一種從野菊花中提取的多糖在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種從野菊花中提取的多糖在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于從傳統(tǒng)中藥材中提取有效提高機(jī)體免疫力的藥物活性成分，尤其是將從中藥材野菊花中的多糖成分用于制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥物的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，越來(lái)越多的上班族由于過(guò)度勞累、焦慮不安、運(yùn)動(dòng)不足和飲食失衡等因素的影響，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫力低下。如何尋找一種既安全又價(jià)格低廉的增強(qiáng)免疫力的來(lái)自天然的藥物，是本領(lǐng)域科研人員一直孜孜不倦努力尋找的目標(biāo)。野菊花為菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.北野菊C. boreale Mak.或巖香菊C. Iavandulaefolium (Fisch. )Mak.的頭狀花序。生于山坡草地、灌叢、河邊水濕地，海濱鹽潰地及田邊、路旁，巖石上。資源分布分布于吉林、遼寧、河北、河南、山西、陜西、甘肅、青海、新疆、山東、江蘇、浙江、安徽、福建、江西、湖北、四川、云南、湖南等地。野菊花含有大量的多糖成分，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、治療糖尿病、抗病毒、抗輻射、調(diào)節(jié)性功能、調(diào)血脂等藥理作用。野菊花多糖(Chrysanthemum indicum polysaccharide,CIP)具有防衰老和清除活性氧自由基等方面作用，但對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明對(duì)中藥多糖的增強(qiáng)免疫力的功效進(jìn)行了深入研究，為尋找新型免疫調(diào)節(jié)劑及抗腫瘤藥物提供了廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是利用價(jià)格低廉的常用中藥材野菊花，從中提取野菊花多糖，制備具有提高機(jī)體免疫力的天然藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案取干燥的野菊花藥材500 g，以水為提取劑，按料液比1:32，于90 °C水浴中浸提I h，連續(xù)提取3次，過(guò)濾，合并水提液，濃縮后加入5倍量的95%乙醇靜置24 h。醇沉后的沉淀抽濾后依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚進(jìn)行洗滌，干燥后得野菊花粗多糖粉末。而后利用LSA-21大孔吸附樹脂，于溫度40 °C、pH 5、流速3 BV/h對(duì)其進(jìn)行純化，接收液按前述醇沉方法，得較純的野菊花多糖粉末，蒽酮-硫酸法檢測(cè)多糖含量為81. 29%。灌胃(ig)時(shí)分別用生理鹽水配成濃度為4(T20 g · L-1的野菊花多糖溶液。最后將提取得到的野菊花多糖成分與常用的輔料相結(jié)合，制備得到各種劑型的增強(qiáng)免疫力的藥物。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
儀器、試劑與材料1.1.1動(dòng)物
ICR小鼠，雄性，體重18 22 g，由江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào) SCXK (蘇)2007-0001。
儀器
Spectrumlab 752S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司
梅特勒萬(wàn)分之一電子天平瑞士
梅特勒十萬(wàn)分之一電子天平瑞士
HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市奧瑞電器廠
TDL-5-A型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠
Microfuge 16 型離心機(jī)德國(guó) Beckman Coulter
I. I. 3試劑注射用環(huán)磷酰胺江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)11061421
氯化鈉注射液南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)2011081805
野菊花江蘇南京藥業(yè)股份有限公司中藥飲片廠二硝基氟苯(DNFB)溶液稱取DNFB50 mg置于干燥潔凈的具塞小瓶中，將預(yù)先配好的5 mL丙酮麻油溶液(II)，倒入小瓶并用膠布密封，混勻后使用，新鮮配制。補(bǔ)體(豚鼠血清)抽取4只豚鼠心臟血，雌雄各半，分離新鮮血清，混合后備用，臨用時(shí)生理鹽水稀釋I : 10。雞紅細(xì)胞(5%CRBC):取新鮮雞血，除去纖維蛋白，離心得壓積紅細(xì)胞，臨用時(shí)用生理鹽水洗滌三次，配成5%混懸液即可。受試藥物
野菊花多糖制備取干燥的野菊花藥材500 g，以水為提取劑，按料液比1:32，于90 V水浴中浸提I h，連續(xù)提取3次，過(guò)濾，合并水提液，濃縮后加入5倍量的95%乙醇靜置24 h。醇沉后的沉淀抽濾后依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚進(jìn)行洗滌，干燥后得野菊花粗多糖粉末。而后利用LSA-21大孔吸附樹脂，于溫度40 °C、pH 5、流速3 BV/h對(duì)其進(jìn)行純化，接收液按前述醇沉方法，得較純的野菊花多糖粉末，蒽酮-硫酸法檢測(cè)多糖含量為81. 29%。ig時(shí)用生理鹽水配成濃度為40 g · Γ1,即野菊花多糖高濃度溶液。實(shí)驗(yàn)方法
I. 2. I動(dòng)物分組及給藥
將ICR雄性小鼠隨機(jī)分為3個(gè)組正常對(duì)照組、模型組及野菊花多糖高劑量組，每組10只。各組小鼠每天ig I次，連續(xù)ig 14 d，正常對(duì)照組和模型組分別ig生理鹽水10mL · kg-1 · (Γ1,野菊花多糖高劑量組ig等體積的野菊花多糖溶液400 mg · kg-1 · (Γ1。于ig的第10天開始，正常對(duì)照組經(jīng)腹腔注射生理鹽水10 mL · kg—1 · cf1，連續(xù)4 d ;模型組及野菊花多糖高劑量組分別經(jīng)腹腔注射等體積的環(huán)磷酰胺100 mg · kg—1 · (Γ1,連續(xù)4 do對(duì)免疫功能低下小鼠碳廓清能力影響的檢測(cè)
