本發(fā)明屬于禽類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種胚蛋內(nèi)注射膽汁酸促進出殼仔雞生長的方法。
背景技術(shù)：
生理調(diào)節(jié)劑是為了某些特殊需要，人為地給予動物一些具有不同用途的物質(zhì)，其作用是促進禽類生長發(fā)育、預(yù)防疾病、提高飼料的利用率和肉產(chǎn)品的質(zhì)量等。家禽能夠在較短生產(chǎn)周期內(nèi)以較低的成本生產(chǎn)出營養(yǎng)豐富的肉產(chǎn)品，為人類主要的動物蛋白食品來源。因此，通過生理調(diào)節(jié)劑的使用，提高禽類肌肉生長潛力一直都是養(yǎng)禽業(yè)追求的重要目標(biāo)。
總膽汁酸的組成有鵝脫氧膽酸(chenode-oxycholicacid，cdca)、石膽酸(lithocholicacid，lca)、脫氧膽酸(desoxycholicacid，dca)和膽酸(cholicacid，ca)等，其中cdca含量最多。研究表明膽汁酸對于家禽出殼后的生長發(fā)育以及代謝等有著重要的影響。
然而，膽汁酸對禽類胚胎的生長發(fā)育影響研究還未見有報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了探討膽汁酸，尤其是鵝脫氧膽汁酸，對禽類胚胎的影響。本發(fā)明采用胚蛋直接注射鵝脫氧膽汁酸的方法，研究其對雞16胚齡(e16)、岀殼當(dāng)天(doh)、42日齡(d42)時肌肉發(fā)育的影響，試圖了解胚蛋注射膽汁酸是否能促進子代生長，最終影響肉雞的骨骼肌發(fā)育，對生產(chǎn)實踐提供可靠依據(jù)。
本發(fā)明的目的是提供一種胚蛋內(nèi)注射膽汁酸促進出殼仔雞生長的方法。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，胚蛋直接注射鵝脫氧膽汁酸，能夠促進雞胚的肌肉發(fā)育及出殼后雞的生長，提高出殼后雞的體重。
具體地，胚蛋直接注射膽汁酸能夠顯著改善雞腿肌和胸肌的肌纖維分布，促進腿肌和胸肌的成肌生長因子mrna的表達(dá)，提高出殼后雞的體重和胸肌率、腿肌率。胚蛋注射膽汁酸能夠上調(diào)核心蛋白多糖(decorin)的表達(dá)，進而通過調(diào)節(jié)成肌因子的表達(dá)促進骨骼肌纖維的發(fā)育，提高肉雞的產(chǎn)肉能力。
本發(fā)明為膽汁酸在雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了一種新的方式，即胚蛋直接注射。
本發(fā)明也為雞養(yǎng)殖業(yè)提供了一種增產(chǎn)、增加養(yǎng)殖效益的新方法，即通過胚蛋直接注射膽汁酸的方式，促進雞胚的肌肉發(fā)育及出殼后雞的生長，提高雞養(yǎng)殖效益。
因此，膽汁酸在促進雞胚的發(fā)育和/或促進出殼后雞的生長方面的應(yīng)用，以及在制備促進雞胚的發(fā)育和/或促進出殼后雞的生長的生理調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選地，所述膽汁酸為鵝脫氧膽汁酸。
其中，所述促進雞胚的發(fā)育是指促進雞胚的肌肉發(fā)育。
更具體地，所述促進雞胚的肌肉發(fā)育是促進腿肌和胸肌的成肌生長因子mrna的表達(dá)。
所述促進出殼后雞的生長是指促進出殼后雞的腿肌和胸肌的成肌生長因子mrna的表達(dá)和/或改善雞腿肌和胸肌的肌纖維的分布。
另外，所述飼料添加劑還是能夠上調(diào)核心蛋白多糖(decorin)的表達(dá)，進而通過調(diào)節(jié)成肌因子的表達(dá)促進骨骼肌纖維的發(fā)育，提高肉雞的產(chǎn)肉能力的飼料添加劑。
一種胚蛋內(nèi)注射膽汁酸促進出殼仔雞生長的方法，是將膽汁酸，優(yōu)選為鵝脫氧膽汁酸，注射入雞胚中。具體是注射入種蛋中。
優(yōu)選地，所述注射的時間為種蛋孵化至3胚齡時。所述3胚齡為種蛋入孵后72小時。
優(yōu)選地，所述膽汁酸為用dmso溶解、用pbs稀釋成的膽汁酸注射液，注射液中膽汁酸的濃度為5～15ng/μl。
