一種用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法及其裝置和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法及其裝置和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化檢測技術(shù)中的微量加樣方法，具體說，是涉及一種用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法及其裝置和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一、焦磷酸測序概況焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)是于1987年發(fā)展起來的、基于DNA合成過程中釋放的焦磷酸(PPi)檢測的測序技術(shù)，焦磷酸測序反應(yīng)在一系列酶的催化作用下的，其過程中會產(chǎn)生與脫氧三磷酸核苷(dNTP)的聚合數(shù)目成比例的可見光，通過對可見光檢測可達(dá)到測定DNA序列的目的。焦磷酸測序有兩種實現(xiàn)方法:液相焦磷酸測序法(LiquidPhase Pyrosequencing)和固相焦憐酸測序法(Solid Phase Pyrosequencing)。液相焦磷酸測序是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，其原理是:引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPs ii Lfurylase)、突光素酶(Iuciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)協(xié)同作用下,將引物DNA上每一個dNTP的聚合與熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實時測定DNA序列的目的(馬永平等，焦磷酸測序技術(shù)及其在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊2003，25 (2):115-117)。液相焦磷酸測序的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測單鏈、特異性測序引物和酶構(gòu)成，反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(APS)和熒光素(Iuciferin)。液相焦磷酸測序反應(yīng)過程是一個向反應(yīng)體系中輪流加入4種dNTP參與反應(yīng)的`過程，每輪反應(yīng)只有一種dNTP參加。如果加入的dNTP剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則其在DNA聚合酶的作用下被添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi);在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi和APS結(jié)合形成ATP ;在熒光素酶的作用下，生成的ATP又和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。如果加入的這種dNTP剛好能好和DNA模板的下面連續(xù)n個相同堿基匹配，根據(jù)反應(yīng)方程式可知，釋放出的可見光強(qiáng)度應(yīng)是只有I個堿基匹配時的n倍，也即反應(yīng)過程中釋放的光強(qiáng)度與相匹配的堿基數(shù)目成比例關(guān)系。如果加入的dNTP和DNA模板的下一個堿基不匹配，則上述反應(yīng)不會發(fā)生，也沒有可見光的釋放。未參加反應(yīng)的dNTP和ATP在核苷酸降解酶Apyrase的作用下降解。每輪反應(yīng)釋放出的可見光通過微弱光檢測裝置轉(zhuǎn)化，再被處理為數(shù)字信號，經(jīng)PC軟件處理即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低應(yīng)和相匹配的堿基數(shù)目成比例關(guān)系。待上一輪反應(yīng)結(jié)束后，加入另一種dNTP，重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)。最終可根據(jù)獲得的光強(qiáng)度峰值圖即可讀取的待測DNA序列信息。