微生物處理工業廢棄物的方法和發酵生產微生物油脂的方法及其專用菌株的制作方法

專利名稱：微生物處理工業廢棄物的方法和發酵生產微生物油脂的方法及其專用菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物應用領域，特別是涉及一種微生物處理工業廢棄物的方法，以 及利用工業廢棄物(如淀粉、味精、造紙等工業生產廢水和/或醬渣等發酵工業廢渣) 發酵生產微生物油脂的方法及其專用菌株。
背景技術：
隨著工業現代化進程的加速發展，工業廢水的排放量也在不斷增加，并造成
嚴重的環境污染。目前，我國淀粉廢水每年的產量約達2400萬噸，高濃度味精廢 水的產量每年達2500萬噸以上，其中，2005年造紙工業廢水的排放量達36. 7億 噸。這些工業廢水的共同特點是含有大量有機物質，因而COD很高， 一般可達幾 萬。如果將這些廢水用污水處理系統進行處理，不但負擔重，而且會造成有機糖 質資源的浪費。
目前，國內外對工業廢水的主要處理方法有絮凝沉淀法、生物法、結合法、 光合細菌降解有機物和多種微生物協同處理法等。如岑超平對木薯淀粉黃漿水， 先用石灰乳中和，再用進口高分子絮凝劑N-0P、 650BC、 AN絮凝，該法的COD去除 率能達到60.0 99.3% (岑超平，木薯淀粉廢水的絮凝法處理.上海環境科學， 2001， 20(1): 31 32);南開大學公開了 "高效絮凝處理淀粉廢水的復合菌制劑 及其制備"的方法(專利申請號ZL 200510014582. X);桂林工學院公開了 "木薯 淀粉生產廢水生物處理組合工藝"(專利申請號ZL 200510113154. 2);席淑淇 等把淀粉廢水酸化后，調節pH，添加Fe"，用該法處理的廢水可作為光合細菌的培 養液，C0D去除率達70X以上(席淑淇等，利用廢水生產光合細菌提取天然色素的 研究.污染防治技術，1997， 10(2): 65 67)。目前，上述廢水處理方法在實際 中都有應用，并取得了一些成果，但也都存在一些問題，如絮凝沉淀法去除效率 較低；生物處理法占地面積大，能耗大，投資費用和運行費用高，且受廢水的水 溫、pH和有毒物質等環境條件影響較大；光合細菌法對溫度變化敏感，運行費用 較高，且管理不便。
另外，也有人提出利用某種發酵廢棄物或綜合利用多種混合廢棄物生產飼料 蛋白、膳食纖維和醋等的方法，如Yang等利用味精廢水混合培養粘紅酵母和假絲 酵母發酵生產飼料蛋白(丄Z. Yang， etl. Production of microbial protein feed
from monosodium glutamate wastewater by fermentation,Techniq Equip Environ Pollut Control 2002， 3: 21-24) ; 2005年，日本熊本縣工業技術中心 成功地從醬油渣中提取出膳食纖維，纖維含量達80%;甘肅省科學院生物研究所公 開了 "利用淀粉、檸檬酸的生產廢水、廢渣進行食醋生產的方法"(專利申請號 ZL 200510041889. 9)。諸如此類的方法比較符合可持續發展的社會策略，但是因 其所得產品屬于食品級，因而有可能涉及到潛在的食用安全問題。
目前，國內外有關微生物油脂的研究主要集中在以下方面開發利用微生物 油脂進行功能性油脂的生產(如利用深黃被孢霉生產Y-亞麻酸)以及利用高濃度 葡萄糖生產微生物油脂(Papanikolaou S， etl. Single cell oil (SCO) production by ifor".ere77a i5^eJh'"a grown on high-sugar content media. Biores Technol 2004， 95:287 - 91;趙宗保等，圓紅冬孢酵母菌發酵產油脂培養基及發 酵條件的優化研究，生物工程學報，2006， 22 (4) : 650-656)。另外，微生物 油脂也被認為是供給生物柴油的潛力原料油脂(趙宗保.加快微生物油脂研究為 生物柴油產業提供廉價原料.中國生物工程雜志，2005， 25 (2) : 8-11)，如清 華大學張建安等公開了以1-20%的葡萄糖為底物，微生物發酵油脂及其用于制備 生物柴油的方法(專利申請號CN200610113582. X)。
