本發明涉及生物醫藥，尤其涉及一種檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒。
背景技術：
1、兒童急性呼吸窘迫綜合征（pediatric?acute?respiratory?distress?syndrome，pards）是兒童重癥監護病房中導致高死亡率和長期并發癥的危重癥候群。目前，臨床上對pards的診斷和分級主要依據2015年發布的兒科急性肺損傷共識會議（pediatric?acutelung?injury?consensus?conference，palicc）標準，重點依賴氧合指數、影像學浸潤和發病時機等生理與解剖學特征。
2、然而，在實際臨床實踐中，這種基于生理表征的診斷模式存在顯著的滯后性和局限性。首先，pards具有極高的生物學異質性，相同的氧合受損程度背后可能對應著截然不同的病理生理機制，例如有的患者以彌漫性肺泡上皮損傷為主，而有的則以嚴重的血管內皮滲漏或高炎癥反應表型（hyper-inflammatory?phenotype）為主。僅憑臨床指標難以區分這些亞型，導致治療方案缺乏針對性。其次，現有技術中雖然已發現白介素6（interleukin-6，il-6）、血管生成素2（angiopoietin-2，ang2）等生物標志物與疾病嚴重程度相關，但現有的檢測手段大多是針對單一指標或單一通路的離散檢測。由于pards的病程涉及炎癥風暴、凝血功能紊亂、內皮-上皮屏障破壞及隨后的纖維化修復等多個維度的級聯反應，單一指標往往因特異性不足而難以準確預測病情軌跡。
3、此外，現有的檢測方案通常忽略了遺傳背景對疾病易感性的影響。研究表明，白介素8（interleukin-8，il-8）等關鍵炎癥因子的基因多態性與pards的發生風險密切相關，但目前的急診檢測并未將遺傳易感性與急性期蛋白水平進行聯合評估。同時，缺乏針對兒童特定病程節點（如發病早期、進展期、轉歸期）的動態標準化參考體系，使得臨床醫生難以通過單次或序貫檢測來早期識別難治性病例或預測機械通氣時長。
4、綜上所述，亟需一種能夠整合遺傳易感性、內皮與上皮損傷、炎癥表型及凝血纖維化修復等多維度信息，并具備病程動態監測功能的檢測方案，以實現對pards的早期精準分層和嚴重程度預判。
技術實現思路
1、本發明提供了一種檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，解決了現有技術單一指標難以滿足早期精準分層及病程動態監測的臨床需求的問題。
2、本發明實施例提出了一種檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，試劑盒包含檢測試劑組合及標準化參考品體系，檢測試劑組合由特異性結合血管生成素2的第一捕獲抗體和第一檢測抗體、特異性結合可溶性晚期糖基化終末產物受體和肺表面活性蛋白d的第二捕獲抗體和第二檢測抗體、特異性結合可溶性腫瘤壞死因子受體1、白介素6和白介素8的第三捕獲抗體和第三檢測抗體、特異性結合纖溶酶原激活物抑制劑1和iii型前膠原n端肽的第四捕獲抗體和第四檢測抗體以及特異性擴增白介素8基因啟動子區單核苷酸多態性位點rs4073的引物對及探針組成，標準化參考品體系包含覆蓋上述蛋白標志物在兒童急性呼吸窘迫綜合征發病第0天、第3天及第7天生理濃度動態范圍的梯度標準品。
3、優選地，引物對及探針針對白介素8基因負251位點的t和a等位基因多態性設計，引物對被配置為與包含rs4073位點的dna片段互補配對，探針包括識別野生型等位基因的第一探針和識別突變型等位基因的第二探針，第一探針和第二探針分別標記有不同的熒光報告基團，試劑盒還包含全血或口腔拭子基因組dna裂解液及純化磁珠。
4、優選地，試劑盒還包括針對葉酸受體3的第五捕獲抗體和第五檢測抗體，第五捕獲抗體固相化在獨立于血液樣本檢測區的載體區域上，第五檢測抗體用于檢測氣管抽吸物樣本中的葉酸受體3水平。
5、優選地，標準化參考品體系包含至少5個濃度梯度的凍干粉標準品，其中可溶性腫瘤壞死因子受體1的標準品濃度范圍為1000pg/ml至50000pg/ml，白介素6的標準品濃度范圍為10pg/ml至5000pg/ml，血管生成素2的標準品濃度范圍為1000pg/ml至80000pg/ml，試劑盒還包含記載有基于發病第0天、第3天及第7天的時間點對上述蛋白標志物水平進行趨勢判讀規則的信息載體。
6、優選地，第一捕獲抗體是針對人血管生成素2蛋白受體結合結構域的單克隆抗體，第一檢測抗體是針對人血管生成素2蛋白非重疊表位的多克隆抗體或單克隆抗體，第一捕獲抗體與第一檢測抗體的組合對血管生成素1的交叉反應率低于1%且檢測下限不高于50pg/ml。
7、優選地，第一捕獲抗體、第二捕獲抗體、第三捕獲抗體及第四捕獲抗體分別偶聯在具有不同熒光編碼的微球表面或固定在微流控芯片的不同反應通道內，試劑盒還包含由鼠免疫球蛋白g、牛血清白蛋白及聚合免疫球蛋白組成的封閉試劑。
8、優選地，試劑盒還包含表型判定參考卡，表型判定參考卡上記載有基于白介素6、白介素8、可溶性腫瘤壞死因子受體1及纖溶酶原激活物抑制劑1的濃度閾值，濃度閾值界定了高炎癥反應表型的數值區間。
9、優選地，第四捕獲抗體或第四檢測抗體是識別iii型前膠原n端肽特定裂解位點的抗體，抗體不與完整的iii型前膠原分子結合。
10、優選地，試劑盒還包含樣本前處理輔助試劑包，輔助試劑包包括乙二胺四乙酸抗凝管及含有絲氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑的混合物。