需要注意的是:dATP的降解產(chǎn)物脫氧單磷酸鳥苷(dAMP)是熒光素酶的抑制劑，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其濃度會越來越高，會阻礙焦磷酸測序化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。這也是焦磷酸測序法測序長度較短(通常為20bp 30bp)的主要原因(Shendure J,et al.Advancedsequencing technologies:Methods and goals, Nat.Rev Genet.,2004,5(5):335-44)。固相焦磷酸測序是由3種酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，與液相焦磷酸測序相比，沒有三磷酸腺苷雙磷酸酶參加。固相焦磷酸測序反應(yīng)過程如下:結(jié)合了引物的DNA模板被固定于支撐物上并在反應(yīng)過程中保持位置不變；加入一種dNTP后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和熒光素酶協(xié)同作用下發(fā)生反應(yīng)，除了沒有降解反應(yīng)發(fā)生，其他反應(yīng)與液相焦磷酸測序完全相同；在加入下一種dNTP前有一個沖洗步驟(washing step)將上輪反應(yīng)殘留物完全沖走，不會有抑制性產(chǎn)物的堆積。通常情況下，入們所說的焦磷酸測序法指的是液相焦磷酸測序法，因為其四酶反應(yīng)系統(tǒng)使得焦磷酸測序可以很方便地在單管中實現(xiàn)。 Ronaghi等利用dATP a S替代dATP提高焦磷酸測序的信噪比(Ronaghi M.etal.Real-time DNA sequencing using detection of PPi release ；Anal.Biochem,1996,242 (I): 84-89)。因為dATP a S可以比dATP被DNA聚合酶更有效地利用，更有利于閱讀富含T的區(qū)域。dATP a S是兩種異構(gòu)體Sp-dATP a S和Rp-dATP a S的混合物，聚合酶只能利用Sp-dATP α S。為了得到最佳反應(yīng)效率，必需在反應(yīng)體系中保持最佳濃度的Sp-dATP α S，與此同時Rp — dATP a S的濃度也在增加。dATP a S被Apyrase降解后仍會產(chǎn)生熒光素酶的抑制物，因此dATP a S的加入并沒有提高讀序能力。Gharizadeh等人對此進(jìn)行了改進(jìn),他們在反應(yīng)中只加入純的Sp-dATP aS,而不加入無用的Rp-dATP a S，提高了反應(yīng)的效率，大大降低了抑制產(chǎn)物的濃度，使得熒光素酶能夠維持較長時間的活性，使焦磷酸測序法的測序長度增加到50bp lOObp，測序長度的增加也使得焦磷酸測序技術(shù)有了許多新的應(yīng)用(Gharizadeh B.et al., Long-readpyrosequencing using pure2’ -deoxyadenosine-5J -0’ - (1-thiotriphosphate)Sp-1somer ；Anal Binchem,2002.301:82-90)。在2000年舉辦的第十二屆基因組測序和分析會議(12th International GenomeSequencing and Analysis Conference)上，Ronaghi 等人提出了一種移除抑制產(chǎn)物、減小稀釋效應(yīng)的方法，將測序長度增加到200bp。與sanger雙脫氧鏈終止測序法相比，焦磷酸測序法具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、實時檢測的特點(diǎn)；它不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具有很高的可重復(fù)性；能實現(xiàn)高度的并行性和高度的自動化。二、焦磷酸測序技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展I在單核苷酸多態(tài)性研究中的應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)是近年來出現(xiàn)的第三代遺傳標(biāo)記，它指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體的頻率不小于1%。SNPs是生物的基因組中最為常見的遺傳多態(tài)型，它可以在任何 個待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記；而正是這種基因組中的多態(tài)性，即基因組序列的差異構(gòu)成了不同個體與群體對疾病的易感性、對藥物與環(huán)境因子不同反應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。