本發明專利屬于prrs病毒顆粒抗原定量分析，具體涉及一種定量檢測prrs病毒顆粒的方法及其應用。
背景技術：
1、豬繁殖與呼吸綜合癥(?porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，prrs?)是以妊娠母豬流產、仔豬呼吸障礙為特征的一種高度傳染性疾病，易爆發大流行。prrs的病原是豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(porcine?reproductive?and?respiratorysyndrome?virus，prrsv)，是具有囊膜的rna病毒，prrsv有歐洲型（i型）和美洲型（ii型）兩種基因型，具有免疫抑制和持續感染的特性，易產生變異與重組。
2、疫苗接種是控制prrs爆發的有效途徑。目前，國內外臨床最成熟的prrs疫苗主要是滅活疫苗和減毒活疫苗，但這兩類疫苗仍存在安全性和有效性的隱患。因此，改進疫苗生產工藝，嚴格把控疫苗質量至關重要。prrs疫苗工業生產與質量評估的關鍵在于prrs病毒顆粒的定量技術。在疫苗生產過程中對prrs病毒顆粒的準確定量，可以指導疫苗生產工藝的改進，從而提高生產效率，節約成本；疫苗中病毒顆粒的含量則直接關乎疫苗的最終免疫保護效果與安全性。因此，建立一種較為精準，操作簡單的prrs病毒顆粒含量的檢測方法具有非常重要的應用價值。
3、現有階段針對prrs病毒液含量的檢測，一般采用細胞半數感染量tcid50和實時熒光定量pcr，但這兩種方法的靈敏度、準確性與重復性都難以保證。特別是prrs滅活病毒液在工業化生產中的定量方法仍處于空白，無法準確判斷疫苗最終免疫劑量，從而導致滅活疫苗容易產生明顯的副作用。蔗糖密度梯度離心法是分離病毒的一種經典方法，蔗糖較為溫和，有利于保持病毒粒子完整性，但傳統的蔗糖密度梯度離心方法全部采用手工操作，過程繁瑣，重復性較差、周期長、人力成本和運行成本較高，致使蔗糖密度梯度離心法定量prrsv的準確性大打折扣。
4、因此，本文提出一種定量檢測prrs病毒顆粒的方法及其應用。
技術實現思路
1、為了解決上述問題，本發明提供了一種定量檢測prrs病毒顆粒的方法及其應用，本發明中蔗糖密度梯度采用全自動梯度儀制備，利用高效液相色譜系統實現prrs病毒顆粒的出峰全自動分析，通過已知濃度標準蛋白建立標準曲線，計算待測樣品，克服了傳統蔗糖密度梯度超速離心法重復性差、操作過程復雜的問題，具有檢測周期短、靈敏度高、重復性好、批次內誤差小等優勢。
2、為了達到上述技術效果，本發明第一目的是提供一種定量檢測prrs病毒顆粒的方法，具體包括以下步驟：
3、s1、蔗糖梯度的制備：用tn緩沖液（ph8.0）分別配制15%和45%的蔗糖溶液；通過梯度混合儀自帶的刻度尺對規格為12.5ml的超速離心管進行標記；先加入15%的蔗糖溶液至超速離心管標記處，再用長針頭緩慢從底部加入45%的蔗糖溶液至超速離心管頂部；然后將其置于梯度混合儀上，選擇15%-45%蔗糖梯度制備程序，連續工作113s，即得15%-45%連續梯度的蔗糖溶液；
4、s2、蔗糖密度梯度超速離心：將prrs病毒顆粒樣品于4℃條件下，以8000rpm離心3min，取上清液備用；吸棄1.0ml蔗糖連續梯度溶液，然后于頂層緩慢加入1.5ml上清液，在10℃，35000rpm的條件下水平離心3.5h，得離心樣品；
5、s3、高效液相色譜儀的準備：用末端帶有15cm長針頭且管徑為0.5mm的管路將高效液相色譜儀的泵頭和外部流動相（45%的蔗糖溶液）相連，打開高效液相色譜儀的泵送系統和紫外檢測系統，平衡基線；
6、s4、prrs病毒顆粒含量的檢測：將s3中的長針頭插入到含有離心樣品的超速離心管底部；設定流速為1.0ml/min，檢測波長設定為280nm，色譜儀的電腦系統自動繪制色譜圖，進行手動積分，得目標峰面積；
7、s5、用tn緩沖液（ph8.0）將甲狀腺球蛋白標準蛋白在10-160μg/ml濃度范圍間配置成6個濃度梯度的標準溶液樣品；取標準溶液樣品1.5ml，按s1-s3操作，平衡基線后，將長針頭插入到含有標準溶液樣品的超速離心管的管底；以1.0ml/min的流速運行，在280nm紫外波長下進行檢測，對色譜圖吸收峰進行積分得峰面積，并建立吸收峰面積與蛋白濃度的線性回歸方程；
8、s6、根據s5中建立的蛋白濃度與峰面積的線性回歸方程，將prrs病毒顆粒的目標吸收峰面積代入回歸方程，計算待測樣品中prrs病毒顆粒的含量。
9、進一步地，s1中，在梯度混合儀使用前，應通過水平儀將梯度混合儀調至平衡。
10、進一步地，s3中，還通過去離子水為流動相，用于排出系統內的氣泡。
11、本發明第二目的是提供上述定量檢測prrs病毒顆粒的方法在評估prrs疫苗抗原含量中的應用。
12、本發明第三目的是提供上述定量檢測prrs病毒顆粒的方法在制備prrs疫苗中的應用。
13、本發明的有益效果是：
14、本發明中的蔗糖密度梯度超速離心法的作用條件溫和，對病毒顆粒的損傷較小，更為優化的蔗糖梯度和離心條件，使蔗糖密度梯度的層次更分明；高效液相色譜儀的聯合使用避免了手工操作的繁瑣性以及人工判斷的主觀性，從而提高了蔗糖密度梯度超速離心定量法的敏感性、重復性，準確性，高效性。本方法與常規方法比較，簡單、實用、?快捷、靈敏，適用于prrs病毒顆粒抗原含量的測定，用于指導prrs疫苗抗原生產和質量評估。
1.一種定量檢測prrs病毒顆粒的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種定量檢測prrs病毒顆粒的方法，其特征在于：所述的s1中，在梯度混合儀使用前，應通過水平儀將梯度混合儀調至平衡。
3.根據權利要求1所述的一種定量檢測prrs病毒顆粒的方法，其特征在于：所述的s3中，還通過去離子水為流動相，用于排出系統內的氣泡。
4.根據權利要求1至3任意一項所述的定量檢測prrs病毒顆粒的方法在評估prrs疫苗抗原含量中的應用。
5.根據權利要求1至3任意一項所述的定量檢測prrs病毒顆粒的方法在制備prrs疫苗中的應用。