生物柴油是可再生燃油脂肪酸短鏈酯，如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等，屬于 清潔能源。但是，目前生物柴油的生產原料多采用植物油脂和少量動物油脂，如 李搏公開了以動植物油脂、酸敗了的動植物油脂、回收的各種煎炸油或潲水油為 原料生產生物柴油的方法(專利申請號200510200025.7);梁杉垣公開了按重量 百分比由菜籽油60 85、松節油10 30、鏈烷烴4 10及添加劑二茂鐵0. 2 0. 5 制成生物柴油的方法(專利申請號200410026584. 6)。但是，以動、植物油為原 料生產生物柴油的成本太高，占生產總成本的75%以上，而且大量種植含油植物 也存在和農業爭地的問題。微生物油脂雖然解決了與農業爭地這一問題，但是若 仍然以高濃度葡萄糖等為發酵原料的話，成本問題還不能夠得到有效解決。

發明內容
本發明的目的之一是提供一株可利用工業廢棄物(如淀粉、味精、造紙等工業生 產廢水和/或醬渣等發酵工業廢渣)發酵生產微生物油脂，且產量較高的粘紅酵母菌 株。
本發明所提供的粘紅酵母(朋W"orah ^7w"/7A)為以下菌株之一
1) 粘紅酵母朋.g(朋Oi/"OrWa ^W"/7&)經一次或多次微波誘變得到的菌株；
2) 粘紅酵母肋.g (朋od"o/7/J3 ^wf眾i's)經UV、 EMS、或LiCl與微波誘變復合誘變得到的菌株；和
3)粘紅酵母朋.g (朋oo^on/^ WWi/LZ's) CGMCC No. 2258。該菌株已于2007 年11月22日保藏于位于中國北京市朝陽區大屯路的中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 2258。
粘紅酵母Rh. g CGMCC No.2258菌株具有以下特征菌落呈粘質狀，細胞為圓形 或卵形，因培養條件變化有時還會呈長形甚至假絲狀，外壁光滑，其特點是有明顯的 紅色或偏黃色。該菌株在麥芽汁培養基(MEA)上生長較快，在酵母培養基(葡萄糖 20%，酵母膏0.4%，尿素0.2%，瓊脂2%， pH=4. 5-5. 0)生長較有利于產脂。 該菌株生長的溫度范圍為8-45'C，最佳為25-30°C。該菌株在pH l-ll之間均可以生 長，適宜pH值為5-8。此外，該菌株具有耐鹽性高(30-50g/L)，油脂含量高(30-70 %)，以及降解廢水COD能力較強(40-90%)的特性。
本發明的第二個目的是提供一種利用工業廢棄物(如淀粉、味精、造紙等工業生 產廢水和/或醬渣等發酵工業廢渣)發酵生產微生物油脂的方法。
本發明所提供的發酵生產微生物油脂的方法，包括以下步驟
1) 將以上粘紅酵母菌株接種到種子液培養基中，在25-3(TC下培養24-30小時， 得到種子液；所述種子液培養基配方為葡萄糖3-5g，(NH4)2S04 0.1-0 . 3g， KH2P04 0. 5-0.9g， Na2S04 0. 1-0. 3g， MgS04 7H20 0. 1-0. 2g，酵母粉0. 1-0. 2g，用水定容至 lOOmL， pH 5-6;
2) 將步驟l)獲得的粘紅酵母種子液接種到發酵培養基中，在25-4(TC下培養 48-180小時；所述發酵培養基的制備方法為先去除工業生產廢水中的不溶性顆粒， 再調節pH值至5-6，滅菌，得到發酵培養基；
3) 發酵后處理收集步驟2)經發酵的粘紅酵母菌體細胞，再將菌體細胞烘干和 粉碎后，提取油脂，得到微生物油脂。
上述發酵生產微生物油脂的方法中所用的發酵菌株可為任意誘變后的粘紅酵母 菌株，特別是粘紅酵母(朋o^&27L/a ^iw"/2") CICC No. 1725或CICC No. 1691經 微波誘變或復合誘變后菌株，優選為本發明的粘紅酵母Rh.g CGMCC No.2258菌株。