SNP的研究主要包括兩個方面:一是SNP數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，主要是發(fā)現(xiàn)特定種類生物基因組的全部或部分SNP。二是 SNP功能研究，發(fā)現(xiàn)SNP只是SNP研究的第一步，SNP功能的研究才是SNP研究的目的。Sanger測序技術(shù)已成為大規(guī)模、準(zhǔn)確、快速發(fā)現(xiàn)SNP的主流技術(shù)。而對數(shù)據(jù)庫中已有SNP進(jìn)行序列驗證分析和頻率分析，擅長短序列測序和驗證的焦磷酸測序技術(shù)是很好的選擇，采用焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行SNP研究，更可以節(jié)約時間并降低消耗。Nordfors等分別采用Taqman突光定量法和焦磷酸測序技術(shù)對高達(dá)1022個樣本進(jìn)行SNP基因分型研究，獲得了相同的結(jié)果，此對照實驗表明焦磷酸測序技術(shù)是進(jìn)行高通量、大樣本的SNPs的高效、高準(zhǔn)確度的方法。Wasson等利用焦磷酸測序技術(shù)來進(jìn)行DNA池(DNApools)的SNP等位基因頻率分析。Rickert等采用焦磷酸測序技術(shù)對4倍體馬鈴薯進(jìn)行基因型研究，在對94個多態(tài)性位點(diǎn)檢測中，有76個等位基因位點(diǎn)可用焦磷酸測序技術(shù)鑒別，有效率達(dá)81%。蔣思文等利用焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行了鑒別豬線粒體細(xì)胞色素b基因單倍型的工作。袁建林等利用焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行HLA-DRB基因型分析研究，實驗表明，將焦磷酸測序結(jié)果與HLA數(shù)據(jù)庫的基因序列比較后可準(zhǔn)確進(jìn)行基因分型，該方法可應(yīng)用于臨床器官移植的供體/受體篩查。2在病原微生物快速鑒定中的應(yīng)用Jonasson等用焦磷酸測序技術(shù)檢測病原菌16S rRNA基因，快速鑒定出臨床標(biāo)本中抗生素抵抗菌。Monstein等用焦磷酸測序技術(shù)成功檢測幽門螺桿菌16S rRNA基因易變的Vl和V3區(qū)序列，證明該技術(shù)可滿足對臨床病原菌標(biāo)本的快速鑒定和分型。Unnerstad等利用該技術(shù)對106株不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了分型，利用焦磷酸測序技術(shù)在短時間內(nèi)完成大量的樣本測序，其并行性和高效率菲常顯著。Gharizadeh等用此技術(shù)對67個人乳頭瘤病毒樣品進(jìn)行了鑒定和分型，證明該技術(shù)也非常適于HPV等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。程紹輝等從感染人SARS病毒的Veix)-6細(xì)胞中提取病毒RNA,采用焦磷酸測序技術(shù)對多個堿基突變位點(diǎn)測序和突變頻率分析。通過測序分析多個可能出現(xiàn)突變的位點(diǎn)，確定了該病毒為北京流行株。3在病因?qū)W研究中的應(yīng)用Kittles等利用焦磷酸測序技術(shù)，對尼日利亞人、歐洲裔美國人和非洲裔美國人三個不同種群的CYP17基園多態(tài)性進(jìn)行分析，研究非潲裔美國人的CYP17基因多態(tài)性與前列腺癌之問的關(guān)系和臨床表現(xiàn)。研究結(jié)果表明，序列為CC的CYP17基因型的非洲裔美國人比序列為TT的CYP17基因型非洲裔美國人患前列腺癌的幾率要高，證明這類人群中的堿基為C的CYP17基因多態(tài)性與前列腺癌的發(fā)病率關(guān)系密切，為高危人群。眾多線索表明，位于染色體22qll的COMT基因與精神分裂癥的發(fā)病存在重要聯(lián)系，而科學(xué)家的研究工作一直沒能提出有力的證據(jù)；Shifman等提出了一種有效的方法，他們利用焦磷酸測序技術(shù)，對大樣本的德系猶太人群進(jìn)行相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性分析，證實精神分裂癥的發(fā)生與CMOT基因之間存在高度的關(guān)聯(lián)。這種方法也能適用于其他疾病的基因分析研究。4在法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用
