一種針對(duì)疾病個(gè)體化用藥的基因分型快速試紙條檢測(cè)方法

專利名稱：一種針對(duì)疾病個(gè)體化用藥的基因分型快速試紙條檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種個(gè)體化用藥檢測(cè)技術(shù)，具體涉及針對(duì)心血管抗凝藥基因個(gè)體化用藥之快速分型檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
《中國(guó)心血管病報(bào)告2010》顯示，我國(guó)每年300萬(wàn)人死于心血管疾病，居死因之首，其用藥安全和有效性備受關(guān)注。氯吡格雷已成為臨床抗血栓治療的一線用藥。然而，約30%患者服用該藥后療效不佳，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。研究表明，氯吡格雷抵抗與ABCBl基因多態(tài)性、細(xì)胞色素P450酶代謝活性、ADP受體多態(tài)性均相關(guān)。其中CYP2C19基因多態(tài)性(關(guān)于細(xì)胞色素P450酶代謝活性)是增加心肌梗死、中風(fēng)和支架內(nèi)血栓的主要影響因素，其多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致藥物代謝酶的多態(tài)性，使酶活性呈現(xiàn)高、低或無(wú)活性狀態(tài)。因此，代謝類型被分為了以下四種超強(qiáng)代謝UM (純合超強(qiáng)代謝CYP2C19*17/*17，雜合超強(qiáng)代謝 CYP2C19*1/*17)、強(qiáng)代謝組EM (純合強(qiáng)代謝CYP2C19*1/*1 )、中間代謝組頂(雜合型中間代謝CYP2C19*l/*2和CYP2C19*l/*3)及弱代謝組PM (雜合型弱代謝CYP2C19*2/*3，純合型弱代謝CYP2C19*2/*2)。以基因分型為基礎(chǔ)的個(gè)體化用藥治療會(huì)成為降低不良反應(yīng)和增加藥效的一種有效手段。研究表明CYP2C19*2和CYP2C19*3兩種突變可解釋>99%的東方人弱代謝者以及約88%的白種人弱代謝者的表型。其中*2突變是PM產(chǎn)生的主要原因。中國(guó)人群CYP2C19*2和*3等位基因占30%及8%，CYP2C19*2和*3基因被證實(shí)為亞洲人對(duì)該藥抵抗的危險(xiǎn)因素。熒光定量PCR、質(zhì)譜法、基因芯片或傳統(tǒng)的酶切方法相比，均已被用來(lái)檢測(cè)SNPJS這些方法存在操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，或需要價(jià)格昂貴的大型儀器設(shè)備等方面的限制，因此并不適合于大多數(shù)臨床醫(yī)院在常規(guī)的臨床檢驗(yàn)中推廣使用，所以研究并開(kāi)發(fā)用于個(gè)體化用藥相關(guān)新型檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)和相關(guān)檢測(cè)廣品有重大意義。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)疾病個(gè)體化用藥的基因分型快速試紙條檢測(cè)方法，以解決背景技術(shù)的方法操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題、或需要價(jià)格昂貴的大型儀器設(shè)備等方面的限制。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提出了以下基本技術(shù)方案一種針對(duì)疾病個(gè)體化用藥的基因分型快速試紙條檢測(cè)方法，包括以下步驟(I)針對(duì)待檢測(cè)樣本基因組 DNA 的 CYP2Cl9*2 (681G>A), CYP2C19*3 (636G>A),CYP2C19*17 (-8060T)這三個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)每一個(gè)SNP位點(diǎn)均設(shè)計(jì)一條野生型特異性引物、一條突變型特異性引物和一條共用引物進(jìn)行識(shí)別與擴(kuò)增；在野生型特異性引物和突變型特異性引物的Y端均標(biāo)記地高辛，共用引物的Y端標(biāo)記生物素；(2)針對(duì)一個(gè)SNP位點(diǎn)，平行做兩管PCR反應(yīng)，其中一管加入共用引物與等量的突變型特異性引物，另一管中加入共用引物與等量的野生型特異性引物，兩管的PCR反應(yīng)條件相同并同時(shí)置于PCR儀中反應(yīng)；這樣，對(duì)于(I)步驟中所述的三個(gè)SNP位點(diǎn)，共做六管PCR反應(yīng)；Taq聚合酶的特異性決定了 PCR反應(yīng)能否順利進(jìn)行；(3)利用鏈親和素金磁微粒特有的可目視化特性，采用層析技術(shù)并以生物素和鏈親和素作用，對(duì)步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP基因型完成分型檢測(cè)；其中，層析技術(shù)采用的試紙條滿足a、試劑條的免疫層析膜(硝酸纖維素膜)上的質(zhì)控線處包被有質(zhì)控用生物素；b、檢測(cè)線處包被有捕獲用抗地高辛抗體；C、結(jié)合墊上噴涂有鏈親和素金磁微粒；經(jīng)步驟(2)取出的兩管PCR產(chǎn)物分別滴至兩支試紙條的樣品墊上進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)控線顯色表明此次實(shí)驗(yàn)有效，即步驟(2)的該管PCR反應(yīng)順利，即得到的產(chǎn)物一端標(biāo)記有生物 素，另一端標(biāo)記有地高辛，滴加至上樣墊，一端的生物素與鏈親和素磁粒特異性結(jié)合之后，通過(guò)層析作用上移至檢測(cè)線處，另一端上的地高辛與檢測(cè)線上的抗地高辛抗體特異性結(jié)合顯色，由此判斷出其基因型滴加含有野生型特異性引物的PCR產(chǎn)物在試紙條的檢測(cè)線上顯色，而含有突變型特異性引物的PCR產(chǎn)物在試紙條的檢測(cè)線上不顯色，則表明基因型為野生型；反之基因型為突變型；若兩支試紙條的檢測(cè)線均顯色，則表明基因型為雜合型。上述步驟⑴中設(shè)計(jì)的引物序列如下CYP2C19*2 (681G>A)引物序列