所述誘變是指對普通的粘紅酵母進行一次或多次微波誘變，或UV、 EMS、或LiCl 與微波誘變結合進行復合誘變。
步驟l)中優選的粘紅酵母種子液培養基配方為葡萄糖4g， (NH4)2S04 0. 2g， KH2P04 0. 7g， Na2S04 0.2g， MgS04 7H20 0. 15g，酵母粉0. 15g，用水定容至lOOmL， pH 5. 5。
步驟2)中粘紅酵母種子培養液的接種量優選為10-15% (V/V)。所述制備發酵 培養基所用的工業生產廢水的選擇是多種多樣的，如淀粉、味精和造紙等廢水中的
一種或幾種的混合液，混合比例可根據實際需要任意選擇。可用離心沉降的方法去 除工業生產廢水中的不溶性顆粒。
此外，所述發酵培養基中還可再添加發酵工業廢渣至其質量/體積(g/dL)百
分濃度達1-4%;所述發酵工業廢渣的選擇也是多種多樣的，如醬渣、高粱秸稈渣 汁和甘蔗渣等中的一種或幾種的混合物，混合比例可根據實際需要任意選擇。所述發 酵工業廢渣在添加前，最好先將其研磨細碎。
為提高油脂產率，所述發酵培養基中還可再添加淀粉廠葡萄糖廢母液至葡萄糖
在發酵培養基中質量/體積百分濃度為1-4%的。
為提高提高菌體的生長速率，在上述粘紅酵母的發酵培養過程中可對其進行振蕩
培養，所述步驟l)中種子液培養的振蕩速率為100-180rpm，步驟2)中發酵培養的 振蕩速率為150-400rpm。
此外，為獲得更好的培養效果，步驟l)中在對粘紅酵母菌種進行種子液培養前 可先對其進行活化，具體方法為將保藏的斜面粘紅酵母菌種在28-3(TC下活化3-12 小時。
步驟3)中對菌體細胞進行烘干和粉碎后，可用常規方法提取油脂。 用上述方法得到的微生物油脂也屬于本發明的保護范圍。
本發明另一目的是提供一種處理工業廢棄物的方法，是將淀粉、味精、造紙 的工業生產廢水和/或醬渣作為發酵培養基，將所述粘紅酵母菌株接種其上按上述 過程進行發酵。
本發明還一目的是通過利用上述得到的微生物油脂來制備生物柴油。制備生 物柴油可采用現有文獻介紹的方法進行，只是本發明的油脂原料使用的為本發明 利用工業廢棄物得到的微生物油脂。
本發明主要是利用工業廢棄物(如淀粉、味精、造紙等工業生產廢水和/或醬渣 等發酵工業廢渣)為培養基，發酵經誘變的粘紅酵母(y 力o^forw^ ^w""A)來生 產微生物油脂。其中淀粉、味精、造紙等工業生產廢水中殘留的銨鹽及氨基酸，以 及醬渣等發酵工業廢渣中殘留的蛋白質可作為供粘紅酵母生長所需的氮源；此外， 淀粉、味精、造紙等工業生產廢水，以及醬渣等發酵工業廢渣中含有的還原糖和木 質、纖維素等可作為粘紅酵母合成油脂及生長所需的碳源。用本發明的方法發酵 生產微生物油脂，既可以獲得較高的油脂含量，并可以獲得較高的廢水C0D降解 率，從而對發酵用廢水起到凈化作用，實踐證明利用粘紅酵母單獨處理味精廢 水和淀粉廢水的C0D降解率均能達到40-90%，生物量可達10-40g/L，油脂含量 達20-30%;利用醬渣和造紙廢水的混合液在補加葡萄糖母液的條件下的生物量
可達30-80g/L，油脂含量達到30-70%， COD降解率達40-80% ;利用味精廢水和
造紙廢水的混合液在流加葡萄糖母液的條件下的生物量達30-100g/L，油脂含量
達30-50%, COD降解率達40-80%。此外，還可以本發明方法獲得的微生物油脂
為原料油脂制備生物柴油，轉化率可達80-99%。本發明微生物油脂的生產方法
具有操作簡單、成本低廉和實用價值高的優點，既能減少淀粉、味精、造紙、醬 油等發酵行業排放的高濃度廢棄物(廢水、廢渣)對環境的污染，又能變廢為寶
生產當前市場上的緊缺產品一油脂，達到了廢棄物資源化利用的目的，具有重大 的經濟和社會效益。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為本發明發酵生產微生物油脂方法的工藝流程簡圖。