用Sanger測序法對線粒體DNA(mtDNA)變異分析,不能實現(xiàn)對由含有污染物、多個個體DNA等組成的mtDNA混合物的精確量化分析,而Andreasson等出了一種針對mtDNA混合分析的基于焦磷酸測序技術(shù)的新穎的量化方法，可以很容易地從法庭證物混合樣本中快速、準(zhǔn)確地檢測出主要的和次要的mtDNA成分。Balitzki—Korte利用焦磷酸測序技術(shù)對線粒體12S rRNA基因進(jìn)行測序分析，在149bp長度的基因片斷上進(jìn)行長度為20bp的檢測，通過參考數(shù)據(jù)庫序列，就能夠充分確定對象的生物學(xué)起源，比如說，能夠確定一塊皮膚組織究竟是來自失蹤人員還是動物身上。三、焦磷酸測序裝置及發(fā)展焦磷酸測序技術(shù)的應(yīng)用依賴于焦磷酸測序裝置的研究與開發(fā)。不論何種焦磷酸測序裝置，其主要結(jié)構(gòu)都應(yīng)包含兩個部分:反應(yīng)器部分和微弱光檢測部分。反應(yīng)器提供反應(yīng)進(jìn)行的場所，微弱光檢測部分負(fù)責(zé)檢測反應(yīng)發(fā)出的可見光。在人們對焦磷酸測序技術(shù)的研究和應(yīng)用過程中，設(shè)計和使用的反應(yīng)器主要可以分為3類:微量板反應(yīng)器、微流控芯片反應(yīng)器和微陣列芯片反應(yīng)器。而商業(yè)化的焦磷酸測序儀在國外已面世，然而國內(nèi)相關(guān)儀器本身研究的報道甚少，更無相應(yīng)的產(chǎn)品問世。國外產(chǎn)品的一個典型代表是Pyrosequencing AB公司的PSQ96,它是該公司2001年推出的產(chǎn)品，系統(tǒng)能夠同時進(jìn)行96路或者384路DNA樣本的獨(dú)立測序，當(dāng)測序長度不超過300bp時一般所用時間在I小時45分鐘，準(zhǔn)確性和可靠性達(dá)到99%，具有高通量、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢。PSQ96系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床分子診斷當(dāng)中。國外儀器研究另外一個代表是美國454Life Science公司2005年推出的GenomeSequencer20 (GS20)。它走向了有著更高技術(shù)含量的微型化方向，即利用MEMS技術(shù)將微濾腔作為焦磷酸測序反應(yīng)的反應(yīng)環(huán)境，將驚人的上百萬數(shù)目的反應(yīng)陣列集成進(jìn)7cmX8cm的面積內(nèi)，并使每個反應(yīng)艙能獨(dú)立同時進(jìn)行測序級聯(lián)反應(yīng)，儀器具有的高靈敏度和分辨率的CCD能夠捕捉到每個單反應(yīng)艙產(chǎn)生的微弱熒光信號，最終能夠得到每個標(biāo)本DNA的序列信息。GS20僅需4.5個小時即可實現(xiàn)高密度測序反應(yīng)，經(jīng)過并行計算得到每個標(biāo)本的序列信息。優(yōu)點(diǎn)是可以節(jié)省反應(yīng)試劑的消耗，降低測序成本，為基因組大規(guī)模測序提供可能。目前國內(nèi)的儀器研究剛剛起步，國產(chǎn)化的道路漫長，面對方方面面的問題，在權(quán)衡測序系統(tǒng)所需要的各種硬件條件后，發(fā)現(xiàn)首要面對的問題和挑戰(zhàn)是微量加樣子系統(tǒng)的研制問題。 四、焦磷酸測序中加樣系統(tǒng)的重要性焦磷酸測序技術(shù)及其產(chǎn)品為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術(shù)操作平臺，是后基因組時代進(jìn)行基因序列分析研究的有力工具。焦磷酸測序技術(shù)正被越來越多的研究人員接受和采用，隨著國際上焦磷酸測序技術(shù)應(yīng)用的興起和商品化焦磷酸測序儀器的發(fā)展，我國的焦磷酸測序技術(shù)應(yīng)用方興未艾。但是在現(xiàn)階段，國內(nèi)焦磷酸測序技術(shù)的應(yīng)用和推廣存在幾個制約因素:(I)現(xiàn)有的商品化焦磷酸測序儀器如PSQ96、GS20價格昂貴；(2)商業(yè)化的焦磷酸測序服務(wù)等待時間長且很不方便；(3)雖然目前有些實驗室在進(jìn)行諸如焦磷酸測序芯片等裝置的研究，一些實驗室有自制的、結(jié)構(gòu)簡單的焦磷酸測序試驗裝置，但國內(nèi)沒有面向低端的、價格便宜的、商品化的基于焦磷酸測序技術(shù)的序列檢測儀器，是制約焦磷酸測序技術(shù)應(yīng)用發(fā)展的關(guān)鍵問題。