本發明涉及一種納米酶制劑的制備方法及其產品和應用。
背景技術：
1、慢性炎癥以免疫細胞和炎癥介質為特征，會不可逆轉地損害人體組織，是多種疾?。ㄈ缧难芗膊 ⑻悄虿『桶┌Y）的關聯危險因素。重要的是，炎癥與大多數類型癌癥的發展和惡性進展的所有階段以及抗癌治療的效果密切相關。結腸炎相關結腸癌（colitis-associated?colorectal?cancer,?cac）是一種致命的惡性腫瘤，它由長期且反復發作的炎癥性腸?。╥nflammatory?bowel?disease,?ibd）所引發。與散發性結腸癌不同，結腸炎相關癌是通過由慢性炎癥驅動的獨特致病機制發展而來的，其預后更差。潰瘍性結腸炎會使結腸炎持續時間超過30年的患者患結腸癌的風險增加高達18%至20%，而克羅恩病患者這一風險則會增加高達8%。炎癥微環境通過多條途徑為癌變創造了一個有利的環境。活性氧（reactive?oxygen?species,?ros），活性氮（reactive?nitrogen?species?,?rns）和炎癥介質的過度產生會導致dna損傷和基因突變。此外，過多的中性粒細胞和巨噬細胞浸潤可以產生諸如白細胞介素-1β（il-1β）和腫瘤壞死因子-α（tnf-α）等促炎性細胞因子，激活癌癥信號通路，從而促進上皮細胞增殖、抑制細胞凋亡，并加速異常細胞的克隆性擴增，從而促進腫瘤的發展。
2、炎癥性腸病的一線常規藥物治療通常包括非甾體類抗炎藥和生物制劑（如腫瘤壞死因子抑制劑），其主要作用是減輕炎癥并提供暫時緩解。然而，對于病情長期嚴重、炎癥活動度高或已出現中性粒細胞和巨噬細胞浸潤的患者，僅僅抑制炎癥可能不足以阻止慢性活動性結腸炎的進展。因此，對于結腸炎的理想治療方案不僅應包括立即抑制炎癥，還應減少過度的免疫細胞浸潤。我們根據臨床樣本和數據庫數據分析，發現cxcl2和cxcr2在結腸炎和結腸腫瘤疾病部位表達升高；慢性炎癥中的腸上皮細胞和免疫細胞會分泌cxcl2，通過與cxcr2結合來吸引中性粒細胞和巨噬細胞，從而加劇慢性炎癥并提高致癌風險。并且，慢性炎癥環境會持續促進中性粒細胞和巨噬細胞分泌cxcl2，形成炎癥-致癌的反饋循環。簡言之，cxcl2通過吸引中性粒細胞和巨噬細胞并使其活化來推動結腸炎向癌癥的轉變，協同促進炎癥微環境。因此，針對cxcl2、中性粒細胞和巨噬細胞的治療策略將是控制癌前病變進展的有前景方法。
3、人工模擬酶旨在通過工程材料來模擬天然酶的獨特催化活性。伴隨著納米技術的進步，人們發現了具有模擬酶催化活性的納米材料，即納米酶。研究者已經發現可模擬多種天然酶活性的納米酶，包括類超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase,?sod）、類過氧化氫酶（catalase,?cat）、類過氧化物酶（peroxidase,?pod）、類氧化酶（oxidase）和類水解酶（hydrolase）等納米酶。相比于天然酶，納米酶具有穩定性、低廉性、循環利用性、活性可調控和長效催化等優點。因此，越來越多的納米酶被開發并應用于生物醫學領域。抗氧化納米酶在多種與炎癥相關的疾病中表現出顯著的治療潛力，包括炎癥性腸病、心血管疾病、類風濕性關節炎、痛風性關節炎等。gu等人發現普魯士藍納米酶（prussian?blue,?pb）可以模擬sod、cat和pod的催化活性。具有多種類酶活性的pb能夠通過清除細胞內ros來保護細胞。體內實驗也證明pb對脂多糖誘導的小鼠肝炎模型具有顯著的治療效果。這一結果表明納米酶具有緩解體內和ros相關的炎癥或損傷的作用。同時pb作為活性分子已獲fda批準用于放射性銫和鉈的解毒劑，證明pb具有良好的生物安全性，能夠支持它被應用到生物體內去治療炎癥相關疾病。但是pb本身不具有靶向性，因此需要借助或利用其他科學方法來賦予其靶向性。
