一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗(yàn)方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗(yàn)方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
豬瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國(guó)家和地區(qū)均有發(fā) 生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報(bào) 性疫病，我國(guó)將其劃為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。長(zhǎng)期以來(lái)，豬瘟兔化弱毒活疫苗免疫一直是世界上廣為采用的最有效、經(jīng)濟(jì)的豬 瘟控制方法。我國(guó)研制和使用豬瘟兔化弱毒活疫苗已有近50年歷史，并為世界上許多國(guó)家 豬瘟的控制和消滅做出了重要貢獻(xiàn)。目前，我國(guó)實(shí)行強(qiáng)制免疫豬瘟弱毒活疫苗作為控制豬 瘟的主要手段。疫苗質(zhì)量無(wú)疑是保證豬瘟防控效果的最關(guān)鍵因素，而保證疫苗質(zhì)量的最重 要環(huán)節(jié)是效力檢驗(yàn)，因此效力檢驗(yàn)則是重中之重。根據(jù)已有的方法，豬瘟兔化弱毒活疫苗的 效力檢驗(yàn)可以采用家兔或豬進(jìn)行。用家兔效檢，每批疫苗約需7天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受家兔品種 和個(gè)體差異影響，且勞動(dòng)強(qiáng)度大；用豬效檢，每批疫苗需豬7頭，并且預(yù)先需用兔體中和試 驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行抗體檢測(cè)，耗時(shí)約需3周。由此可見(jiàn)，兩種效檢方法均存在很大不足，亟需 進(jìn)一步改進(jìn)提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗(yàn)方法。本發(fā)明是通過(guò)以下 技術(shù)路線(xiàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的1.建立豬瘟兔化弱毒活疫苗的病毒效價(jià)測(cè)定方法是(1)選擇細(xì)胞系用于測(cè)定疫 苗的病毒效價(jià)；(2)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)將上述細(xì)胞消化并用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種24 孔組織培養(yǎng)板，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞；(3)將疫苗10倍系列稀釋后接種至細(xì)胞培 養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照；(4)病毒吸附后加入維持液在CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天；培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用固定液固定細(xì)胞；(6)用標(biāo)記的豬瘟特異性抗體進(jìn)行免疫染色；(7)觀察 結(jié)果，計(jì)算病毒效價(jià)(TCID5tlA). 1ml)。2.通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)病毒效價(jià)與兔體試驗(yàn)或與豬體試驗(yàn)之間的數(shù)量關(guān)系；3.實(shí)現(xiàn)對(duì)疫苗進(jìn)行體外效力檢驗(yàn)，最終根據(jù)數(shù)量關(guān)系計(jì)算和判定結(jié)果。本發(fā)明的詳細(xì)描述一、試劑、材料1豬瘟病毒參考毒株豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)、豬瘟病毒石門(mén)強(qiáng)毒株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、 保存和提供。2細(xì)胞系
本發(fā)明所用的細(xì)胞系為豬腎細(xì)胞(PK-15或SK-6)、豬睪丸細(xì)胞(ST)、牛腎細(xì)胞 (MDBK)、牛睪丸細(xì)胞(BT)、兔腎細(xì)胞(RK-13)和/或其他豬瘟病毒兔化弱毒株適應(yīng)的細(xì)胞系 中的一種細(xì)胞(均來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，需要按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī) 程》(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程.二〇〇〇年版.化學(xué) 工業(yè)出版社，2001，本發(fā)明以下簡(jiǎn)稱(chēng)《規(guī)程》)和/或《中華人民共和國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥 典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二〇〇五年版三部.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005，本發(fā)明以下 簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)獸藥典》)要求檢測(cè)不含外源病毒。3細(xì)胞培養(yǎng)液90 % 95 % MEM (或DMEM) +5 10 %的胎牛血清(新生牛血清)，pH調(diào)至7. 07. 4。4細(xì)胞維持液98 % MEM (或DMEM) +2 %的胎牛血清(新生牛血清)+雙抗(青霉素和鏈霉素，終濃 度各100IU/ml,以下同)，pH調(diào)至7. 2 7. 4。5稀釋液99 % MEM (或 DMEM) + 雙抗(終濃度各 100IU/ml)。6固定液50%丙酮-甲醇溶液(50%丙酮+50%甲醇)或80%丙酮水溶液(80%丙酮+20% 水)。7 抗體本發(fā)明所涉及的豬瘟特異性抗體為熒光或酶標(biāo)記的豬瘟單克隆抗體、熒光或酶標(biāo) 記的豬瘟多克隆抗體，熒光或酶標(biāo)記的第二抗體(二抗)與豬瘟單克隆抗體或多克隆抗體 聯(lián)用。以上豬瘟多克隆抗體為豬源或兔源。8 DAB 顯色液(1)0. 05M TB :0. 2M Tris-HCl 133ml 力口 NaCl 6. 20g，加去離子水至 400ml，調(diào)至pH 7. 6 ；(2) DAB顯色液=DAB 500mg加入IOOml 0. 05M的TB中(先以少量TB溶解DAB，然