焦磷酸測序系統(tǒng)是在微量環(huán)境中進(jìn)行的，通常反應(yīng)體系僅在50 μ L，所需的反應(yīng)底物、DNA模板以及脫氧核苷酸等試劑的量非常微小；同時，單次加樣量的多少直接影響循環(huán)反應(yīng)的可持續(xù)性，過大的單次加樣量會使反應(yīng)溶液體積迅速變大，因此造成模板濃度下降過快。由于擴(kuò)散作用產(chǎn)生的反應(yīng)延遲非線性增加，得到的微弱熒光信號在時間軸上延伸，強(qiáng)度在縱坐標(biāo)上降低，最終導(dǎo)致嚴(yán)重縮短核酸的可測序長度。一般認(rèn)為由于后續(xù)加樣造成的反應(yīng)體系增加如果在10%之內(nèi)，對實驗結(jié)果的影響是在可以接受的范圍內(nèi)。假如要對一段20bp長度的DNA片斷進(jìn)行測序，那么在50 μ L的反應(yīng)體系中，允許的單次加樣量只能不超過0.3 μL。此外，除了加樣精度，加樣間隔的時間準(zhǔn)確性也同樣重要。只有在等時間間隔內(nèi)加入單循環(huán)所需的dNTP，才能使每次的殘留dNTP的降解程度相當(dāng)，那么對下次反應(yīng)造成的影響也將相等。等時間段才能給每個周期的信號提供基準(zhǔn)，便于后續(xù)根據(jù)熒光信號強(qiáng)度計算核苷酸結(jié)合數(shù)目的自動化分析。雖然國產(chǎn)化的加樣設(shè)備已比較豐富，但是國內(nèi)現(xiàn)有的微量加樣裝置都有不足。比如上海復(fù)日的加樣平臺，作為大型自動化樣本池處理設(shè)備,能夠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)96孔板的加樣、振蕩、清洗工作，但是這套系統(tǒng)由于噴嘴加工工藝的限制，加樣微精度最小只有I U L，無法滿足焦磷酸測序要求的nL級別。經(jīng)過調(diào)研，限制于國內(nèi)應(yīng)用和制造水平，國產(chǎn)化的加樣裝置都無法滿足焦磷酸測序中對加樣量以及重復(fù)精度的高要求。東南大學(xué)葛健徽等公開了一種以微弱光檢測模塊和微量dNTP加樣模塊為關(guān)鍵模塊的液相焦磷酸測序裝置，其中公開了一氣壓控制微量dNTP加樣模塊，可實現(xiàn)96路dNTP溶液的同時加樣，最小加樣量為1.2UL，最大誤差為13%;但信號噪聲較大，仍需更一步改進(jìn)(葛健徽等，基于焦磷酸測序的基因檢測裝置的研制，東南大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2006)。王春林等攻來了一種采用壓電陶瓷噴頭的焦磷酸核酸測序儀中微量加樣系統(tǒng)，該可以在步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動下，對96孔標(biāo)準(zhǔn)板樣本分別進(jìn)行4種dNTP試劑的輪流加樣，加樣重復(fù)精度大于95%，單次加樣最小量能達(dá)到0.1 y L。上述兩類較佳的焦磷酸核酸測序儀中所用的微量加樣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，且加樣針易堵，dNTP通過不同的方式噴入測序反應(yīng)液內(nèi)并不與反應(yīng)液液接觸使得與反應(yīng)液混合不充分反應(yīng)不完全，對dNTP要求量也較高且數(shù)據(jù)易不準(zhǔn)確；此外，拆裝麻煩，成本高且不利于特殊條件下應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一種用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，包括以下了步驟: 步驟a，通過一加樣元件蘸取任一一種dNTP試劑使得所述加樣元件外周附著所述dNTP試劑；步驟b，將附著所述dNTP試劑的加樣元件插入測序反應(yīng)液中，再使所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液；其中:所述加樣元件包括一實心加樣針及其驅(qū)動裝置。其中，為實現(xiàn)完成測序，優(yōu)選為將4種dNTP試劑任一或多個依待測序列而定以何種順序加入測序反應(yīng)液中，例如:僅檢測單個堿基是否變異時，可根據(jù)已知的前后序列先確定待測堿基位置后，依次重復(fù)上述步驟4次加樣(加入4種dNTP試劑)，分別加入同一測序反應(yīng)液中檢測該堿基。優(yōu)選地,所述加樣針直徑小于0.5cm,優(yōu)選為0.5mm 2mm。更優(yōu)選地，所述加樣針的針體為圓柱體或長方體。更優(yōu)選地，所述加樣針的加樣端面為平面、半球體或錐體。更優(yōu)選地，所述加樣針的表面光滑度小于Ra50,優(yōu)選為小于RalO。