4、1994年，gaudreault第一次制備紅細胞囊泡，并利用其作為藥物載體，研究抗腫瘤效果。2011年，zhang課題組首次采取自上而下的策略，將紅細胞膜與納米顆粒相結合，制備出紅細胞膜包裹的納米顆粒，作為一種仿生平臺遞送納米顆粒。目前，細胞膜作為一種遞送系統，可以將納米顆粒遞送到病灶部位。與傳統的遞送系統相比，這些細胞膜包裹模擬物表現出優異的生物相容性，并通過受體-配體相互作用保留了主動靶向的細胞特性。巨噬細胞是先天免疫系統的一部分，在體內清除不需要的或外來的物質/細菌/病毒。在炎癥相關疾病中，炎性組織會分泌多種細胞因子和趨化因子。巨噬細胞膜因其表面的ccr2，cxcr1，ccr7等受體，可以與趨化因子結合，促進它們在炎癥部位的募集，具有炎癥靶向性。同時，巨噬細胞膜上的受體如tnfr、il-1r，能夠結合促炎因子tnf-α、il-1β，清除炎癥部位的促炎因子，減輕炎癥。因此，巨噬細胞膜修飾能賦予納米顆粒炎癥靶向性和清除促炎因子的能力，在炎癥疾病治療領域具有廣闊的潛力。
技術實現思路
1、發明目的：本發明的目的是提供一種兼具疾病預防和治療功能的納米酶制劑的制備方法及其產品和應用，通過減輕氧化應激和減輕免疫細胞的浸潤這雙重作用來抑制腸炎向結腸癌的轉變。
2、技術方案：本發明提供一種納米酶制劑的合成方法，包括以下步驟：
3、（1）通過細胞工程化技術對細胞進行改造，使細胞表達所需要的目標膜蛋白，提取細胞膜，分散在a液中；
4、（2）將一種或多種納米酶分散在生物相容性好的a液中；
5、（3）將步驟（1）和步驟（2）所得溶液下混合，通過超聲設備、微流控設備和共擠出設備等制備納米酶制劑。
6、其中，所述合成方法還包括收集步驟（3）中的產物，進行如離心和凍存處理的一種或多種。
7、其中，步驟（1）中步驟（1）中所述跨膜蛋白包括ccr2、ccr4、ccr8、pd-l1、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cd47、cd55、cd59、gpibα、gpiv、gpv、gpvi、gppix、clec-2、tnf-αr、il-1r、lfa-1等中的一種或多種組合。
8、優選地，所述跨膜蛋白為cxcr2。
9、其中，用于表達步驟（1）中所述跨膜蛋白的細胞包括raw264.7、hl-60、caco-2、ht-29、hct116、sw480、j774、4t1、mc-38、ct-26、huvec、3t3-l1、thp-1和293t等細胞系中一種或多種組合。
10、優選地，所述具有較好靶向炎癥部位的細胞為巨噬細胞raw264.7細胞系。
11、其中，步驟（1）中所述a液包括磷酸鹽緩沖液、生理鹽水或水中的一種或多種組合。
12、其中，步驟（2）中所述納米酶包括氧族化合物納米酶、氮族化合物納米酶、碳族化合物納米酶、金屬納米酶、金屬化合物基納米酶、有機金屬框架基納米酶、金屬配位納米酶、單原子納米酶或復合材料納米酶（注：通過混合納米酶與細胞膜，隨后利用設備共擠出來制備，納米酶尺寸需要小于擠出膜孔徑一半大小即可，根據納米酶合成方法，以上納米酶尺寸都能控制在對應大?。?。
13、其中，所述氧族化合物納米酶包括氧化物基納米酶、硫化物基納米酶、硒化物基納米酶或碲化物基納米酶等中的一種或多種組合。