后加入余量TB，充分搖勻)過(guò)濾后備用；(3)顯色前加入30%的H20230 40 μ 1，使其終濃度為0.01%。9實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1. 5 3kg的健康家兔；40 80kg的健康豬，按照《規(guī)程》和/或《中國(guó)獸藥典》 要求檢測(cè)不含豬瘟中和抗體。二、豬瘟兔化弱毒活疫苗的病毒效價(jià)測(cè)定1細(xì)胞培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后加入適量培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種至24孔組織培養(yǎng) 板，每孔400 μ 1，置35 38°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞。2 接毒(1)根據(jù)說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的含量，用MEM或DMEM將待測(cè)疫苗復(fù)溶并稀釋至Iml/頭份；(2)將稀釋好的疫苗懸液10倍系列稀釋至10_5 ；(3)吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；
(4)每個(gè)稀釋度的待測(cè)疫苗懸液以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度重 復(fù)3個(gè)孔，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；(5)稀釋的參考病毒對(duì)照以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地轉(zhuǎn) 動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；(6)在細(xì)胞培養(yǎng)板上留3孔僅加入維持液作為細(xì)胞空白對(duì)照；(7)將接種過(guò)的培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中吸附60min，每IOmin輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板1次 使細(xì)胞避免干燥；(8)吸附完畢后，細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中加入300 μ 1維持液，在35 38°C的CO2培 養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天。3 固定(1)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，倒掉維持液，迅速用PBS輕輕洗滌細(xì)胞，再用去離子水洗滌，風(fēng) 干；(2)在培養(yǎng)板中加滿(mǎn)細(xì)胞固定液，室溫靜置10 20min，棄去固定液，風(fēng)干。4免疫染色下列方法任選其一。(1)直接免疫熒光染色1)在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬瘟熒光抗體，室溫孵育45 60min ；2)在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；3)重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；4)用熒光顯微鏡檢測(cè)每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈蘋(píng)果綠熒 光染色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。(2)間接免疫熒光染色1)在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬瘟抗體，室溫孵育45 60min ；2)在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；3)重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行2次；4)在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育45 60min ；5)在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；6)重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行2次；7)用熒光顯微鏡檢測(cè)每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈蘋(píng)果綠熒 光染色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。(3)直接免疫酶染色1)在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬瘟酶標(biāo)記抗體，室溫孵育45 60min ；2)在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；3)重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；4)在所有培養(yǎng)孔中加入適量DAB顯色液，37°C顯色5 lOmin，鏡下控制顯色程 度，及時(shí)終止；5)在顯微鏡下觀察每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈棕黃色或棕 褐色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。(4)間接免疫酶染色1)在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬瘟抗體，室溫孵育45 60min ；