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)疾病個(gè)體化用藥的基因分型快速試紙條檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)針對(duì)待檢測(cè)樣本基因組DNA 的 CYP2C19*2 (681G>A)、CYP2C19*3 (636G>A)、CYP2C19*17 (-8060T)這三個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)每一個(gè)SNP位點(diǎn)均設(shè)計(jì)一條野生型特異性引物、一條突變型特異性引物和一條共用引物進(jìn)行識(shí)別與擴(kuò)增；在野生型特異性引物和突變型特異性引物的Y端均標(biāo)記地高辛，共用引物的Y端標(biāo)記生物素；(2)針對(duì)一個(gè)SNP位點(diǎn)，平行做兩管PCR反應(yīng)，其中一管加入共用引物與等量的突變型特異性引物，另一管中加入共用引物與等量的野生型特異性引物，兩管的PCR反應(yīng)條件相同并同時(shí)置于PCR儀中反應(yīng)；這樣，對(duì)于(I)步驟中所述的三個(gè)SNP位點(diǎn)，共做六管PCR反應(yīng)；Taq聚合酶的特異性決定了 PCR反應(yīng)能否順利進(jìn)行；(3)利用鏈親和素金磁微粒特有的可目視化特性，采用層析技術(shù)并以生物素和鏈親和素作用，對(duì)步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP基因型完成分型檢測(cè)；其中，層析技術(shù)采用的試紙條滿足a、試劑條的免疫層析膜上的質(zhì)控線處包被有質(zhì)控用生物素；b、檢測(cè)線處包被有捕獲用抗地高辛抗體；C、結(jié)合墊上噴涂有鏈親和素金磁微粒；經(jīng)步驟(2)取出的兩管PCR產(chǎn)物分別滴至兩支試紙條的樣品墊上進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)控線顯色表明此次實(shí)驗(yàn)有效，即步驟(2)的該管PCR反應(yīng)順利，即得到的產(chǎn)物一端標(biāo)記有生物素，另一端標(biāo)記有地高辛，滴加至上樣墊，一端的生物素與鏈親和素磁粒特異性結(jié)合之后，通過(guò)層析作用上移至檢測(cè)線處，另一端上的地高辛與檢測(cè)線上的抗地高辛抗體特異性結(jié)合顯色，由此判斷出其基因型滴加含有野生型特異性引物的PCR產(chǎn)物在試紙條的檢測(cè)線上顯色，而含有突變型特異性引物的PCR產(chǎn)物在試紙條的檢測(cè)線上不顯色，則表明基因型為野生型；反之基因型為突變型；若兩支試紙條的檢測(cè)線均顯色，則表明基因型為雜合型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)中設(shè)計(jì)的引物序列如下CYP2C19*2 (681G>A)引物序列 引物名稱Y~m\CYP2C19+2F 51 Biotin-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGT-31CYP2C19*2R(M) 5, Dig-GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT-3,CYP2C19*2R(Wt)5, Dig-TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCC-3, CYP2C19*3 (636G>A)引物序列 引物名稱Y~m\CYP2C19+3F 51 Biotin-TGTGCTCCCTGCAATGTGAT-31CYP2C19*3R(M) 5, Dig-AAAAAACTTGGCCTTACCTGGAAT-3,
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法PCR反應(yīng)過(guò)程依次為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60。。退火30s，72。。延伸45s，進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，72°C終延伸IOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述鏈親和素金磁微粒的主體納米金磁微粒為核殼結(jié)構(gòu)的超順磁性復(fù)合微粒，其核為納米磁性粒子，核表面是金的殼層，利用表面金的性質(zhì)，無(wú)需共價(jià)偶聯(lián)試劑，能夠?qū)㈡溣H和素偶聯(lián)在其表面形成鏈親和素金磁微粒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)疾病個(gè)體化用藥的基因分型快速試紙條檢測(cè)方法。該快速分型檢測(cè)方法包括以下幾個(gè)重要的環(huán)節(jié)基于AS-PCR的方法，對(duì)CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17等位基因位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別與擴(kuò)增。利用擴(kuò)增片段標(biāo)記的生物素和納米金磁微粒表面鏈親和素相互作用，結(jié)合側(cè)向流技術(shù)，實(shí)現(xiàn)基因分型快速檢測(cè)。利用金磁微粒作為雜交載體，無(wú)需對(duì)目的片段進(jìn)行純化、濃縮而導(dǎo)致的高成本、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102776279SQ20121017134
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者崔亞麗, 張秦魯, 惠文利, 朱娟莉, 魏旭旭 申請(qǐng)人:西安金磁納米生物技術(shù)有限公司