14、進一步地，氧化物基納米酶包括氧化鈰基納米酶、氧化錳基納米酶、氧化銅基納米酶、氧化鐵基納米酶、氧化鎳基納米酶、氧化鈷基納米酶、氧化鋯基納米酶、氧化鉿基納米酶等的一種或多種組合。
15、其中，所述氮族化合物納米酶包括氮化物基納米酶或磷化物基納米酶等中的一種或多種組合。
16、其中，所述碳族化合物納米酶包括富勒烯基納米酶、碳纖維基納米酶、碳納米管基納米酶、石墨烯基納米酶或其他碳基納米酶的一種或者多種組合。
17、其中，所述金屬納米酶包括金納米酶、銅納米酶、銀納米酶、鉑納米酶、鈀納米酶、銠納米酶、釕納米酶或合金納米酶等中的一種或多種組合。
18、其中，所述金屬化合物基納米酶包括鐵氧化物納米酶、二氧化鈦基納米酶、錳氧化物納米酶、釩氧化物納米酶、鉬硫化物基納米酶、鐵硫化物基納米酶、銅硫化物基納米酶、金屬硒化物基納米酶、金屬磷化物納米酶等中的一種或幾種。
19、其中，有機金屬框架基納米酶包括鐵基有機金屬框架納米酶、錳基有機金屬框架納米酶、鋅基有機金屬框架納米酶、銅基有機金屬框架納米酶、鎵基有機金屬框架納米酶、鋯基有機金屬框架納米酶、鉿基有機金屬框架納米酶、釩基有機金屬框架納米酶、金屬摻雜的有機金屬框架納米酶的一種或多種組合。
20、優選地，所述納米酶為有機金屬框架基納米酶；所述有機金屬框架基納米酶為鐵基有機金屬框架納米酶。
21、其中，所述鐵基有機金屬框架納米酶的前體包括有機金屬鹽、鹵化金屬鹽、硝酸金屬鹽、醋酸金屬鹽、硫酸金屬鹽或金屬氰化配合物等中的一種或多種的組合。
22、其中，所述鹵化金屬鹽包括溴化金屬鹽。
23、其中，所述金屬氰化配合物包括單核金屬氰化配合物、雙金屬氰化配合物、過渡金屬氰化配合物、貴金屬氰化配合物或多核金屬氰化物等中的一種或多種的組合。
24、優選地，所述鐵基有機金屬框架納米酶的前體為金屬氰化配合物或氯化金屬鹽及其組合。
25、其中，所述金屬氰化配合物包括單核金屬氰化配合物、混合配體金屬氰化配合物或多金屬氰化配合物等一種或多種的組合。
26、優選地，所述金屬氰化配合物為單核金屬氰化配合物。
27、其中，所述單核金屬氰化配合物包括鐵氰化物和亞鐵氰化物等中的一種或多種的組合。
28、優選地，所述單核金屬氰化配合物為鐵氰化鉀。
29、其中，鐵基有機金屬框架納米酶含有的非鐵金屬元素的前體包括有機金屬鹽、鹵化金屬鹽、硝酸金屬鹽、醋酸金屬鹽、硫酸金屬鹽或金屬氰化配合物等中的一種或多種的組合。
30、其中，所述鹵化金屬鹽包括氯化金屬鹽、溴化金屬鹽。
31、其中，所述鐵基有機金屬框架納米酶含有的非鐵金屬元素包括鋰元素、鎂元素、鋁元素、鉀元素、鈣元素、鈧元素、鈦元素、釩元素、鉻元素、錳元素、鈷元素、鎳元素、銅元素、鋅元素、鎵元素、鍺元素、銣元素、鍶元素、銥元素、鋯元素、鈮元素、鉬元素、釕元素、銠元素、鈀元素、銀元素、錫元素、銻元素、鈰元素、鉿元素、銥元素、鉑元素、金元素或鉍元素中的一種或多種組合。
32、其中，所述非鐵金屬元素的前體包括有機金屬鹽、鹵化金屬鹽、硝酸金屬鹽、醋酸金屬鹽、硫酸金屬鹽或金屬氰化配合物中的一種或多種的組合。
33、其中，步驟（2）中a液為磷酸鹽緩沖液、生理鹽水和超純水等中的一種或多種組合。
34、優選地，a液為磷酸鹽緩沖液。
35、本發明還提供一種由所述方法制備的納米酶制劑，納米酶制劑為核殼結構，外層為細胞膜，核心為納米酶。
36、本發明還提供所述的納米酶制劑在治療、緩解和/或預防結腸疾病等中的應用。
37、其中，所述結腸疾病為廣泛涉及結腸的疾病，包括慢性腸炎、急性腸炎、結腸炎等相關疾病。
