治療痛風(fēng)的山竹提取物及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及山竹果皮提取物和其制備方法以及應(yīng)用，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
山竹(garciniamangostanal.)，又名莽吉柿、山竺、山竹子、倒捻子、鳳果，為藤黃科(guttiferae)藤黃屬(garcinia)常綠喬木植物山竹子的果實(shí)，有“綠色水果”之美譽(yù)，號(hào)稱“果中皇后”。山竹生于丘陵地帶或山坡、山谷的密林或疏林中，原產(chǎn)于馬來半島和馬來群島，在東南亞地區(qū)如馬來西亞、泰國(guó)、菲律賓、緬甸栽培較多，我國(guó)廣東、廣西、福建、云南等省也有種植。山竹果肉含豐富的膳食纖維、糖類、維生素b、多種氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪和豐富的礦物質(zhì)，具有較高的食用價(jià)值，對(duì)體弱、病后、營(yíng)養(yǎng)不良有很好的調(diào)養(yǎng)作用。然而，山竹的藥用價(jià)值尚未得到充分的開發(fā)和利用，在東南亞，山竹果皮一直作為泰國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥，用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、化膿、慢性潰瘍、淋病等疾病的治療。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明山竹果皮提取物具有抗氧化、抗菌、抗炎、調(diào)脂、抗輻射和抗腫瘤等活性，但未見用于治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的報(bào)道。痛風(fēng)(gout)是一種由于嘌呤代謝紊亂產(chǎn)生過多尿酸及(或)尿酸排泄減少致尿酸水平升高，并形成尿酸結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)、軟組織、腎臟等引發(fā)的一組代謝性疾病。尿酸是人類嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，通常高尿酸血癥被認(rèn)為是痛風(fēng)的標(biāo)志，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有5％～12％的高尿酸血癥患者最終可發(fā)展為痛風(fēng)。在歐洲、北美、日本等地區(qū)和國(guó)家痛風(fēng)的發(fā)病率較高，但隨著我國(guó)人民生活水平的提高、壽命的延長(zhǎng)、飲食結(jié)構(gòu)的改變、肥胖者的增加，痛風(fēng)的發(fā)病率已較15年前增長(zhǎng)了約15～30倍，已不再是國(guó)人的罕見病。此外，近年的研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥不僅是痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)，同時(shí)與代謝紊亂綜合征密切相關(guān)，是心血管疾病、高血壓、慢性腎臟疾病等獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病，聯(lián)合國(guó)將其列為了21世紀(jì)的20大頑癥之一。然而，痛風(fēng)的治療除抗炎鎮(zhèn)痛等對(duì)癥治療外，主要依賴于促尿酸排泄藥(如丙磺舒、苯溴馬隆等)和黃嘌呤氧化酶抑制劑(如別嘌醇、非布索坦)，非常有限，并且傳統(tǒng)的促尿酸排泄藥常伴隨有皮疹、發(fā)熱、腎臟損害等副作用，而黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇則是臨床上最常使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑，也具有肝臟、骨髓毒性和過敏等不良反應(yīng)，在一定程度上限制了其安全使用；非布索坦為2009年美國(guó)fda批準(zhǔn)上市的新藥，療效好，但遠(yuǎn)期效應(yīng)及毒副反應(yīng)還有待進(jìn)一步觀察。因此，尋找高效低毒的抗高尿酸血癥和痛風(fēng)藥物是目前藥學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供山竹提取物及其制備方法，用于制備防治高尿酸血癥和痛風(fēng)，以及與高尿酸血癥相關(guān)疾病的食品、保健品和藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案包括以下步驟：一種從山竹果皮中制備治療痛風(fēng)提取物的方法，其特征在于所述制備方法是以山竹果皮為原料，經(jīng)提取、濃縮、富集步驟得到，具體包括：a、提取：(1)取山竹果皮鮮品，粗碎成顆粒，加入2～4倍量(v/w)乙醇，浸泡48小時(shí)，共4次，過濾，得濾液。