更優(yōu)選地，注射液中膽汁酸的濃度為10ng/μl。
優(yōu)選地，所述膽汁酸注射液的注射劑量標(biāo)準(zhǔn)為：40～60μl。
更優(yōu)選地，所述膽汁酸注射液的注射劑量標(biāo)準(zhǔn)為：50μl。
具體地，所述胚蛋內(nèi)注射膽汁酸促進出殼仔雞生長的方法，包括如下步驟：
s1.制備注射液：用dmso溶解膽汁酸配成溶度為0.1μm的母液，再用pbs將母液稀釋成5～15ng/μl的注射液；
s2.種蛋孵化至3胚齡時，將40～60μl注射液注射到種蛋內(nèi)，繼續(xù)孵化。
其中，優(yōu)選地，步驟s2所述孵化的條件為：溫度37.9℃，濕度60％rh，翻蛋周期2h，翻蛋時間180s，換氣周期2h，換氣時間30s。
步驟s2中所述3胚齡是指：種蛋入孵后24h設(shè)定為1胚齡；種蛋入孵后72小時為3胚齡。
優(yōu)選地，步驟s2所述注射的具體方法為：在種蛋的小頭開孔注射(孔越小越好，能保證針頭刺入即可)，然后用組織膠水封口，繼續(xù)孵化。
另外，一種包含有膽汁酸(優(yōu)選為鵝脫氧膽汁酸)的雞胚(種蛋)注射制劑也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
該包含有膽汁酸的注射制劑能夠促進雞胚的發(fā)育和/或促進出殼后雞的生長。具體是促進雞胚的肌肉發(fā)育，促進出殼后雞的腿肌和胸肌的成肌生長因子mrna的表達(dá)和/或改善雞腿肌和胸肌的肌纖維的分布，上調(diào)核心蛋白多糖(decorin)的表達(dá)，進而通過調(diào)節(jié)成肌因子的表達(dá)促進骨骼肌纖維的發(fā)育，提高肉雞的產(chǎn)肉能力。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并公開了膽汁酸直接注射到胚蛋中，能夠顯著促進雞胚的肌肉發(fā)育和出殼后雞的生長，且對禽類的生長無毒無害，可以有效提高禽類的市場價值。
本發(fā)明以胚蛋直接注射膽汁酸的方式，過程方便快捷，無特殊設(shè)備要求，為膽汁酸在雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了一種新的方式，即胚蛋直接注射；也為雞養(yǎng)殖業(yè)提供了一種增產(chǎn)、增加養(yǎng)殖效益的新方法，具有很好的推廣應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為胚蛋注射基本操作流程。
圖2為胚蛋注射cdca對出殼雞胸肌率和腿肌率的影響圖。
圖3為胚蛋注射cdca對16胚齡、出殼當(dāng)天和42日齡雞腿肌纖維直徑的影響圖。
圖4為胚蛋注射cdca對16胚齡、出殼當(dāng)天和42日齡雞腿肌成肌相關(guān)因子的表達(dá)影響圖。
具體實施方式
以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
實施例1胚蛋注射cdca對孵化后雞體重、腿肌率和胸肌率的影響
1、為了研究胚蛋注射膽汁酸對子代雞生長及肌肉發(fā)育的直接作用，我們設(shè)計了胚蛋注射的試驗。
具體地，胚蛋注射的方法，包括以下步驟：
(1)選取240枚蛋重在55±5g范圍的純種隱性白洛克種蛋(溫氏種雞場提供)，在相同的條件下進行常規(guī)孵化。
孵化前，把種蛋隨機分為四組，分別為pbs組、dmso組、低劑量cdca組和高劑量cdca組，進行稱重、消毒和編號。
(2)將(1)收集的種蛋在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物分子營養(yǎng)研究室用科裕mfp微電腦自動孵化機進行孵化。
孵化條件：溫度37.9℃，濕度60％rh，翻蛋周期2h，翻蛋時間180s，換氣周期2h，換氣時間30s。種蛋入孵后24h設(shè)定為1胚齡，出雛當(dāng)天doh(dayofhatch)。
(3)制備注射劑：用dmso溶解鵝脫氧膽汁酸粉劑(sigma公司購)，配成溶度為0.1μm的母液，再用pbs將母液cdca稀釋成注射液。
具體實驗組如下：
低劑量注射液：500ngcdca/50μlpbs(dmso終濃度為0.5‰)；