38、其中，所述慢性腸炎疾病包括潰瘍性腸炎、克羅恩病等。
39、其中，所述急性腸炎包括偽膜性腸炎、細菌、病毒感染性腸炎等。
40、其中，所述結腸炎相關疾病包括結腸炎相關結腸癌、腸狹窄、腸息肉或中毒性巨結腸等。
41、在一個實施方案中，所述結腸炎相關疾病包括潰瘍性腸炎、克羅恩病、結腸炎相關結腸癌等。
42、優選地，所述疾病為結腸炎相關結腸癌。
43、其中，納米酶制劑是由具有靶向細胞膜和納米酶組成的。所述的靶向細胞膜來自具有炎癥靶向性巨噬細胞。所述的納米酶是具有清除ros能力的納米酶。所述的納米酶制劑是指通過細胞膜與納米酶共筑形成的材料。
44、本發明利用納米酶制劑的靶向與ros消除能力，靶向結腸炎相關結腸癌疾病部位，一方面納米酶清除ros達到抗氧化的作用，以緩解疾病病理部位過度炎癥狀態；另一方面，改造的細胞膜通過清除疾病部位的cxcl2，抑制中性粒細胞和巨噬細胞的募集，減輕對疾病部位的損傷，緩解結腸炎向結腸癌的惡性轉化。
45、本發明對巨噬細胞進行改造，使其膜表面高表達cxcr2，可以清除疾病部位的cxcl2，抑制中性粒細胞和巨噬細胞在疾病的浸潤。隨后利用細胞膜包裹pb納米酶制備納米酶制劑。這種細胞樣人工酶納米制劑，繼承了內部核心的抗氧化催化活性以及來源細胞的生物界面特性。納米制劑的類酶活性能夠通過清除ros來顯著抑制炎癥，而其生物界面特性則可用于通過特定的受體-配體結合來中和諸如細胞因子和趨化因子等免疫調節分子。具有細胞樣特征的人工酶在解決從結腸炎到結腸癌的惡化問題方面具有很大的潛力，是一種可以同時實現預防和治療結腸炎相關結腸癌疾病的方法。
46、本發明首次提出利用改造的細胞膜包裹納米酶，利用納米酶制劑的多種抗氧化類酶活性（類sod、類cat活性等）和對cxcl2的清除，對結腸炎相關結腸癌病理部位的生態位進行調控，利用構建的巨噬細胞膜以實現納米酶的靶向性，一方面可以有效地清除疾病部位的ros，緩解氧化應激；另一方面，利用細胞膜上的cxcr2受體清除cxcl2，抑制中性粒細胞和巨噬細胞浸潤從而達到結腸病理微環境的修復，可實現結腸炎相關結腸癌疾病的治療、緩解和/或預防。
47、有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下顯著優點：
48、1、兼具疾病預防和治療的功能：本發明利用所構筑的病理環境靶向模塊和納米酶本身的抗炎性能對結腸炎相關結腸癌進行預防和治療。一方面，本發明構筑的納米酶制劑靶向結腸病變部位，清除疾病部位的ros，緩解氧化應激；另一方面，細胞膜靶向模塊可以清除疾病部位的cxcl2，抑制中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤，恢復結腸生態位，預防和治療結腸炎相關結腸癌。
49、2、使用安全，滿足臨床需要：本發明中使用的納米酶，其核心成分獲得fda批準，具有很高的安全性。具有抗氧化活性的納米酶減輕了結腸炎惡化的情況，緩解了結腸炎相關結腸癌的疾病狀況，滿足臨床的治療需求。
50、3、高效的ros消除能力：由于納米酶消除ros作用與傳統抗氧化藥物分子和天然酶不同，抗氧化劑消除ros需消耗大量藥物分子，在攝取足夠多藥物后才能維持ros消除能力；而天然抗氧化酶存在易變性、成本高等不足。本發明中所研發的ros消除納米酶，是一類具有sod和cat類活性的酶模擬物，可在生物體內持續催化，這種級聯催化方式可以高效清除ros，從而治療結腸炎相關疾病，作用高效且副作用低。
51、4、具有制備工藝簡單、原料成本低等優勢，便于工業化生產和臨床轉化。