本發明涉及生物醫學檢測，特別涉及一種可穿戴式微針傳感器的制備及其在原位黑素瘤早期可視化檢測中的應用。
背景技術：
1、皮膚黑素瘤是一種由神經脊中產生的黑色素細胞功能失調和異常增殖引起的惡性腫瘤。該細胞產生的棕色黑色素可以保護皮膚免受太陽有害輻射。當長期遭受紫外線照射時，會引起黑色素細胞的異常增殖而導致皮膚黑素瘤，這也是黑素瘤發病的主要因素。皮膚黑素瘤可通過淋巴系統和血液循環轉移至身體其他器官，嚴重威脅患者的生命健康。
2、目前，黑素瘤臨床上傳統的診斷方法包括：（a）根據abcde法則進行初步肉眼觀察，評估皮膚病灶的不對稱性、邊界不規則、顏色不均一、皮膚病灶的不對稱性、邊界不規則、顏色不均一、直徑大于6?mm及外觀是否有進展增大的趨勢。（b）皮膚鏡檢查和（c）影像學檢查用以輔助檢查，觀察腫瘤是否發生了轉移及提高診斷準確性。（d）活檢組織病理學，對1至3毫米的側緣和全厚度深度完成活檢，評估其浸潤深度（布雷斯洛厚度）。雖然abced法則能夠對皮膚黑素瘤進行一個快速的初篩，但其比較依賴于醫生的專業知識與經驗，導致在某些程度上準確度稍有降低。且視覺觀察的準確率僅為65%左右，受到觀察者缺乏經驗和主觀偏見的阻礙。皮膚鏡檢查盡管提供了更高的準確性，但仍存在大量的誤診或漏診。而活檢組織病理學作為目前黑素瘤診斷的金標準，雖然能夠準確診斷出皮膚黑素瘤并可以對相應的分期進行分類，但其也存在檢測時間長，具有疼痛性、創傷性及檢測成本較高，所以會導致患者的依從性降低。
3、除了臨床上常用診斷方法外，還可以通過識別與疾病相關的生物標志物，實現皮膚黑素瘤的早期快速準確篩查的方法。各種常見的黑色素細胞標志物，如s100、hmb45、melan?a、酪氨酸酶（tyr）、mitf和sox10等都有助于黑素瘤的檢測和亞型分型，可以準確識別皮膚黑素瘤，做出精準治療，大大提高患者生存率。其中酪氨酸酶在皮膚黑素瘤的早期臨床管理中具有重要價值。作為黑素細胞分化的特異性分子標志物，在組織中的表達水平有助于病理醫師進行準確的診斷和分型。在疾病監測方面，通過高靈敏度rt-pcr技術檢測外周血中的酪氨酸酶mrna，能夠早于影像學方法發現循環腫瘤細胞和微轉移灶，這對評估患者術后復發風險、進行精確分期和預后判斷具有關鍵意義。這種"液態活檢"方法為早期黑素瘤患者提供了重要的分子監測手段，有助于指導臨床決策和實現早期干預。
4、目前，基于酪氨酸酶的檢測大多依賴于傳統的人體血清檢測，在取樣過程中不可避免地會給患者帶來組織損傷、潛在感染和心理壓力。此外，血液樣本中含有多種干擾成分（如免疫球蛋白g、血清白蛋白、肌紅蛋白等），嚴重影響分析的靈敏度和可靠性。而皮膚間質液位于皮膚表層，采集過程相對無創，避免了抽血帶來的疼痛與感染風險，且其物質濃度與血液具有高度相關性，能實時、連續地反映生理狀態，同時成分相對簡化（不含血細胞及部分大分子干擾物），更有利于開發小型化、高靈敏的即時檢測設備。
5、微針因其具備物理刺穿皮膚表層、直達深層組織的能力，且操作簡單、快速、連續、無痛、微創等優點，在皮膚表面及皮下生物標志物監測領域日益受到青睞。然而，微針技術仍存在局限：（1）皮膚真皮層中的間質液（isf）含量較低（約占皮膚體積的15-30%），單次微針提取的樣本量通常僅為微升（μl）甚至納升（nl）級別，這限制了對低濃度生物標志物的檢測靈敏度；（2）isf中的某些酶或代謝物容易降解，需要即時分析或特殊保存條件。因此，開發兼具高靈敏度和即時分析能力的新方法具有重要意義。
6、目前，表面增強拉曼散射技術在細菌、生物標志物等方面的應用日益興起，具有高靈敏度和分子特異性等優勢，比色可視化法則能通過化學物質與目標待檢物之間的相互作用，短時間內發生肉眼可見的顏色變化，且能通過顏色強弱初步對目標物進行半定量，從而快速指示可疑區域并判斷大概的疾病進展，能夠實現一種快速、即時的初篩。
7、因此，開發一種集多孔微針（mn）、比色可視化與表面增強拉曼散射（sers）技術于一體的可穿戴式微針傳感器實現原位黑素瘤早期可視化檢測具有重要現實意義。
技術實現思路
1、本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子的制備方法。