(2)取山竹果皮干品，粉碎，過10目篩，加入2～4倍量(v/w)乙醇(50％)，浸泡48小時(shí)，共2次，過濾；再用2～4倍量(v/w)乙醇，浸泡48小時(shí)，共2次，過濾，得濾液。b、濃縮：合并濾液，于50℃減壓濃縮至無乙醇味，得混懸浸膏；c、富集：(1)混懸浸膏過濾，得棕黃色沉淀及深紅棕色濾液。(2)棕黃色沉淀用10倍量水再混懸，攪拌，過濾，60℃真空干燥，粉碎，得黃棕色粉(山竹提取物i)。(3)取上述(1)中深紅棕色濾液，用水液體積的三分之一三氯甲烷萃取3次，萃取后的水液用大孔吸附樹脂吸附，先用3～5倍柱體積水洗脫，再用75％乙醇溶液洗脫3倍柱體積，收集洗脫液，50℃減壓濃縮，60℃真空干燥，粉碎，得深紅褐色粉(山竹提取物ii)。所得山竹提取物i含總山酮不少于35％～50％(紫外法：以α-倒捻子素為對(duì)照品計(jì))；含α-倒捻子素不少于35％(hplc法)。所得山竹提取物ii含總酚不少于50％～80％(紫外法：以兒茶素為對(duì)照品計(jì))，且其中不含α-倒捻子素、γ-倒捻子素、9-hydroxycalabaxanthone。所得山竹提取物i、ii均具有降血尿酸作用，可用于口服防治痛風(fēng)疾病的食品、保健品、藥物。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取新鮮山竹果皮50kg，用95％乙醇100l浸泡4次，每次48小時(shí)。浸泡液合并，50℃減壓濃縮至無乙醇味，放置過夜(12小時(shí))，過濾，得濾渣1.98kg(深紅棕色濾液17l備用)，加入水20kg，攪拌混懸，過濾，60℃真空干燥，粉碎，得黃棕色粉1.38kg(山竹提取物i)。取上述備用深紅棕色濾液，用三氯甲烷萃取3次，每次6l，萃取后的水液上大孔吸附樹脂(樹脂20kg，層析柱直徑20cm，柱體積為35l)，先用3倍柱體積水洗脫，再用75％乙醇溶液洗脫3倍柱體積，收集洗脫液，50℃減壓濃縮，60℃真空干燥，粉碎，得深紅褐色粉2.65kg(山竹提取物ii)山竹提取物含量見下表：序號(hào)提取物名稱紫外法hplc法1山竹提取物i48.9％39.2％2山竹提取物ii72.6％——實(shí)施例2取山竹果皮干品20kg，粉碎，過10目篩，加入50％乙醇40l，浸泡48小時(shí)，共2次，過濾；再用乙醇80l浸泡48小時(shí)，共2次，過濾；合并4次提取液，50℃減壓濃縮至無乙醇味，放置過夜(12小時(shí))，過濾，得濾渣2.28kg(深紅棕色濾液36l備用)，加入水23kg，攪拌混懸，過濾，60℃真空干燥，粉碎，得黃棕色粉1.62kg(山竹提取物i)。取上述備用深紅棕色濾液，用三氯甲烷萃取3次，每次12l，萃取后的水液上大孔吸附樹脂(樹脂20kg，層析柱直徑20cm，柱體積為35l)，先用3倍柱體積水洗脫，再用75％乙醇溶液洗脫3倍柱體積，收集洗脫液，50℃減壓濃縮，60℃真空干燥，粉碎，得深紅褐色粉2.24kg(山竹提取物ii)。序號(hào)提取物名稱紫外法hplc法1山竹提取物i56.5％44.6％2山竹提取物ii78.1％——實(shí)施例3健康雄性昆明種小鼠(體重18-22g)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號(hào)：scxk(京)2014-0004。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高尿酸血癥模型組、新鮮山竹果皮提取物i、ii組(各20.0mg/kg)和陽性對(duì)照組別嘌呤醇5mg/kg。受試化合物用0.5％羧甲基纖維素鈉(0.5％cmc-na)配制成適宜濃度，灌胃給藥，每天2次，共5個(gè)劑量。參照文獻(xiàn)[hallih，scovillejp，reynoldsdj，simlotr，duncanp.substitutedcyclicimidesaspotencialanti-goutagents.lifesciences.1990，46：923-1927.stavricb，claymans，graddrea，hebertd.someinvivoeffectsintheratinducedbychlorprothixeneandpotassiumoxonatepharmacologyresearch，1975，7：117-124]采用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀為化學(xué)性誘導(dǎo)劑，腹腔注射氧嗪酸鉀400mg/kg，造成高尿酸血癥小鼠，正常對(duì)照組則注射等體積0.5％cmc-na溶液，注射后1h灌胃給予末次劑量的供試品，2h后眶靜脈采血，3000rpm離心10min，取血清，采用磷鎢酸比色法(南京建成生物工程研究所試劑盒)測(cè)定血清尿酸水平。結(jié)果表明，腹腔注射氧嗪酸鉀后動(dòng)物血清尿酸水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，有顯著性差異(p＜0.01)，提示高尿酸血癥模型成功。