圖2為本發明發酵生產微生物油脂方法的C0D降解率及生物量和油脂含量統計結果。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有培養基中的溶劑均為水。
實施例1、粘紅酵母Rh. g CGMCC No. 2258菌株的獲得
通過UV、 EMS、 LiCl及微波等多種誘變手段和各種誘變技術復合使用得到系列誘 變粘紅酵母菌(朋oflfo&rf^3 W"&A)菌株，其中篩選出最優一株命名為粘紅酵 母Rh.g，具體誘變過程包括以下方法和步驟
1) UV誘變將粘紅酵母(朋OGfo"/Y/7a CICCNo.1725 (購買于中 國食品發酵工業研究所)的種子液培養24-30h后稀釋10M咅后，涂布于酵母固體平板 培養基(葡萄糖20%，酵母膏0.4%，尿素0.2%，瓊脂2%， pH4.5)后，分別 在功率為15W、照射距離為30cm的紫外燈管下照射10-600s時間后，在28-3(TC下避 光培養3-5天后檢査菌落生長情況并進一步搖瓶發酵篩選較優菌株。
2) EMS誘變將粘紅酵母(^oa^on/7a ^7〃W/ h) CICC No. 1725 (購買于 中國食品發酵工業研究所)種子液培養24-30h濃縮2-5倍，無菌水洗滌后，在5mL 的0.2M磷酸緩沖液(pH7.2)體系中加入0. 1-0. 5mol/L劑量的EMS反應10-60min時 間后用硫代硫酸鈉終止反應，然后稀釋105-106涂布于酵母固體平板培養基(葡萄糖 20%，酵母膏0.4%，尿素0.2%，瓊脂2%， pH4.5)上，在28-30。C下培養3-5 天后檢查菌落生長情況并進一步搖瓶發酵篩選較優菌株。
3) LiCl誘變將粘紅酵母(朋oflfo^r"7a ^Zw"'"is) CICC No. 1725 (購買于
中國食品發酵工業研究所)種子液培養24-30h后稀釋105倍后，涂布于已經含有 0. 2-0. 6y。劑量LiCl的酵母固體平板培養基(葡萄糖20%，酵母膏0.4%，尿素0.2%， 瓊脂2%， pH4.5)后，在28-3(TC下培養3-5天后檢查菌落生長情況并進一步搖瓶 發酵篩選較優菌株。
4) 微波誘變將粘紅酵母(媯oo^orw7a ^ w"/2") CICC No. 1725 (購買于 中國食品發酵工業研究所)種子液培養24h后稀釋10"咅后，涂布于酵母固體平板培 養基(葡萄糖20%，酵母膏0.4%，尿素0.2%，瓊脂2%， pH4.5)后，在220V/50Hz 額定電壓和額定頻率、1200W/750W額定輸入和輸出功率、或2450MHz額定微波頻率的 微波爐里處理5 60s，或多次微波組合處理(總時間不超過60s)后，在28'C下培養 3-5天后檢查菌落生長情況并進一步搖瓶發酵篩選較優菌株。
5) 復合誘變任意將前述l) 、 2) 、 3) 、 4)的2-4種誘變方法依次應用， 即將某一方法誘變篩選出的較優菌株使用另一種方法再次誘變，或多次使用其它方法 多次誘變，每次誘變后再在2^C下培養3-5天后檢査菌落生長情況并進一步搖瓶發酵 得到系列更優中間菌株。
從以上中間菌株中進一步篩選，最終獲得一株粘紅酵母菌菌株，該菌株為依次經 過l) 、 2)和4)三種方法復合誘變得到的最優菌株。該最優的粘紅酵母菌
(勱oo^z^r〃7a ^〃z^'/2k)菌株，命名為粘紅酵母Rh. g，該株菌已于2007年11月 22日保藏于位于中國朝陽區大屯路的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏編號為CGMCC N0.2258。經鑒定，該菌株具有以下特征菌落呈粘質狀，細 胞為圓形或卵形，因培養條件變化有時還會呈長形甚至假絲狀，外壁光滑，其特點是 有明顯的紅色或偏黃色。該菌株生長的溫度范圍為8-45。C，最佳為25-3(TC。該菌株 在pH l-ll之間均可以生長，適宜pH值為5-8。此外，該菌株還具有耐鹽性高
(30-50g/L)，油脂含量高(30-70%)，降解廢水COD能力較強(40-90%)的特 性。