優(yōu)選地，所述加樣元件的驅(qū)動裝置用于實現(xiàn)所述加樣針沿X、Y、Z軸向運(yùn)動，或沿
一圓心轉(zhuǎn)動。優(yōu)選地，所述步驟a中所述加樣元件離開所述dNTP試劑液時的移動速度為5 50cm/s,優(yōu)選為 1015cm/s。優(yōu)選地，所述步驟b中所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液時的移動速度小于5cm/s，優(yōu)選為0.4 lcm/s。優(yōu)選地，所述步驟b中所述加樣元件或加樣針在所述測序反應(yīng)液中反復(fù)移動至少5次后離開所述測序反應(yīng)液；優(yōu)選為8 15次；其中加樣元件或加樣針可在測序反應(yīng)液內(nèi)上下移動，或小幅度左右轉(zhuǎn)動，也可低速選擇，以達(dá)到攪拌作用。優(yōu)選地，所述加樣方法還包括加樣元件的清洗和/或干燥。一種用于焦磷酸核酸測序下系統(tǒng)的加樣裝置，包括一加樣平臺和用于轉(zhuǎn)移dNTP試劑的加樣元件，所述加樣元件包括至少一實心加樣針及其驅(qū)動裝置。優(yōu)選地，所述樣品平臺上依次設(shè)有dNTP試劑槽(優(yōu)選為4個，以放置四種dNTP試劑槽)、清洗槽和樣品槽，所述樣品槽用于放置至少一組測序反應(yīng)液，更優(yōu)選地還可設(shè)有干燥區(qū)，所述干燥區(qū)位于所述清潔槽和dNTP試劑槽之間。優(yōu)選地，所述驅(qū)動裝置為一設(shè)有轉(zhuǎn)軸的圓形加樣針架，所述加樣針貫穿所述加樣針架上的通孔且通過所述加樣針的固定端限位固定，所述加樣針的固定端直徑大于所述加樣針架上的通孔直徑，所述圓形加樣針架通過所述轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動、或呈X、Y、Z軸方向平動、或同另一轉(zhuǎn)動驅(qū)動裝置呈連動轉(zhuǎn)動。其中優(yōu)選的實施方式是所述樣品平臺方形，所述dNTP試劑槽、清洗槽和樣品槽呈線性排列，此時所述圓形 加樣針架即可通過所述轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動，又可呈X、Y、Z軸方向平動；另外一種為實現(xiàn)更快測序的實施方式是，所述樣品平臺呈圓環(huán)或圓形，所述dNTP試劑槽、清洗槽和樣品槽沿圓心依次設(shè)置，此時所述圓形加樣針架即可通過所述轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動，又同另一轉(zhuǎn)動驅(qū)動裝置呈連動轉(zhuǎn)動；上述設(shè)置用于實現(xiàn)所述加樣元件即可在所述樣品槽中不同的測序反應(yīng)液中加樣(通過圓形加樣針架通過轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動)；又可在所述加樣平臺上不同位置的移動實現(xiàn)加樣、清洗、干燥以及取樣等多種功能；更優(yōu)選地，所述加樣針架上的通孔對應(yīng)測序樣品池設(shè)置，為實現(xiàn)多樣品檢測，所述樣品池位于所述樣品臺的一端沿一圓心呈一系列同心圓排列，且所述加樣針架上的通孔亦為一系列同心圓孔排列。更優(yōu)選地，所述樣品池連接焦磷酸核酸檢測裝置，優(yōu)選為一生物發(fā)光檢測裝置，用于檢測樣品中的核酸序列。上述用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的加樣裝置的應(yīng)用，為與任一焦磷酸核酸測序裝置聯(lián)用成一測序系統(tǒng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用一結(jié)構(gòu)簡單的加樣元件即可實現(xiàn)dNTP試劑的微量給樣，摒棄了傳動的中空針管抽噴式的給樣方式，僅通過所述加樣元件的加樣針與液體間的吸附力及其在不同液體中的移動速度差異的控制即可實現(xiàn)微量取樣加樣，且僅通過加樣元件在測序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動數(shù)次即可實現(xiàn)攪拌使得酶反應(yīng)更為完全結(jié)果準(zhǔn)確，本加樣方法及其裝置適用于任何檢測裝置中，拆卸簡便，清洗簡單便捷，且不會發(fā)生堵針等多種現(xiàn)有技術(shù)中的加樣裝置的不足，加樣重復(fù)精度大于95%，且最小加樣量可達(dá)0.1 μ L，加樣均一性好，測序時間大為縮短且結(jié)果準(zhǔn)確性極高；此外可通過所聯(lián)用的檢測裝置對樣品核酸序列進(jìn)行定性定量檢測；因此其應(yīng)用前景十分廣闊。