給藥第14天,ig 2 h后尾靜脈注射印度墨汁0.1 ml/10g,于I U1)和5 (t2) min后分別經(jīng)眼眶靜脈采血20 yL，加至2 mL O. 1% Na2CO3中，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)680 nm處測(cè)定吸光度04)，采血后將小鼠脫頸處死，摘取肝、脾及胸腺稱重，按下式計(jì)算廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(α )，并計(jì)算臟器指數(shù)。K =(logA「logA5)/(t2_ ti) =Iog(A1A5)/4α =體重/ (肝重+脾重)X K173
臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/小鼠體重(g)I.2. 3對(duì)免疫功能低下小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)影響的檢測(cè)
給藥第9天時(shí)用5%硫化鈉溶液給每只小鼠腹部脫毛，面積約3X3 cm2。第10天，給每只小鼠腹部涂抹DNFB溶液致敏，進(jìn)行初次免疫(致敏)。致敏后4 d，用DNFB溶液均勻涂抹小鼠右耳廓內(nèi)外兩面進(jìn)行攻擊。攻擊24 h后頸椎脫白處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 _的耳片，稱重。小鼠的耳腫脹度(右耳片重減去左耳片重的差值)表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素影響的檢測(cè)
給藥第7天時(shí)，每鼠腹腔注射5%的雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2 mL進(jìn)行免疫。免疫7天后，摘眼球取血，離心，取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清I mL，與5%雞紅細(xì)胞懸液O. 5 mL、10%補(bǔ)體O. 5 mL混合，另設(shè)不加血清的空白管作對(duì)照，在37 °C恒溫水浴鍋保溫30 min后，冰水浴終止反應(yīng)。離心，取上清液于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)540 nm處測(cè)定吸光度值。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
數(shù)據(jù)以表示，用SPSS
19. O對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。Pd 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
I.3. I對(duì)免疫功能低下小鼠碳廓清能力的影響
與正常對(duì)照組相比，模型組各指數(shù)均顯著下降(/X0.01);與模型組相比，野菊花多糖高劑量組小鼠的碳廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)以及脾指數(shù)與胸腺指數(shù)均升高，差異呈現(xiàn)顯著性O(shè)°〈0. 01 或/X0. 05)。結(jié)果見(jiàn)表 I。表I野菊花多糖高劑量組對(duì)免疫功能低下小鼠碳廓清能力的影響(，n=10)
權(quán)利要求
1.一種從野菊花中提取的多糖在制備提高機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的一種從野菊花中提取的多糖在制備提高動(dòng)物免疫力藥物中的應(yīng)用，其特征為采用以下的提取工藝取干燥的野菊花藥材500 g，以水為提取劑，按料液比1:32，于90 °C水浴中浸提I h，連續(xù)提取3次，過(guò)濾，合并水提液，濃縮后加入5倍量的95%乙醇靜置24 h ;醇沉后的沉淀抽濾后依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚進(jìn)行洗滌，干燥后得野菊花粗多糖粉末；而后利用LSA-21大孔吸附樹脂，于溫度40 °C、pH 5、流速3 BV/h對(duì)其進(jìn)行純化，接收液按前述醇沉方法，得較純的野菊花多糖粉末，蒽酮-硫酸法檢測(cè)多糖含量為81. 29% ；ig時(shí)分別用生理鹽水配成濃度為40-20 g · Γ1的野菊花多糖溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的一種從野菊花中提取的多糖在制備提高動(dòng)物免疫力藥物中的應(yīng)用，其特征為將提取得到的野菊花多糖成分與常用的輔料相結(jié)合，制備得到各種劑型的增強(qiáng)免疫力的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于從傳統(tǒng)中藥材中提取有效提高機(jī)體免疫力的藥物活性成分的領(lǐng)域。技術(shù)方案為取干燥的野菊花藥材500g，以水為提取劑于90℃水浴中浸提1h，連續(xù)提取3次，過(guò)濾，合并水提液，濃縮后加入5倍量的95%乙醇靜置24h。醇沉后的沉淀抽濾后依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚進(jìn)行洗滌，干燥后得野菊花粗多糖粉末。而后利用LSA-21大孔吸附樹脂對(duì)其進(jìn)行純化，接收液按前述醇沉方法，得較純的野菊花多糖粉末，蒽酮-硫酸法檢測(cè)多糖含量為81.29%。灌胃(ig)時(shí)分別用生理鹽水配成濃度為40~20g·L-1的野菊花多糖溶液。最后將提取得到的野菊花多糖與常用輔料相結(jié)合，制備得到各種劑型的增強(qiáng)免疫力的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/715GK102688255SQ20121021496
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月27日
發(fā)明者任愛(ài)農(nóng) 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院