2、本發明的另一目的在于提供所述方法制備得到的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子。
3、本發明的再一目的在于提供所述金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子的應用。
4、本發明的目的通過下述技術方案實現：
5、一種金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子的制備方法，包括如下步驟：
6、s1、氧化亞銅納米粒子的制備：
7、將十六烷基磺酸鈉溶解到水中，然后加入氯化銅水溶液、氫氧化鈉水溶液和鹽酸羥胺水溶液，室溫下攪拌反應，待反應結束后，離心洗滌，再重懸到無水乙醇中，得到氧化亞銅納米粒子乙醇溶液；
8、s2、金刻蝕氧化亞銅納米粒子的制備：
9、將十六烷基磺酸鈉溶解到無水乙醇中，依次加入步驟s1中得到的氧化亞銅納米粒子乙醇溶液、氫氧化鈉水溶液和氯金酸水溶液，攪拌反應，待反應結束后，離心洗滌，重懸到無水乙醇中，得到金刻蝕氧化亞銅納米粒子初始溶液；再加入吐溫-80繼續攪拌反應，待反應結束后，離心洗滌，重懸在無水乙醇中，得到金刻蝕氧化亞銅納米粒子乙醇溶液；
10、s3、金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（cu2o@au-ag）的制備：
11、向步驟s2中得到的金刻蝕氧化亞銅納米粒子乙醇溶液中加入硝酸銀水溶液進行反應，待反應結束后，離心洗滌，得到金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（cu2o@au-ag）。
12、進一步地，步驟s1中所述的氯化銅水溶液的濃度為50～500?mmol/l；優選為250mmol/l。
13、進一步地，步驟s1中所述的氫氧化鈉水溶液的濃度為0.5～5?mol/l；優選為2mol/l。
14、進一步地，步驟s1中所述的鹽酸羥胺水溶液的濃度為100～250?mmol/l；優選為200?mmol/l。
15、進一步地，步驟s1中所述的十六烷基磺酸鈉、氯化銅、氫氧化鈉和鹽酸羥胺的摩爾比為1：（0.12～1.19）：（0.50～4.95）：（0.06～0.15）；優選為1?:?0.6?:?2.0?:?0.12。
16、進一步地，步驟s1中所述的水為去離子水。
17、進一步地，步驟s1中所述的水用于溶解十六烷基磺酸鈉，其用量可以根據實際情況進行調整；優選為按每毫克十六烷基磺酸鈉配比0.3～1?ml水計算；更優選為按每毫克十六烷基磺酸鈉配比0.65?ml水計算。
18、進一步地，步驟s1中所述的攪拌反應的時間為0.5～1.5h；優選為1h。
19、進一步地，步驟s2中所述的氫氧化鈉水溶液的濃度為1～7?mmol/l；優選為3mmol/l。
20、進一步地，步驟s2中所述的氯金酸水溶液的濃度為0.3～0.9?mmol/l；優選為0.7mmol/l。
21、進一步地，步驟s2中所述的十六烷基磺酸鈉、氧化亞銅納米粒子、氫氧化鈉和氯金酸的摩爾比為1?:?0.00379?:?（0.0632～?0.442）?:?（0.00758～0.0227）；優選為1?:0.00379?:?0.190?:?0.0177。
22、進一步地，步驟s2中所述的無水乙醇用于溶解十六烷基磺酸鈉，其用量可以根據實際情況進行調整，優選為按每毫克十六烷基磺酸鈉配比0.03～0.05?ml無水乙醇計算；更優選為按每毫克十六烷基磺酸鈉配比0.038?ml無水乙醇計算。
23、進一步地，步驟s2中，攪拌反應可以按每加入一個反應物，攪拌一段時間，如：加入氧化亞銅納米粒子乙醇溶液，攪拌15～25?min（優選為20?min），然后加入氫氧化鈉水溶液，攪拌25～35?min（優選為30?min），最后加入氯金酸水溶液，攪拌4～6?min（優選為5?min）；攪拌反應的總時間為50～60?min（優選為55?min）。
24、進一步地，步驟s2中所述的吐溫-80與金刻蝕氧化亞銅納米粒子初始溶液的體積比為0.05?ml～0.25：2；優選為0.2：2。
25、進一步地，步驟s2中所述的繼續攪拌反應的時間為25～35?min；優選為30?min。