圖1為本發(fā)明提供的用于焦磷酸測序系統(tǒng)的加樣裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明提供的用于焦磷酸測序系統(tǒng)的加樣裝置結(jié)構(gòu)中的加樣針示意圖；圖3為實施例1中采用本發(fā)明提供的用于焦磷酸測序系統(tǒng)的加樣裝置測得的序列譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及對比例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。圖1為本發(fā)明提供的加樣裝置的一種實施方式，但并非唯一的實施方式，如圖1所示:該加樣裝置包括一加樣平臺(1)和用于轉(zhuǎn)移dNTP試劑的加樣元件，所述加樣元件包括至少一實心加樣針(2)及其驅(qū)動裝置；所述樣品平臺上依次設(shè)有dNTP試劑槽(3)、干燥區(qū)(4)、清洗槽(5)和樣品槽￠)，所述干燥區(qū)為真空干燥區(qū)；所述驅(qū)動裝置為一設(shè)有轉(zhuǎn)軸(701)的圓形加樣針架(7)，所述加樣針貫穿所述加樣針架上的通孔⑶且通過所述加樣針的固定端(201)固定，所述加樣針的固定端直徑大于所述加樣針架上的通孔直徑，所述圓形加樣針架通過所述轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動、或呈X、Y、Z軸方向平動；為實現(xiàn)多樣品檢測，所述樣品池位
(9)于所述樣品臺的一端沿一圓心呈一 系列同心圓排列，且所述加樣針架上的通孔亦為一系列同心圓孔排列；所述樣品池連接一生物發(fā)光檢測裝置(10)，用于檢測樣品中的核酸序列，所述生物發(fā)光檢測裝置為市售iKon-M深度制冷影像CXD相機(jī)，且連接一電腦并呈現(xiàn)檢測的譜圖；此處的加樣平臺僅為一種實例，并非獨(dú)一的選擇，僅僅用于考察本發(fā)明提供的加樣方法及其裝置。實施例1圖2為加樣針的結(jié)構(gòu)示意圖，其中所述加樣針的端面(202)為半圓體；采用上述的加樣裝置檢測已知序列的樣品(序列為CAATATTCGCCAGGT)，其中所述加樣元件的加樣針直徑為1.5_，表面光潔度為Ra0.8 ;加樣方法包括:步驟a，通過所述加樣元件插入樣品槽的dNTP試劑使得所述加樣元件外周附著所述dNTP試劑；步驟b，將附著所述dNTP試劑的加樣元件插入樣品池測序反應(yīng)液中，再使所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液；所述步驟a中所述加樣元件離開所述dNTP試劑液時的移動速度為lOcm/s，所述步驟b中所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液時的移動速度為lcm/s，在測序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動8次后離開測序反應(yīng)液。圖3為本實施例的加樣方法及其裝置聯(lián)用焦磷酸核酸測序檢測裝置所得的測序譜圖，由圖3可知，其中依次加入dNTP的順序TCATATTCGCCAGT，其中首次加入T時未出峰，以及后續(xù)與實際序列不符的dNTP試劑液也未出峰(圖3中用圓圈標(biāo)出，即T、T、C)，其測得的序列為CAATATTCGCCAGGT，與樣品實際序列完全一致，精確度為100%，且；檢測單個堿基的時間小于1.5分鐘，此序列大約耗時25分鐘，且最小加樣量可達(dá)0.1 y L。重復(fù)上述加樣10次，其加樣重復(fù)精度為95%。實施例2本對比例與實施例1的區(qū)別僅在于:所述加樣針的端面為平面，直徑為1.5mm，表面光潔度為Ra3.2，且加樣方法中所述步驟a中所述加樣元件離開所述dNTP試劑液時的移動速度為50cm/s，所述步驟b中所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液時的移動速度為0.4cm/s，在測序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動5次后離開測序反應(yīng)液。本實施例所得測序譜圖及其他實驗結(jié)果數(shù)據(jù)(測序時間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為96%。實施例3本對比例與實施例1的區(qū)別僅在于:所述加樣針的端面為圓錐體，直徑為1.6mm,錐度60度，表面光潔度為Ra9.8，且加樣方法中所述步驟a中所述加樣元件離開所述dNTP試劑液時的移動速度為5cm/s，所述步驟b中所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液時的移動速度為4.5cm/s，在測序反應(yīng)液內(nèi)上下運(yùn)動12次后離開測序反應(yīng)液。