需要說明的是，本實施例在篩選菌株時，基本以油脂含量以及降解廢水COD 能力為評判標準，檢測數值越高則菌株評價越好。該實施例獲得了最優的粘紅酵 母Rh.g CGMCC No.2258菌株，同時也獲得了一系列較好的中間菌株，尤其是本發明 獨創的使用微波誘變的中間菌株，無論是其單獨誘變還是與其它誘變手段組合誘變， 獲得的中間菌株也具有非常好的應用效果。這些中間菌株也屬于本發明。
實施例2、用醬渣和造紙廢水的混合液在補加葡萄糖母液的條件下生產微生物油
脂種子液培養基配方:葡萄糖4g， (NH4)2S04 0 . 2g， K職0.7g， Na2S04 0 . 2g， MgS04 7H20 0. 15g，酵母粉0. 15g，用水定容至100mL， pH 5. 5。
發酵培養基的制備將造紙廢水(造紙廢水含有大量木質素和半纖維素等降解 產物、色素、戊糖類、殘堿及其它溶出物，廢水水質為COD=106000 157000mg/L， B0D=34500 42500mg/L， SS=23500 27800mg/L， pH=ll 13。)離心沉降去除不 溶性顆粒后，添加葡萄糖母液(葡萄糖母液為淀粉廠生產葡萄糖的廢液，主要成分為 葡萄糖，濃度為400 500g/l)至葡萄糖含量2X (g/dL)，另添加至2% (g濕重/dL， 1-4%均可)研磨細碎后的醬渣(醬渣含水量大66. 14%,含有粗蛋白含量2-26.4 %，粗纖維含量15.14%。)，用鹽酸調節pH值至5-6，滅菌待用。
用本發明的方法發酵生產微生物油脂，其流程圖如圖l所示，具體方法包括以下 步驟
1) 菌種活化將保藏的斜面粘紅酵母菌種W力.《CGMCC No.2258在28"C下活化
12h;
2) 用接種針刮一環步驟l)經活化的斜面粘紅酵母菌種W力.^ CGMCC No. 2258， 將其接種于50mL無菌的種子液培養基中，在25。C、 140rpm下振蕩培養30小時，得 到種子液；
3) 發酵培養按10% (V/V)的接種量，將步驟2)獲得的粘紅酵母朋.gCGMCC No.2258種子培養液接種到發酵培養基中，在25t:、 150rpm下振蕩下培養120小時；
4) 發酵后處理發酵結束后，離心收集發酵菌體細胞，烘干、研磨后用索氏提 取法(GB/T 5009.6—1985)提取微生物油脂。
經檢測，用上述方法得到的油脂含量占細胞干重的62%， C0D降解率達50X以上。
實施例3、用味精廢水在添加葡萄糖母液的條件下生產微生物油脂 種子液培養基配方葡萄糖3g，(NH4)2S04 0. lg， KH2P04 0 . 5g， Na2S04 0. lg， MgS04 7H20 0. lg，酵母粉0. lg，用水定容至100mL， pH 6。
發酵培養基的制備將味精廢水(味精廢水母液是一種低酸性高濃度有機廢水， 廢水水質為COD=50000 70000mg/L， BOD5=25000 35000mg/L， N-NH3= 800010000mg/L，含谷氨酸約l. 5%， pH=2 3。)離心沉降去除不溶性顆粒后，添加葡 萄糖母液至葡萄糖濃度4%，用K0H調節pH值至5-6，滅菌待用。 用本發明的方法發酵生產微生物油脂，具體方法包括以下步驟 1)菌種活化將保藏的斜面粘紅酵母菌種欣.g CGMCC No.2258在3(TC下活化
6h;
2) 用接種針刮一環步驟l)經活化的斜面粘紅酵母菌種W力.g CGMCC No. 2258， 將其接種于50mL無菌的種子液培養基中，在3(TC、 100rpm下振蕩培養24小時，得 到種子液；
3) 發酵培養按12% (V/V)的接種量，將步驟2)獲得的粘紅酵母朋.g CGMCC No.2258種子培養液接種到發酵培養基中，在4(TC、 400rpm下振蕩下培養48小時；
4) 發酵后處理發酵結束后，離心收集發酵菌體細胞，烘干、研磨后用索氏提 取法(GB/T 5009.6—1985)提取微生物油脂。
經檢測，用上述方法得到的油脂含量占細胞干重的30-50%。每天跟蹤監測發酵 培養對廢水處理的情況，COD降解率達45%以上。