11、優選地，引物對的序列長度為18至25個核苷酸且熔解溫度為58℃至62℃，探針5'端標記有fam熒光基團或vic熒光基團，3'端標記有小溝結合物淬滅基團。
12、有益效果：
13、首先，本發明突破了單一生物標志物檢測的局限，通過聯合檢測血管生成素2（ang2）、可溶性晚期糖基化終末產物受體（srage）、肺表面活性蛋白d（sp-d）、iii型前膠原n端肽（p3np）及多種炎癥因子，實現了對pards發病機制中內皮滲漏、上皮損傷、炎癥風暴及凝血纖維化四大核心通路的同步覆蓋，能夠精準區分高炎癥反應表型與低炎癥反應表型，顯著提高了重癥識別的靈敏度與特異性；其次，本試劑盒創新性地引入白介素8（il-8）啟動子區rs4073位點的基因檢測，將先天遺傳易感性（基因型）與急性期表型（蛋白水平）相結合，有效區分了體質性高風險人群與應激性反應人群，實現了“易感性+嚴重程度”的一體化評估；最后，配套的覆蓋發病第0天、第3天及第7天的梯度標準化參考品體系，確立了兒童特異性的動態判讀基準，使臨床醫生能夠通過監測生物標志物的時序軌跡（如p3np的持續升高或ang2的不回落）來早期預測肺纖維化風險及機械通氣撤機困難，從而指導個性化的分層治療，降低病死率。
1.一種檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含檢測試劑組合及標準化參考品體系，所述檢測試劑組合由特異性結合血管生成素2的第一捕獲抗體和第一檢測抗體、特異性結合可溶性晚期糖基化終末產物受體和肺表面活性蛋白d的第二捕獲抗體和第二檢測抗體、特異性結合可溶性腫瘤壞死因子受體1、白介素6和白介素8的第三捕獲抗體和第三檢測抗體、特異性結合纖溶酶原激活物抑制劑1和iii型前膠原n端肽的第四捕獲抗體和第四檢測抗體以及特異性擴增白介素8基因啟動子區單核苷酸多態性位點rs4073的引物對及探針組成，所述標準化參考品體系包含覆蓋上述蛋白標志物在兒童急性呼吸窘迫綜合征發病第0天、第3天及第7天生理濃度動態范圍的梯度標準品。
2.根據權利要求1所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述引物對及探針針對白介素8基因負251位點的t和a等位基因多態性設計，所述引物對被配置為與包含rs4073位點的dna片段互補配對，所述探針包括識別野生型等位基因的第一探針和識別突變型等位基因的第二探針，所述第一探針和第二探針分別標記有不同的熒光報告基團，所述試劑盒還包含全血或口腔拭子基因組dna裂解液及純化磁珠。
3.根據權利要求1所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括針對葉酸受體3的第五捕獲抗體和第五檢測抗體，所述第五捕獲抗體固相化在獨立于血液樣本檢測區的載體區域上，所述第五檢測抗體用于檢測氣管抽吸物樣本中的葉酸受體3水平。
4.根據權利要求1所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述標準化參考品體系包含至少5個濃度梯度的凍干粉標準品，其中可溶性腫瘤壞死因子受體1的標準品濃度范圍為1000pg/ml至50000pg/ml，白介素6的標準品濃度范圍為10pg/ml至5000pg/ml，血管生成素2的標準品濃度范圍為1000pg/ml至80000pg/ml，所述試劑盒還包含記載有基于發病第0天、第3天及第7天的時間點對上述蛋白標志物水平進行趨勢判讀規則的信息載體。
5.根據權利要求1所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述第一捕獲抗體是針對人血管生成素2蛋白受體結合結構域的單克隆抗體，所述第一檢測抗體是針對人血管生成素2蛋白非重疊表位的多克隆抗體或單克隆抗體，所述第一捕獲抗體與第一檢測抗體的組合對血管生成素1的交叉反應率低于1%且檢測下限不高于50pg/ml。
6.根據權利要求1至5任一項所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述第一捕獲抗體、第二捕獲抗體、第三捕獲抗體及第四捕獲抗體分別偶聯在具有不同熒光編碼的微球表面或固定在微流控芯片的不同反應通道內，所述試劑盒還包含由鼠免疫球蛋白g、牛血清白蛋白及聚合免疫球蛋白組成的封閉試劑。
7.根據權利要求1所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含表型判定參考卡，所述表型判定參考卡上記載有基于白介素6、白介素8、可溶性腫瘤壞死因子受體1及纖溶酶原激活物抑制劑1的濃度閾值，所述濃度閾值界定了高炎癥反應表型的數值區間。
8.根據權利要求1所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述第四捕獲抗體或所述第四檢測抗體是識別iii型前膠原n端肽特定裂解位點的抗體，所述抗體不與完整的iii型前膠原分子結合。
9.根據權利要求1所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含樣本前處理輔助試劑包，所述輔助試劑包包括乙二胺四乙酸抗凝管及含有絲氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑的混合物。
10.根據權利要求2所述的檢測兒童急性呼吸窘迫綜合征易感性及嚴重程度的試劑盒，其特征在于，所述引物對的序列長度為18至25個核苷酸且熔解溫度為58℃至62℃，所述探針5'端標記有fam熒光基團或vic熒光基團，3'端標記有小溝結合物淬滅基團。