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2)在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；3)重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行2次；4)在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育45 60min ；5)在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；6)重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行2次；7)在所有培養(yǎng)孔中加入200 μ 1 DAB顯色液，37°C顯色5 lOmin，鏡下控制顯色 程度，及時(shí)終止；8)在顯微鏡下觀察每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈棕黃色或棕 褐色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。5效價(jià)計(jì)算(1)如果有可見(jiàn)的污染或在待測(cè)疫苗所有稀釋度的孔中都出現(xiàn)毒性，則實(shí)驗(yàn)無(wú) 效；(2)陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照成立，則實(shí)驗(yàn)有效，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效；(3)如果實(shí)驗(yàn)有效，則按照《規(guī)程》和/或《中國(guó)獸藥典》中的有關(guān)方法計(jì)算病毒效 價(jià)(TCID50/0. lml)。三、病毒效價(jià)與動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)量關(guān)系測(cè)定1待測(cè)疫苗選擇選擇常用的3種豬瘟兔化弱毒活疫苗，包括淋脾苗、細(xì)胞苗和政府采購(gòu)苗，每種疫 苗均選擇來(lái)源于3個(gè)廠家的不同批次。2病毒效價(jià)測(cè)定、兔體試驗(yàn)和豬體試驗(yàn)(1)病毒效價(jià)測(cè)定按照步驟2進(jìn)行。(2)兔體試驗(yàn)將疫苗稀釋成不同稀釋度，按照《規(guī)程》和/或《中國(guó)獸藥典》中的有 關(guān)方法注射家兔，測(cè)定體溫反應(yīng)。按照出現(xiàn)體溫反應(yīng)的最高稀釋度計(jì)算兔體感染量(RID)。(3)豬體試驗(yàn)將疫苗稀釋成不同稀釋度，按照《規(guī)程》和/或《中國(guó)獸藥典》中的有 關(guān)方法免疫豬和攻毒，計(jì)算半數(shù)保護(hù)量(PD5tl)。3病毒效價(jià)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)量關(guān)系根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表1)，可以推算出兔體15個(gè)TCID5tl相當(dāng)于1個(gè)兔體感染量 (RID)或0. 25個(gè)豬體半數(shù)保護(hù)量(PD50)。表1豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定(1)根據(jù)數(shù)量關(guān)系計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)測(cè)出的病毒效價(jià)(TCID5(i/0. Iml)以及疫苗標(biāo)明的頭份和稀釋情況計(jì)算出每 頭份疫苗的兔體感染量(RID)或豬體半數(shù)保護(hù)量(PD5tl)。(2)結(jié)果判定根據(jù)計(jì)算出的每頭份疫苗的兔體感染量(RID)或豬體半數(shù)保護(hù)量(PD5tl)，及相關(guān) 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，判定該疫苗效力檢驗(yàn)是否合格。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種豬瘟兔化弱毒活疫苗的體外效力檢驗(yàn)方法。本發(fā)明通過(guò)測(cè)定疫 苗的病毒效價(jià)，并根據(jù)病毒效價(jià)與兔體試驗(yàn)(或豬體試驗(yàn))的數(shù)量關(guān)系計(jì)算和判斷疫苗效 力檢驗(yàn)的結(jié)果，從而避免豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗(yàn)常規(guī)方法采用的兔體試驗(yàn)或豬體試 驗(yàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)避免了動(dòng)物品種、飼養(yǎng)狀況、健康狀況等個(gè)體差異的影響，提高了效力檢驗(yàn)結(jié) 果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性；(2)縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，將檢驗(yàn)時(shí)間由10天縮短至4天；(3)減少勞動(dòng)強(qiáng)度，避免了飼養(yǎng)動(dòng)物、觀測(cè)動(dòng)物等長(zhǎng)時(shí)間、高強(qiáng)度勞動(dòng)；(4)降低了檢驗(yàn)成本，避免了動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)、動(dòng)物房占用和人力成本等。
具體實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例11試劑、材料1. 1豬瘟參考病毒豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和提供。1.2細(xì)胞系兔腎細(xì)胞(RK-13)，按照《規(guī)程》檢測(cè)不含外源病毒。