26、進一步地，步驟s3中所述的金刻蝕氧化亞銅納米粒子與硝酸銀的摩爾比為（3～7.5）:?1；優選為3?:?1。
27、進一步地，步驟s3中所述的金刻蝕氧化亞銅納米粒子乙醇溶液的濃度為0.3～0.75mmol/l。
28、進一步地，步驟s3中所述的硝酸銀水溶液的濃度為0.4～1?mmol/l；優選為1mmol/l。
29、進一步地，步驟s3中所述反應的時間為25～35?min；優選為30?min。
30、進一步地，步驟s3中所述的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（cu2o@au-ag）可重懸到無水乙醇中進行保存。
31、一種金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子，通過上述任一項所述的制備方法制備得到。
32、所述的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子在負載小分子化合物和/或制備sers探針中的應用。
33、所述的小分子化合物優選為鄰苯二酚（cl）。
34、一種負載小分子化合物的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（sers探針），通過如下方法制備得到：
35、將上述金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（cu2o@au-ag）的乙醇溶液與鄰苯二酚（cl）水溶液超聲混勻后在室溫、避光條件下攪拌反應，待反應結束后離心收集固體，得到負載小分子化合物的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（鄰苯二酚修飾的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子；cu2o@au-ag-cl）。
36、進一步地，所述的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（cu2o@au-ag）的乙醇溶液的濃度為0.1～1?mmol/l；優選為0.6?mmol/l。
37、進一步地，所述的鄰苯二酚水溶液的濃度為0.001～0.1?mol/l；優選為0.01?mol/l。
38、進一步地，所述的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（cu2o@au-ag）與鄰苯二酚（cl）的摩爾比為（0.1～1）:1；優選為0.6：1。
39、進一步地，所述的反應時間為30?min～2h。
40、所述的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子和/或所述的負載小分子化合物的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子在制備可穿戴式微針傳感器中的應用。
41、一種可穿戴式微針傳感器，通過如下方法制備得到：
42、（1）多孔微針的制備：
43、將醋酸纖維素溶解到二甲基亞砜中，得到聚合物溶液（醋酸纖維素的二甲基亞砜溶液）；然后將聚合物溶液澆鑄到pdms母模上，并通過離心促進聚合物溶液（粘性溶液）填充到模具中，再將含有聚合物溶液的pdms模具浸入水中以誘導相分離，最后將固化的聚合物從pdms模具中剝離并水洗，冷凍干燥，得到多孔微針；
44、（2）親水性多孔微針的制備：
45、將步驟（1）中得到的多孔微針浸泡到十六烷基三甲基氯化銨水溶液中，浸泡后取出干燥，得到親水性多孔微針（具有親水性、不溶性且能夠提取皮膚間質液）；
46、（3）可穿戴式微針傳感器的制備
47、將醋酸纖維素的二甲基亞砜溶液與上述金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子（cu2o@au-ag）的乙醇溶液混合反應，得到鄰苯二酚修飾的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子乙醇水溶液；然后將硝酸纖維素膜裁剪成微針大小的形狀，浸泡到鄰苯二酚修飾的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子乙醇水溶液中，浸泡后取出干燥，再將其粘在步驟（2）中得到的親水性多孔微針的基底處，得到可穿戴式微針傳感器。