本實施例所得測序譜圖及其他實驗結(jié)果數(shù)據(jù)(測序時間、加樣重復(fù)精度、均一性)與實施例1所得數(shù)據(jù)為理論誤差范圍內(nèi)的一致性，其加樣重復(fù)精度為95%。最后有必要在此說明的是:以上實施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬`于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:包括以下了步驟:步驟a，通過一加樣元件插入任--種dNTP試劑使得所述加樣元件外周附著所述dNTP試劑；步驟b，將附著所述dNTP試劑的加樣元件插入測序反應(yīng)液中，再使所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液；其中:所述加樣元件包括一實心加樣針及其驅(qū)動裝置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:所述加樣針的直徑小于0.5cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:所述加樣針的針體為圓柱體或長方體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:所述加樣針的加樣端面為平面、半圓體或錐體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:所述加樣針的表面光滑度小于Ra50。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:所述步驟a中所述加樣元件離開所述dNTP試劑液時的移動速度為I 50cm/s。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:所述步驟b中所述加樣元件離開所述 測序反應(yīng)液時的移動速度小于5cm/s。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，其特征在于:所述步驟b中所述加樣元件在所述測序反應(yīng)液中反復(fù)移動至少3次后離開所述測序反應(yīng)液。
9.一種用于焦磷酸核酸測序的加樣裝置，其特征在于:包括一加樣平臺和用于轉(zhuǎn)移dNTP試劑的加樣元件,所述加樣元件包括至少一實心加樣針及其驅(qū)動裝置,所述加樣針為權(quán)利要求2 5任一所述加樣針。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣裝置，其特征在于:所述樣品平臺上依次設(shè)有dNTP試劑槽、清洗槽和測序反應(yīng)槽；所述驅(qū)動裝置為一設(shè)有轉(zhuǎn)軸的圓形加樣針架，所述加樣針貫穿所述加樣針架上的通孔且通過所述加樣針的固定端固定，所述加樣針的固定端直徑大于所述加樣針架上的通孔直徑，所述圓形加樣針架通過所述轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動、或呈X、Y、Z軸方向平動、或同另一轉(zhuǎn)動驅(qū)動裝置呈連動轉(zhuǎn)動。
11.權(quán)利要求9或10所述加樣裝置的應(yīng)用，其特征在于:所述加樣裝置與任一焦磷酸核酸測序裝置聯(lián)用成一焦磷酸核酸測序系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于焦磷酸核酸測序系統(tǒng)的微量加樣方法，包括以下步驟步驟a，通過一加樣元件插入任一dNTP試劑中使得所述加樣元件外周附著所述dNTP試劑；步驟b，將附著所述dNTP試劑的加樣元件插入測序反應(yīng)液中，再使所述加樣元件離開所述測序反應(yīng)液；其中所述加樣元件包括一實心加樣針及其驅(qū)動裝置。本發(fā)明采用一結(jié)構(gòu)簡單的加樣元件即可實現(xiàn)dNTP試劑的微量給樣，摒棄了傳動的中空針管抽噴式的給樣方式，僅通過所述加樣元件的加樣針與液體間的吸附力及其在不同液體中的移動速度差異的控制即可實現(xiàn)微量取樣加樣，加樣重復(fù)精度大于95%，且最小加樣量可達(dá)0.1μL。
文檔編號C12Q1/68GK103205357SQ20131012868
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月14日
發(fā)明者徐曉剛, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:上海聚陣生物科技有限公司