高劑量注射液：1000ngcdca/50μlpbs(dmso終濃度為0.5‰)。
陰性對照組：0.5‰dmso/50μlpbs；
空白對照組：50μlpbs。
(4)將(3)制備的注射劑注射到s1收集的種蛋內(nèi)，注射時間定為種蛋孵化至3胚齡時。3胚齡為種蛋入孵后72小時。
胚蛋注射過程如圖1所示：分別小頭敲孔注射50μl的pbs(空白對照組)、dmso/pbs混合溶劑(陰性對照組)、500ngcdca/50μlpbs溶液(低劑量cdca組)、1000ngcdca/50μlpbs溶液(高劑量cdca組)，然后用組織膠水封口后，繼續(xù)進行孵化，出雛后在相同條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)程序飼養(yǎng)至42日齡。
試驗飼糧組成見表1。
表1試驗日糧組成和營養(yǎng)水平
注：*提供至每千克全價料：銅，5.00mg；鐵，69.00mg；鋅，84.00mg；錳，98.6mg；碘，1.14mg；
硒，0.30mg；維生素a，15000iu；維生素d3，3000iu；維生素e，25.5mg；維生素k3，2.1mg；
維生素b1，2.4mg；維生素b2，9mg；維生素b6，5.1mg；維生素b12，0.02mg；泛酸鈣，12mg；
煙酸，48mg；葉酸，1.2mg；生物素，0.06mg；洛克沙胂，50mg；鹽霉素，90mg。
2、組織采樣
16胚齡時隨機選取10枚正常種蛋，稱胚重、肝臟重，采集左腿腿肌放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存，留作分子試驗研究；采集右腿腿肌液氮固定后留作he染色法的組織形態(tài)學(xué)測定。
出殼當(dāng)天(doh)隨機選取10只正常的雛雞，稱重后斷頸處死；采集左腿胖腸肌，稱重后裝入2mlep管中，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存，留作分子試驗研究；采集右腿腓腸肌，切面與肌纖維走向垂直，修成0.5cm×0.5cm×0.3cm的組織塊，自然鋪于紙板上，立即以液氮固定后裝入5mlep管中，留作he染色法的組織學(xué)測定。
雛雞出殼后飼養(yǎng)至42天，稱重后斷頸處死，頸靜脈采血，以3000rpm離心5min，取血清置于-20℃冰箱中凍存；采集肝臟、胸肌、腿肌稱重；采集左腿腓腸肌，稱重后裝入2mlep管中，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存，留作分子試驗研究；采集右腿腓腸肌，切面與肌纖維走向垂直，修成0.5cm×0.5cm×0.3cm的組織塊，自然鋪于紙板上，立即以液氮固定后裝入5mlep管中，留作he染色法的組織學(xué)測定。
胚蛋注射cdca孵化出雛后，監(jiān)測肉雞體重的變化。
3、結(jié)果如表2和圖2。
表2胚蛋注射cdca對肉雞平均體重的影響
注：小寫字母不同代表差異顯著(p<0.05)。0天：(n＝32)，7至42天:(n＝22)。
胚蛋注射高劑量的cdca顯著提高雛雞doh時的體重；標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一飼養(yǎng)一周后，注射cdca組的雛雞體重有所下降；飼喂五周后，注射低劑量cdca組體重顯著高于其它組，并且這一趨勢維持到第六周。
研究結(jié)果表明，胚蛋注射低劑量cdca能夠顯著促進出殼后雞的生長和體重增加，顯著提高胸肌率和腿肌率。
實施例2胚蛋注射cdca對腿肌肌纖維的發(fā)育以及成肌相關(guān)因子mrna表達(dá)的影響
1、為了研究胚蛋注射cdca對腿肌組織肌纖維分布以及成肌相關(guān)因子的影響，進行了肌纖維切片h&e染色試驗。
2、結(jié)果如圖3和圖4：試驗結(jié)果表明，胚蛋注射低劑量的cdca顯著提高e16和doh時單位面積腿肌肌纖維數(shù)目，高劑量cdca顯著增加d42時肉雞肌纖維直徑。胚蛋注射cdca能夠上調(diào)decorin的表達(dá)，進而通過調(diào)節(jié)成肌因子的表達(dá)促進骨骼肌纖維的發(fā)育，提高肉雞的產(chǎn)肉能力。