1.3細(xì)胞培養(yǎng)液90% MEM+10%胎牛血清，pH 7. 2。1.4細(xì)胞維持液98% MEM+2%胎牛血清 + 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.5稀釋液99% MEM+ 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.6固定液50%丙酮-甲醇溶液(50%丙酮+50%甲醇)。1.7 抗體豬源豬瘟熒光抗體(由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)。2豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)測(cè)定2. 1細(xì)胞培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后加入適量培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種至24孔組織培養(yǎng) 板，每孔400 μ 1，置37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞。2. 2 接毒2.2. 1根據(jù)疫苗說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的含量，用稀釋液將待測(cè)疫苗復(fù)溶并稀釋至Iml/頭 份；2. 2. 2將稀釋好的疫苗懸液10倍系列稀釋至10_5 ；2. 2. 3吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；2.2.4每個(gè)稀釋度的待測(cè)疫苗懸液以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度 重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；2. 2. 5稀釋的參考病毒對(duì)照以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；2. 2. 6在細(xì)胞培養(yǎng)板上留3孔僅加入維持液作為細(xì)胞空白對(duì)照；2. 2. 7將接種過(guò)的培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中吸附60min，每IOmin輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板1 次使細(xì)胞避免干燥；2. 2. 8吸附完畢后，細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中加入300μ 1維持液，在37°C的CO2培養(yǎng) 箱中靜置培養(yǎng)3天。2. 3 固定2.3. 1培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，倒掉維持液，迅速用PBS輕輕洗滌細(xì)胞，再用去離子水洗滌， 風(fēng)干；2. 3. 2在培養(yǎng)板中加滿(mǎn)細(xì)胞固定液，室溫靜置10 20min，棄去固定液，風(fēng)干。2.4免疫染色2. 4. 1在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬瘟熒光抗體，室溫孵育45 60min ；2. 4. 2在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min,倒掉；2.4.3重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；2. 4. 4用熒光顯微鏡檢測(cè)每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈蘋(píng)果 綠熒光染色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。2. 5效價(jià)計(jì)算
結(jié)果所有孔無(wú)可見(jiàn)污染，并且在待測(cè)疫苗所有稀釋度的孔中均未出現(xiàn)毒性， 并且陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照均成立，實(shí)驗(yàn)有效；按照《規(guī)程》的有關(guān)方法計(jì)算病毒效價(jià)為 1. 5X103TCID50/0. 1ml。3結(jié)果判定根據(jù)數(shù)量關(guān)系計(jì)算得出該疫苗的效力為1000RID/頭份，大于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所要求的 750RID/頭份，判定合格。實(shí)施例21試劑、材料1. 1豬瘟參考病毒豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和提供。1.2細(xì)胞系兔腎細(xì)胞(RK-13)，按照《規(guī)程》檢測(cè)不含外源病毒。1.3細(xì)胞培養(yǎng)液90% MEM+10%胎牛血清，pH 7. 2。1.4細(xì)胞維持液98% MEM+2%胎牛血清 + 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.5稀釋液99% MEM+ 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.6固定液50%丙酮-甲醇溶液(50%丙酮+50%甲醇)。1.7 抗體豬源豬瘟酶標(biāo)記抗體(由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)。1.8 DAB 顯色液1.8.1 0.05M TB 0. 2M Tris-HCl 133ml 力口 NaCl 6. 20g，加去離子水至 400ml，調(diào) MpH 7. 6 ；1.8.2 DAB 顯色液DAB 500mg 加入 100ml 0· 05M 的 TB 中(先以少量 TB 溶解 DAB，
然后加入余量TB，充分搖勻)過(guò)濾后備用；1.8.3顯色前加入30%的H2O2 30 40 μ 1，使其終濃度為0. 01 %。2豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)測(cè)定2. 1細(xì)胞培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后加入適量培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種至24孔組織培養(yǎng) 板，每孔400 μ 1，置37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞。2. 2 接毒2.2. 1根據(jù)疫苗說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的含量，用稀釋液將待測(cè)疫苗復(fù)溶并稀釋至Iml/頭 份；2. 2. 2將稀釋好的疫苗懸液10倍系列稀釋至10_5 ；2. 2. 3吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；2.2.4每個(gè)稀釋度的待測(cè)疫苗懸液以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度 重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；