實施例4、用淀粉廢水在添加葡萄糖母液的條件下生產微生物油脂 種子液培養基配方葡萄糖5g，(NH4)2S04 0 . 3g， KH2P04 0 . 9g， Na2S04 0 . 3g， MgS(WH20 0 . 2g，酵母粉0.2g，用水定容至100mL， pH 5。
發酵培養基的制備將淀粉廢水(淀粉廢水主要含淀粉，還富含葡萄糖、果糖 和麥芽糖等糖類物質，另外還含有蛋白質、纖維素以及氮、磷等無機物。廢水水 質為C0Dcr=10000 20000mg/L， BOD5=5000mg/L， SS=1000mg/L， pH=5。)離心 沉降去除不溶性顆粒后，添加葡萄糖母液至葡萄糖濃度3%，用K0H調節pH值至5-6， 滅菌待用。
用本發明的方法發酵生產微生物油脂，具體方法包括以下步驟
1) 菌種活化將保藏的斜面粘紅酵母朋.g CGMCC No. 2258在29"下活化9h;
2) 用接種針刮一環步驟l)經活化的斜面粘紅酵母7%. g CGMCC No. 2258，將其 接種于50mL無菌的種子液培養基中，在28t:、 180rpm下振蕩培養28小時，得到種 子液；
3) 發酵培養按15% (VA)的接種量，將步驟2)獲得的粘紅酵母y 力.^CGMCC No.2258種子培養液接種到發酵培養基中，在3(TC、 180rpm下振蕩下培養72-120小 時；
4) 發酵后處理發酵結束后，離心收集發酵菌體細胞，烘干、研磨后用索氏提 取法(GB/T 5009.6—1985)提取微生物油脂。
經檢測，用上述方法得到的油脂含量占細胞干重的30%。每天跟蹤監測發酵培養 對廢水處理的情況，結果在發酵72h后COD減少了 85%以上。
實施例5、用味精廢水和造紙廢水混合液在添加葡萄糖母液的條件下生產微生物
油脂
種子液培養基配方葡萄糖4.5g， (NH4)2S04 0. 15g， KH2P04 0 . 8g， Na2S04 0 . 25g， MgS04 7H20 0. 18g，酵母粉0. 12g，用水定容至lOOmL， pH 5. 5。
發酵培養基的制備將味精廢水和造紙廢水按l: 1比例混合后離心沉降去除不 溶性顆粒后，添加葡萄糖母液至葡萄糖濃度2%，滅菌待用。
用本發明的方法發酵生產微生物油脂，具體方法包括以下步驟
1) 菌種活化將保藏的斜面粘紅酵母朋.g CGMCC No.2258在28。C下活化10h;
2) 用接種針刮一環步驟l)經活化的斜面粘紅酵母g CGMCC No. 2258，將其 接種于50mL無菌的種子液培養基中，在3(TC、 120rpm下振蕩培養26小時，得到種 子液；
3) 發酵培養按15% (V/V)的接種量，將步驟2)獲得的粘紅酵母處.^CGMCC No. 2258種子培養液接種到發酵培養基中，在28°C 、 200rpm下振蕩下培養72-156小 時；
4) 發酵后處理發酵結束后，離心收集發酵菌體細胞，烘干、研磨后用索氏提 取法(GB/T 5009.6—1985)提取微生物油脂。
因為味精廢水偏酸性，造紙廢水偏堿性，因此設想利用二者的混合廢水培養粘紅 酵母可能減少用于調pH值的堿的用量。結果在發酵過程中，pH值一直在6.0附近波 動，省去了用堿調節pH值的步驟。每天跟蹤監測發酵培養對廢水處理的情況(COD降 解率)及生物量和油脂含量，如圖2所示，發酵84h后，生物量、油脂含量和COD降 解率分別為30.6g/L、 34. 33%和肌39%;發酵156h后，生物量、油脂含量和COD 降解率分別為43. 18g/L、 46. 67 %和53. 04%。
實施例6、用醬渣、高粱秸稈渣汁和味精廢水的混合液在補加葡萄糖母液的條件 下生產微生物油脂
種子液培養基配方葡萄糖4g，(NH4)2S04 0.2g， KH2P04 0 . 7g， Na2S04 0 . 2g， MgS04 7H20 0. 15g，酵母粉0, 15g，用水定容至100mL， pH 5. 5。
