新型麥芽寡糖基海藻糖水解酶、酶基因、含該基因的重組表達載體及重組工程菌及酶的制備的制作方法

專利名稱：新型麥芽寡糖基海藻糖水解酶、酶基因、含該基因的重組表達載體及重組工程菌及酶的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和酶工程領域，具體涉及麥芽寡糖基海藻糖水解酶及其表達基因、含有該基因的重組表達載體及重組工程菌，以及利用含有該基因的重組工程菌制備該酶的方法。
背景技術：
海藻糖(Trehalose)是一種由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基以a _1，1糖苷鍵結合的非還原性糖，分子式為C12H22O11,相對分子量為378.33。其結構式如

圖1所示:
權利要求
1.一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶，其特征是:具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的麥芽寡糖基海藻糖水解酶，其特征是:具有以下特性:(1)最適作用溫度 當pH5.3溫育60 min，最適作用溫度60°C ；(2)最適作用pH 當60°C溫育60 min,最適pH為5.3 ;(3)熱穩定性當于pH5.3溫浴60 min,在高達70°C下穩定； (4)pH穩定性 當于60°C溫浴60 min,在pH4.5-6.5下穩定。
3.根據權利要求1或2所述的麥芽寡糖基海藻糖水解酶，其特征是:由下列任意一種基因表達而得:基因1:含有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的基因；基因2:含有由SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列因遺傳密碼子的兼并性而取代一個或多個堿基所形成的核苷酸序列的基因，該基因的核苷酸序列不改變由SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列；基因3:含有基因I或基因2中互補核苷酸序列的基因。
4.一種表達權利要求1或2所述的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因。
5.根據權利要求4所述的基因，其特征是:含有下列任意一種的核苷酸序列:核苷酸序列1:如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；核苷酸序列2:由SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列因遺傳密碼子的兼并性而取代一個或多個堿基所形成的核苷酸序列，該核苷酸序列不改變由SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列；核苷酸序列3:核苷酸序列I或核苷酸序列2的互補核苷酸序列。
6.含有權利要求4或5所述的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的重組表達載體；所述重組表達載體優選由表達載體pET24a (+)和權利要求5或6所述的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因構建而成。
7.含有權利要求4或5所述的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的重組工程菌。
8.根據權利要求7所述的重組工程菌，其特征是:將權利要求6所述的重組表達載體轉入大腸桿菌中構建而成；所述大腸桿菌優選為大腸桿菌BL21。
9.一種制備麥芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征是:通過培養權利要求7或8所述的重組工程菌制得。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征是:具體包括以下步驟:將重組工程菌在含有0.10-0.30 mMol/L卡那霉素的LB液體培養基中34-37°C培養12-15 h后，降溫至26-29°C，加入終濃度為0.1-0.3 mMol/L的IPTG或者0.3-0.5 mMol/L的乳糖作為誘導劑，在26_29°C下誘導培養12-18 h，然后 離心或過濾收集菌體細胞；將菌體細胞破碎、離心收集上清液，得含麥芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。
全文摘要
本發明公開了一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶、該酶的基因、含有該基因的重組表達載體及重組工程菌及酶的制備方法，所述水解酶具有如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，可以由含有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的基因或該基因的突變體或者它們的互補序列表達而得。本發明水解酶MTHase具有較高的最適反應溫度和熱穩定性，具有較低的最適pH，降低了染菌風險，提高了生產的穩定性，顯著提高了其和普魯蘭酶聯合作用還原性淀粉水解物生產海藻糖的效率。本發明得到表達酶的基因，可通過基因重組技術生產MTHase，酶表達量高，制備效率顯著提高，成本顯著降低，降低了海藻糖的生產成本。
文檔編號C12N9/24GK103194434SQ20131012871
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月15日 優先權日2013年4月15日
發明者陳平平, 張全景, 付吉明, 劉敏, 莊祎, 王喬隆, 李慧君, 鄭秀寧 申請人:山東天力藥業有限公司