48、進一步地，步驟（1）中所述的聚合物溶液的濃度為10?wt%～25?wt%；優選15?wt%。
49、進一步地，步驟（1）中所述的離心的條件為：4000～5500?rpm，離心5～10?min；優選為：4000?rpm，離心5?min。
50、進一步地，步驟（1）中，將含有聚合物溶液的pdms模具浸入水中的時間為8～12min；優選為10min。
51、進一步地，步驟（2）中所述的十六烷基三甲基氯化銨水溶液的濃度為10?wt%～25wt%；優選25?wt%。
52、進一步地，步驟（2）中所述的浸泡的時間為10～30?min；優選為30?min。
53、進一步地，步驟（3）中所述的浸泡的時間為10～30?min；優選為30?min。
54、進一步地，步驟（3）中所述的鄰苯二酚修飾的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子乙醇水溶液的濃度為0.1～0.6?mmol/l；優選為0.3?mmol/l。
55、進一步地，步驟（3）中所述的硝酸纖維素膜的厚度為50?mm。
56、所述的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子、所述的負載小分子化合物的金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子和所述的可穿戴式微針傳感器中至少一種在制備檢測酪氨酸酶和/或皮膚黑素瘤的產品中的應用。
57、所述的產品包括皮膚黑素瘤早期診斷產品。
58、本發明的技術原理：
59、本發明提供一種具有親水性、不溶性、能提取皮膚間質液的多孔微針作為采樣部分，修飾有sers探針的硝酸纖維素膜作為檢測部分，其中sers探針包括鄰苯二酚和金刻蝕氧化亞銅及銀包裹納米粒子，將多孔微針與硝酸纖維素膜組裝作為一種可穿戴式微針傳感器平臺，該平臺通過識別鄰苯二酚的特征峰作為定性標準，根據鄰苯二酚的特征峰強度計算酪氨酸酶濃度作為定量標準。把微針傳感器貼附于可疑皮損區域，具有孔隙的針尖通過毛細力提取皮膚間質液至硝酸纖維素膜上，當間質液中存在酪氨酸酶時，sers探針上的鄰苯二酚被氧化為鄰苯二醌，鄰苯二酚的特征峰隨間質液中酪氨酸酶的含量多少而減弱或消失，與此同時，附有鄰苯二酚的硝酸纖維素膜由無色變為黃色；而當間質液中不存在酪氨酸酶時，sers探針上的鄰苯二酚特征峰不會發生變化，且顏色也不會變化。因此，可以根據鄰苯二酚被酪氨酸酶氧化后顏色發生變化，從而進行比色，實現可視化的即時檢測。
60、本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
61、（1）本發明提供的醋酸纖維素多孔微針原料成本低，制備方法簡單，可大規模壓模制成。此外，比色/sers反應在納升級isf中完成，試劑用量降低90%，導致成本進一步降低。
62、（2）本發明提供的多孔微針作為采樣器，僅穿透角質層至表皮，幾乎無痛、無出血，顯著降低患者痛苦和感染風險、提高依從性，適合頻繁篩查。
63、（3）本發明提供的比色可視化法的輔助，在sers檢測前引入比色產生肉眼可見的顏色變化，可以快速指示可疑區域，便于非專業人員初步判斷，適用于基層篩查。
64、（4）本發明提供了一種集多孔微針（mn）、比色可視化與表面增強拉曼散射（sers）技術于一體的可穿戴式微針傳感器，利用“微針-比色-sers”聯用方法，充分利用了各自的優勢，在靈敏度、特異性、微創性和便捷性方面實現了突破，使“采樣-檢測”原位化，同時整個流程（采樣+檢測）可在一小時內完成，無需復雜的樣本前處理和實驗室分析，實現“現場即時檢測”，加速診斷決策。
65、（5）本發明提供的用于皮膚黑素瘤原位檢測的可穿戴式微針傳感器集成比色可視化與表面增強拉曼散射（sers）雙模式檢測于一體，能活體原位采樣，具有操作簡單、快速、連續、無痛、微創等優點，能實時、連續地反映生理狀態，為皮膚腫瘤（黑素瘤）的早期診斷提供新范式。