發酵培養基的制備將味精廢水離心沉降去除不溶性顆粒后，添加葡萄糖母液至 葡萄糖濃度1%和4% (g濕重/dL， 1-4%均可)研磨細碎后的醬渣和高粱秸稈渣汁 (混合比例1:2)，用鹽酸調節pH值至5-6，滅菌待用。
用本發明的方法發酵生產微生物油脂，具體方法包括以下步驟
l)菌種活化將保藏的斜面粘紅酵母菌種(朋oAtorw7a WwnV^s) CICC No. 1725
(購自中國食品發酵工業研究所)在28'C下活化12h;
2) 用接種針刮一環步驟1)經活化的斜面粘紅酵母菌種(朋oo^o/^a ^/w"'/2J's) CICCNo. 1725，將其接種于50mL無菌的種子液培養基中，在25"C、 180rpm下振蕩培 養30小時，得到種子液；
3) 發酵培養按10% (V/V)的接種量，將步驟2)獲得的粘紅酵母 (勱c^/"an/h ^7"n'"is) CICC No. 1725種子培養液接種到發酵培養基中，在25。C、
250rpm下振蕩下培養140小時；
4) 發酵后處理發酵結束后，離心收集發酵菌體細胞，烘干、研磨后用索氏提 取法(GB/T 5009.6—1985)提取微生物油脂。
經檢測，用上述方法得到的油脂含量占細胞干重的48%。每天跟蹤監測發酵培養 對廢水處理的情況，COD降解率達55% 。
實施例7、用造紙廢水生產微生物油脂
種子液培養基配方葡萄糖5g，(NH4)2S04 0 . 3g， KH2P04 0. 9g， Na2S04 0 . 3g， MgS(WH20 0 . 2g，酵母粉0. 2g，用水定容至100mL， pH 5。
發酵培養基的制備將造紙廢水用HC1調節pH值至5-6，離心沉降去除不溶性顆 粒后，滅菌待用。
用本發明的方法發酵生產微生物油脂，具體方法包括以下步驟
1) 菌種活化將保藏的斜面粘紅酵母菌種W力.gCGMCC No.2258在28。C下活化
9h;
2) 用接種針刮一環步驟l)經活化的斜面粘紅酵母7 力.gCGMCC No. 2258，將其 接種于50mL無菌的種子液培養基中，在28"C、 180rpm下振蕩培養28小時，得到種 子液；
3) 發酵培養按15% (V/V)的接種量，將步驟2)獲得的粘紅酵母朋.gCGMCC No.2258種子培養液接種到發酵培養基中，在28i:、 300rpm下振蕩下培養48-120小 時；
4) 發酵后處理發酵結束后，離心收集發酵菌體細胞，烘干、研磨后用索氏提 取法(GB/T 5009.6_1985)提取微生物油脂。
經檢測，用上述方法得到的油脂含量占細胞干重的25%。每天跟蹤監測發酵培養 對廢水處理的情況，結果在發酵72h后COD減少了 80%以上。
實施例8、生物柴油的制備以實施例2-7獲得的微生物油脂為原料油脂制備生物柴油，具體方法參見:Feiyan Xue, Tianwei Tan， et al. A new method for preparing raw material for biodiesel production./Vocess ^/oc力e/w'5tiT， PW咖e 4/,Zswe 7， /w7y 2卵《尸ages 7699-2W么結果生物柴油獲得的微生物油脂轉化生物柴油的轉化率達80-99% 。
權利要求
1、粘紅酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)誘變菌株，為以下菌株之一1)粘紅酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)經一次或多次微波誘變得到的菌株；2)粘紅酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)經UV、EMS、或LiCl與微波誘變復合誘變得到的菌株；和3)粘紅酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)CGMCC No.2258。
2、 一種處理工業廢棄物的方法，將淀粉、味精、造紙的工業生產廢水和/或 醬渣作為發酵培養基，將權利要求1所述粘紅酵母菌株接種其上進行發酵。
