治療粘液型銅綠假單胞菌感染性疾病的藥物或生物制劑中的應用提供理論基礎。
8、優選的，第一步中，在富集噬菌體時lb液體培養基中重組藻酸鹽裂解酶的終濃度和雙層瓊脂平板的上層平板中重組藻酸鹽裂解酶的終濃度為80?mg/ml。更優選的，所述噬菌體p1030的效價為107-1011pfu/ml。有益效果是：本發明利用重組藻酸鹽裂解酶降解mpa胞外藻酸鹽基質，顯著提高了噬菌體的富集與分離效率，進而成功獲得了噬菌體p1030，克服了現有粘液型銅綠假單胞菌噬菌體難分離的問題。其次，本發明獲得的噬菌體p1030效價高（在107-1011pfu/ml）、遺傳穩定，并在藻酸鹽裂解酶的輔助下對粘液型銅綠假單胞菌表現出增強的裂解作用，且本發明的噬菌體p1030效價高（在107-1011pfu/ml）、遺傳穩定，并在藻酸鹽裂解酶的輔助下對粘液型銅綠假單胞菌表現出增強的裂解作用，對粘液型銅綠假單胞菌引起的感染性疾病治療藥物的開發提供可靠的技術基礎。
9、與現有技術相比，本發明的優點在于：
10、本發明以銅綠假單胞菌標準株pao1基因組dna中的藻酸鹽裂解酶基因 algl作為目的基因，構建了重組質粒，并在大腸桿菌?bl21(de3)中完成誘導表達，獲得了高純度和高活性（藻酸鹽降解活性）的重組藻酸鹽裂解酶。本發明基于重組藻酸鹽裂解酶篩選到了對粘液型銅綠假單胞菌表現出高裂解作用的噬菌體，克服了粘液型銅綠假單胞菌噬菌體難分離的問題，為對粘液型銅綠假單胞菌引起的感染性疾病治療藥物的開發提供可靠的技術基礎。
1.一種重組藻酸鹽裂解酶，其特征在于：所述重組藻酸鹽裂解酶的氨基酸序列如seqid?no.2所示，其編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種如權利要求1所述的重組藻酸鹽裂解酶的制備方法，其特征在于：所述制備方法是先采用重組同源構建表達藻酸鹽裂解酶的重組質粒，將構建正確的重組質粒轉入轉化進大腸桿菌dh5α進行擴增，然后轉入bl21(de3)中進行誘導表達獲取粗酶液，將粗酶液柱層析純化，獲取重組藻酸鹽裂解酶。
3.一種基于重組藻酸鹽裂解酶的粘液型銅綠假單胞菌噬菌體分離方法，其特征在于：所述方法基于權利要求1所述的重組藻酸鹽裂解酶或權利要求2制備得到的重組藻酸鹽裂解酶篩選得到，具體步驟如下：
4.根據權利要求3所述的粘液型銅綠假單胞菌噬菌體分離方法，其特征在于：在所述第一步中，在富集噬菌體時lb液體培養基中重組藻酸鹽裂解酶的終濃度和雙層瓊脂平板的上層平板中重組藻酸鹽裂解酶的終濃度為80?mg/ml。
5.根據權利要求3所述的粘液型銅綠假單胞菌噬菌體分離方法，其特征在于：所述噬菌體p1030的效價為107-1011?pfu/ml。