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2. 2. 5稀釋的參考病毒對(duì)照以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；2. 2. 6在細(xì)胞培養(yǎng)板上留3孔僅加入維持液作為細(xì)胞空白對(duì)照；2. 2. 7將接種過(guò)的培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中吸附60min，每IOmin輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板1 次使細(xì)胞避免干燥；2. 2. 8吸附完畢后，細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中加入300μ 1維持液，在37°C的CO2培養(yǎng) 箱中靜置培養(yǎng)3天。2. 3 固定2. 3. 1培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，倒掉維持液，迅速用PBS輕輕洗滌細(xì)胞，再用去離子水洗滌， 風(fēng)干；2. 3. 2在培養(yǎng)板中加滿(mǎn)細(xì)胞固定液，室溫靜置10 20min，棄去固定液，風(fēng)干。2.4免疫染色2. 4. 1在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬瘟酶標(biāo)記抗體，室溫孵育60min ；2. 4. 2在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min,倒掉；2.4.3重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；2. 4. 4在所有培養(yǎng)孔中加入適量DAB顯色液，37°C顯色5 lOmin，鏡下控制顯色 程度，及時(shí)終止；2. 4. 5在顯微鏡下觀察每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈棕黃色 或棕褐色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。2. 5效價(jià)計(jì)算結(jié)果所有孔無(wú)可見(jiàn)污染，并且在待測(cè)疫苗所有稀釋度的孔中均未出現(xiàn)毒性， 并且陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照均成立，實(shí)驗(yàn)有效；按照《規(guī)程》的有關(guān)方法計(jì)算病毒效價(jià)為 1. 0X103TCID5。/0. 1ml。3結(jié)果判定根據(jù)數(shù)量關(guān)系計(jì)算得出該疫苗的效力為667 RID/頭份，大于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所要求的 150RID/頭份，判定合格。實(shí)施例31試劑、材料1. 1豬瘟參考病毒豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和提供。1.2細(xì)胞系兔腎細(xì)胞(RK-13)，按照《規(guī)程》檢測(cè)不含外源病毒。1.3細(xì)胞培養(yǎng)液90% MEM+10%胎牛血清，pH 7. 2。1.4細(xì)胞維持液98% MEM+2%胎牛血清 + 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.5稀釋液99% MEM+ 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.6固定液
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50%丙酮-甲醇溶液(50%丙酮+50%甲醇)。1. 7 抗體豬源豬瘟抗體(由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)，熒光標(biāo)記第二抗體(二抗，購(gòu)于 Sigma 公司)ο2豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)測(cè)定2. 1細(xì)胞培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后加入適量培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種至24孔組織培養(yǎng) 板，每孔400 μ 1，置37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞。2. 2 接毒2.2. 1根據(jù)疫苗說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的含量，用稀釋液將待測(cè)疫苗復(fù)溶并稀釋至Iml/頭 份；2. 2. 2將稀釋好的疫苗懸液10倍系列稀釋至10_5 ；2. 2. 3吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；2.2.4每個(gè)稀釋度的待測(cè)疫苗懸液以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度 重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；2. 2. 5稀釋的參考病毒對(duì)照以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；2. 2. 6在細(xì)胞培養(yǎng)板上留3孔僅加入維持液作為細(xì)胞空白對(duì)照；2. 2. 7將接種過(guò)的培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中吸附60min，每IOmin輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板1 次使細(xì)胞避免干燥；2. 2. 8吸附完畢后，細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中加入300μ 1維持液，在37°C的CO2培養(yǎng) 箱中靜置培養(yǎng)3天。2. 3 固定2.3. 1培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，倒掉維持液，迅速用PBS輕輕洗滌細(xì)胞，再用去離子水洗滌， 風(fēng)干；2. 3. 2在培養(yǎng)板中加滿(mǎn)細(xì)胞固定液，室溫靜置10 20min，棄去固定液，風(fēng)干。2.4免疫染色2. 4. 1在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬源豬瘟抗體，室溫孵育45 60min ；2. 