3、 一種發酵生產微生物油脂的方法，包括以下步驟1) 將權利要求1所述的粘紅酵母菌株接種到種子液培養基中得到種子液；2) 將步驟l)獲得的粘紅酵母種子液接種到由工業生產廢水制備得到的發酵培 養基中，發酵培養得到粘紅酵母菌體細胞；3) 收集步驟2)經發酵的粘紅酵母菌體細胞，再將菌體細胞烘干和粉碎后，提取 油脂，得到微生物油脂。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟l)中的粘紅酵母菌株為 粘紅酵母Rh. g (i 力^/otora/a ^ ""'/7/s) CGMCC No. 2258菌株；所述粘紅酵母種子 液培養基配方為葡萄糖3-5g， (NH4)2S04 0. 1-0 . 3g， KH2P04 0. 5-0. 9g， Na2S04 0. 1-0. 3g， MgS04 7H20 0. 1-0. 2g，酵母粉0. 1-0. 2g，用水定容至100mL， pH 5-6;最優配方為 葡萄糖4g， (NH》2S04 0. 2g， KH2P04 0. 7g， Na2S04 0. 2g， MgS04 7H20 0. 15g，酵母粉0. 15g， 用水定容至100mL, pH 5.5;種子液培養條件為25-30。C下培養24-30小時。
5、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中粘紅酵母種子液的 接種量為10-15%;發酵培養條件為25-4(TC下培養48-180小時；所述制備發酵培養 基所用的工業生產廢水為淀粉、味精和造紙廢水中的一種或幾種的混合液；所述發酵 培養基的制備方法為先去除工業生產廢水中的不溶性顆粒，再調節pH值至5-6， 滅菌，得到發酵培養基。
6、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的發酵培養基中 再添加發酵工業廢渣至其質量/體積百分濃度1-4%;所述發酵工業廢渣為醬渣、甘 蔗渣和高粱稈渣中的一種或幾種的混合物。
7、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于在所述步驟l)和步驟2)的培養 過程中進行振蕩培養，步驟l)中種子液培養的振蕩速率為100-180rpm，步驟2)中 發酵培養的振蕩速率為150-400rpm;所述步驟2)中的發酵培養基中再添加葡萄糖母液至葡萄糖的質量/體積百分濃度為1-4%。
8、 根據權利要求3-7任一項所述的方法，其特征在于所述步驟l)中在對粘紅酵母菌種進行種子液培養前還包括對其進行活化的步驟，具體方法為將保藏的斜面粘紅酵母菌種在28-30℃下活化3-12小時。
9、 用權利要求3-8任一項所述方法得到的微生物油脂。
10、 權利要求1所述粘紅酵母菌株和權利要求9所述的微生物油脂在生產生物柴油中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種利用工業廢棄物發酵生產微生物油脂的方法及其專用菌株粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)Rh.g CGMCC No.2258。該方法是一種利用工業廢棄物(如淀粉、味精、造紙等工業生產廢水和/或醬渣等發酵工業廢渣)為培養基，發酵粘紅酵母生產微生物油脂的方法；還可以本發明方法獲得的微生物油脂為原料油脂制備生物柴油，轉化率可達80-99％。本發明微生物油脂的生產方法具有操作簡單、成本低廉和實用價值高的優點，既能減少淀粉、味精、造紙、醬油等發酵行業排放的高濃度廢棄物對環境的污染，又能變廢為寶生產當前市場上的緊缺產品油脂，達到了廢棄物資源化利用的目的。
文檔編號C12N1/16GK101205524SQ20071017999
公開日2008年6月25日 申請日期2007年12月20日 優先權日2007年12月20日
發明者栩 張, 莫夏迪, 薛飛燕, 譚天偉 申請人:北京化工大學