給予新鮮山竹果皮提取物i、ii后，動(dòng)物血清尿酸水平均明顯降低，降幅分別約為56.6％和62.3％，與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；但弱于陽性對(duì)照藥別嘌醇，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.01)，提示新鮮山竹果皮提取物有較強(qiáng)的降低高尿酸血癥動(dòng)物血尿酸的作用(表1)。表1新鮮山竹果皮提取物對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸的影響(n＝10，)與正常組比較，#p＜0.01；與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01；與別嘌醇組相比，↑p＜0.05，↑↑p＜0.01(t-test).實(shí)施例4干燥山竹果皮提取物降尿酸活性研究(取實(shí)施例1中的山竹提取物)健康雄性昆明種小鼠(體重18-22g)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號(hào)：scxk(京)2014-0004。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高尿酸血癥模型組、干燥山竹果皮提取物i、ii組(各20.0mg/kg)和陽性對(duì)照組別嘌呤醇5mg/kg。受試化合物用0.5％羧甲基纖維素鈉(0.5％cmc-na)配制成適宜濃度，灌胃給藥，每天2次，共5個(gè)劑量。實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3。結(jié)果表明，腹腔注射氧嗪酸鉀后動(dòng)物血清尿酸水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，有顯著性差異(p＜0.01)，提示高尿酸血癥模型成功。給予干燥山竹果皮提取物i、ii后，動(dòng)物血清尿酸水平均明顯降低，與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，降幅分別為60.5％和93.3％；但弱于陽性對(duì)照藥別嘌醇，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.01)，提示干燥山竹果皮提取物有較強(qiáng)的降低高尿酸血癥動(dòng)物血尿酸的作用(表2)。表2干燥山竹果皮提取物對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸的影響(n＝10，)與正常組比較，#p＜0.01；與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01；與別嘌醇組相比，↑p＜0.05，↑↑p＜0.01(t-test).實(shí)施例5山竹果皮提取物體外對(duì)黃嘌呤氧化酶活力的抑制作用(取實(shí)施例1中的山竹提取物)黃嘌呤氧化酶(ec1.1.3.22)為sigma公司產(chǎn)品，用焦磷酸鈉緩沖液配制成適宜濃度備用。山竹果皮提取物用焦磷酸鈉緩沖液配制成系列濃度備用，dmso助溶。系列濃度的山竹果皮醇提物溶液與黃嘌呤氧化酶在25℃孵育15min后，參照文獻(xiàn)方法[朱深銀，周遠(yuǎn)大，劉慶山，杜冠華.黃嘌吟氧化酶抑制劑高通量篩選模型的建立及應(yīng)用.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(3)：187-190]測(cè)定黃嘌呤氧化酶的活性，結(jié)果表明山竹果皮提取物ii對(duì)黃嘌呤氧化酶的活性有一定抑制作用，終濃度為100mg/l時(shí)其抑制率達(dá)45.6％，山竹果皮提取物i則沒有黃嘌呤氧化酶抑制作用(表3)。表3.山竹果皮提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用(x±s，n＝3)實(shí)施例6：山竹果皮提取物初步的毒性和安全性研究(取實(shí)施例1中的山竹提取物)選擇健康的icr小鼠30只，雄雌各半，體重18-22g，山竹果皮提取物i、ii用0.5％羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，動(dòng)物過夜禁食后于上午9時(shí)按5.0g/kg體重灌胃給藥一次，對(duì)照組給予0.5％羧甲基纖維素鈉，給藥后連續(xù)觀察14天，記錄動(dòng)物中毒和死亡情況。灌胃給藥后，動(dòng)物未出現(xiàn)明顯的異常反應(yīng)，14天連續(xù)觀察，未見動(dòng)物出現(xiàn)任何中毒反應(yīng)，活動(dòng)自如，進(jìn)食飲水和大小便均正常，體重正常增長(zhǎng)，一般情況良好。30只動(dòng)物無一死亡，處死動(dòng)物后尸檢，各臟器未見肉眼可見的病理改變，測(cè)得山竹果皮提取物i、ii小鼠灌胃給藥的最大耐受量均大于5.0g/kg。最后應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。當(dāng)前第1頁12