4. 2在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；2. 4. 3重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；2. 4. 4在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育45 60min ；2. 4. 5在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；2. 4. 6重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；2. 4. 7用熒光顯微鏡檢測(cè)每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈蘋(píng)果 綠熒光染色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。2. 5效價(jià)計(jì)算結(jié)果所有孔無(wú)可見(jiàn)污染，并且在待測(cè)疫苗所有稀釋度的孔中均未出現(xiàn)毒性， 并且陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照均成立，實(shí)驗(yàn)有效；按照《規(guī)程》的有關(guān)方法計(jì)算病毒效價(jià)為 1. 5X103TCID50/0. 1ml。
3結(jié)果判定根據(jù)數(shù)量關(guān)系計(jì)算得出該疫苗的效力為1000 RID/頭份，大于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所要求的 750 RID/頭份，判定合格。實(shí)施例41試劑、材料1. 1豬瘟參考病毒豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和提供。1. 2細(xì)胞系兔腎細(xì)胞(RK-13)，按照《規(guī)程》檢測(cè)不含外源病毒。1. 3細(xì)胞培養(yǎng)液90% MEM+10%胎牛血清，pH 7. 2。1. 4細(xì)胞維持液98% MEM+2%胎牛血清 + 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.5稀釋液99% MEM+ 雙抗(終濃度各 100IU/ml)，pH 7. 2。1.6固定液50%丙酮-甲醇溶液(50%丙酮+50%甲醇)。1. 7 抗體豬源豬瘟抗體(由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)，酶標(biāo)記二抗(購(gòu)于Sigma公司)。1.8 DAB 顯色液1.8.1 0.05M TB 0. 2M Tris-HCl 133ml 力口 NaCl 6. 20g，加去離子水至 400ml，調(diào) MpH 7. 6 ；1. 8. 2 DAB 顯色液:DAB 500mg 力口入 IOOml 0. 05M 的 TB 中(先以少量 TB 溶解 DAB，
然后加入余量TB，充分搖勻)過(guò)濾后備用；1. 8. 3顯色前加入30%的H2O2 30 40 μ 1，使其終濃度為0. 01%。2豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)測(cè)定2. 1細(xì)胞培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后加入適量培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種至24孔組織培養(yǎng) 板，每孔400 μ 1，置37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞。2. 2 接毒2.2. 1根據(jù)疫苗說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的含量，用稀釋液將待測(cè)疫苗復(fù)溶并稀釋至Iml/頭 份；2. 2. 2將稀釋好的疫苗懸液10倍系列稀釋至10_5 ；2. 2. 3吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；2.2.4每個(gè)稀釋度的待測(cè)疫苗懸液以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度 重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；2. 2. 5稀釋的參考病毒對(duì)照以100 μ 1/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，重復(fù)3個(gè)孔，輕輕地 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使之鋪勻；2. 2. 6在細(xì)胞培養(yǎng)板上留3孔僅加入維持液作為細(xì)胞空白對(duì)照；
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2. 2. 7將接種過(guò)的培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中吸附60min，每IOmin輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板1 次使細(xì)胞避免干燥；2. 2. 8吸附完畢后，細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中加入300 μ 1維持液，在37°C的CO2培養(yǎng) 箱中靜置培養(yǎng)3天。2. 3 固定2. 3. 1培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，倒掉維持液，迅速用PBS輕輕洗滌細(xì)胞，再用去離子水洗滌， 風(fēng)干；2. 3. 2在培養(yǎng)板中加滿(mǎn)細(xì)胞固定液，室溫靜置10 20min，棄去固定液，風(fēng)干。2. 4免疫染色2. 4. 1在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1豬源豬瘟抗體，室溫孵育60min ；2. 4. 2在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min,倒掉；2. 4. 3重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；2. 4. 4在所有培養(yǎng)孔中加入100 μ 1酶標(biāo)記二抗，室溫孵育60min ；2. 4. 5在各孔中加滿(mǎn)PBS洗滌5min，倒掉；2. 4. 6重復(fù)上面的操作，共進(jìn)行3次，風(fēng)干或自然干燥；2. 4. 7在所有培養(yǎng)孔中加入適量DAB顯色液，37°C顯色5 lOmin，鏡下控制顯色 程度，及時(shí)終止；2. 4. 8在顯微鏡下觀察每個(gè)培養(yǎng)孔，如果看到典型的細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))呈棕黃色 或棕褐色，則認(rèn)為該孔為陽(yáng)性。2. 5效價(jià)計(jì)算結(jié)果所有孔無(wú)可見(jiàn)污染，并且在待測(cè)疫苗所有稀釋度的孔中均未出現(xiàn)毒性， 并且陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照均成立，實(shí)驗(yàn)有效；按照《規(guī)程》的有關(guān)方法計(jì)算病毒效價(jià)為 1. 0X103TCID5。/0. 1ml。3結(jié)果判定根據(jù)數(shù)量關(guān)系計(jì)算得出該疫苗的效力為667 RID/頭份，大于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所要求的 150RID/頭份，判定合格。實(shí)施例5可以用兔源豬瘟熒光抗體或豬瘟單克隆熒光抗體替代實(shí)施例1中的豬源豬瘟熒 光抗體。實(shí)施例6可以用兔源豬瘟酶標(biāo)記抗體或豬瘟單克隆酶標(biāo)記抗體替代實(shí)施例2中的豬源豬 瘟酶標(biāo)記抗體。實(shí)施例7可以用兔源豬瘟抗體或豬瘟單克隆抗體替代實(shí)施例3、4中的豬源豬瘟抗體。實(shí)施例8可以用豬腎細(xì)胞(SK-6)、豬腎細(xì)胞(PK-15)、豬睪丸細(xì)胞(ST)、牛腎細(xì)胞(MDBK)和 牛睪丸細(xì)胞(BT)中任何一種細(xì)胞替代實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7中的兔腎細(xì)胞(RK-13)。
權(quán)利要求
一種豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)的測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟(1)選擇細(xì)胞系用于測(cè)定疫苗的病毒效價(jià)；(2)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)將上述細(xì)胞消化并用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種24孔組織培養(yǎng)板，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞；(3)將疫苗10倍系列稀釋后接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照；(4)病毒吸附后加入維持液在CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天；(5)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用固定液固定細(xì)胞；(6)用標(biāo)記的豬瘟特異性抗體進(jìn)行免疫染色；(7)觀察結(jié)果，計(jì)算病毒效價(jià)(TCID50/0.1ml)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)的測(cè)定方法，其特征在于 用于測(cè)定疫苗病毒效價(jià)的細(xì)胞系為豬腎細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞、牛腎細(xì)胞、牛睪丸細(xì)胞和兔腎細(xì) 胞中的任一種細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)的測(cè)定方法，其特征在于 所涉及的豬瘟特異性抗體為熒光或酶標(biāo)記的豬瘟單克隆抗體、熒光或酶標(biāo)記的豬瘟多克隆 抗體，熒光或酶標(biāo)記的第二抗體與豬瘟單克隆抗體或多克隆抗體聯(lián)用，以上豬瘟多克隆抗 體為豬源或兔源。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒效價(jià)的測(cè)定方法，其特征在于 通過(guò)病毒效價(jià)TCID5tlA). Iml計(jì)算豬瘟兔化弱毒活疫苗兔體感染量RID或豬體半數(shù)保護(hù)量 PD50并判斷疫苗效力檢驗(yàn)是否合格的方法(1)15 個(gè) TCID50 相當(dāng)于 1 RID 和 / 或 0. 25 PD50 ；(2)根據(jù)測(cè)出的病毒效價(jià)以及疫苗標(biāo)明的頭份和稀釋情況計(jì)算出每頭份疫苗的RID和 / 或 PD5tl ；(3)根據(jù)計(jì)算出的每頭份疫苗的RID和/或PD5tl，判斷該疫苗效力檢驗(yàn)是否合格。全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟兔化弱毒活疫苗的效力檢驗(yàn)方法。本發(fā)明包括以下技術(shù)步驟(1)建立豬瘟兔化弱毒活疫苗的病毒效價(jià)測(cè)定方法；(2)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)病毒效價(jià)與兔體試驗(yàn)或與豬體試驗(yàn)之間的數(shù)量關(guān)系；(3)應(yīng)用數(shù)量關(guān)系，對(duì)疫苗進(jìn)行體外效力檢驗(yàn)和結(jié)果判定。本發(fā)明避免了豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗(yàn)常規(guī)方法采用的兔體試驗(yàn)或豬體試驗(yàn)，具有避免動(dòng)物品種和個(gè)體差異的影響，提高效力檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，減少勞動(dòng)強(qiáng)度和檢驗(yàn)成本等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101915837SQ201010237929
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者關(guān)孚時(shí), 戴志紅, 李翠, 溫芳, 王在時(shí), 秦玉明, 蔣卉, 趙耘, 陸連壽 申請(qǐng)人:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所