本發明屬于生物醫用材料，具體涉及一種酶促多肽基水凝膠及其制備方法與應用。
背景技術：
1、骨缺損修復一直是臨床骨科領域面臨的重要挑戰。傳統的骨缺損修復的治療方法包括自體骨移植與同種異體骨移植，但二者均存在明顯局限性：自體移植會帶來供區并發癥，如出血、感染等；而異體移植則面臨高達30%的免疫排斥風險，并伴隨潛在的疾病傳播隱患。近年來，生物活性材料在骨缺損修復中展現出良好的應用前景。然而，現有的生物活性材料在實際應用中，仍存在生物相容性不足、力學性能與生物功能之間難以有效協調的問題，例如常用的金屬及陶瓷類植入物易引起機體異物反應，阻礙骨整合進程；而某些高分子聚合物在降解過程中產生的副產物可能對周圍成骨細胞活性產生抑制，進一步影響新骨形成；聚醚醚酮（peek）等材料其表面惰性較強，缺乏成骨生物活性。而具有優良生物誘導活性的材料（如膠原基水凝膠），卻因機械性能薄弱，其儲能模量普遍低于10?kpa，難以在負重部位提供足夠的結構支撐，嚴重限制了其臨床應用。
2、多肽水凝膠因其良好的生物相容性和類細胞外基質特性，成為骨組織工程中的研究熱點，例如fmoc-ff/fmoc-r物理交聯水凝膠體系，其儲能模量可達6?kpa，并在一定程度上促進了細胞粘附與活性。海藻酸鹽-多肽雜化水凝膠體系則依賴于離子化學交聯，然而引入的金屬離子可能干擾細胞微環境，特別是對成骨細胞礦化信號通路產生不利影響。盡管上述方案在一定程度上改善了水凝膠的力學性能及生物學功能，但仍普遍缺乏對骨修復過程中復雜酶微環境的動態響應能力。
技術實現思路
1、本發明的目的是提供一種酶促多肽基水凝膠及其制備方法與應用，從而克服現有技術的不足，開發了一種兼具良好生物相容性、適宜力學強度及高效成骨活性的骨修復材料，該材料在骨缺損修復中有巨大的應用前景。
2、為了實現上述目的，本發明的技術方案為：
3、第一方面，本發明提供一種酶促多肽基水凝膠，包括明膠、生物活性多肽和tgase酶，所述明膠和生物活性多肽之間通過tgase酶連接；
4、所述生物活性多肽的氨基酸序列為qxgrgds，其中，x選自1-5的整數。
5、q為谷氨酰胺（fmoc-gln-oh）的單字母代碼、g為甘氨酸（fmoc-gly-oh）的單字母代碼、r為精氨酸的單字母代碼、d為天冬氨酸的單字母代碼、s為絲氨酸（fmoc-l-ser(trt)-oh）的單字母代碼。x的取值為1、2、3、4、5中的任意一個整數。
6、明膠是形成水凝膠的物理交聯網絡基礎，其中含有大量的tgase作用底物（-nh2）。生物活性多肽qxgrgds中的谷氨酰胺（gln,q）殘基，可作為微生物谷氨酰胺轉氨酶（tgase）的專屬底物，進行酶促交聯反應，grgds是一個經典的細胞粘附肽序列，能夠被細胞表面的整合素受體特異性識別，從而促進細胞粘附、鋪展、增殖和分化。微生物谷氨酰胺轉氨酶(tgase)可以催化谷氨酰胺（q）殘基的γ-酰胺基和明膠-nh2之間形成共價異肽鍵。在這個體系中，tgase酶的一端作用在生物活性肽的q序列上，另一端作用在明膠中的賴氨酸殘基上，繼而實現了“物理交聯”和“化學交聯”的結合，并集成了“生物活性”。
7、在一些其他實施方式中，所述明膠和生物活性多肽均含有tgase反應位點；
8、所述生物活性多肽的氨基酸序列為q2grgds。
9、這種特定氨基酸序列組成的明膠和生物活性多肽能夠通過物理－化學雙網絡結構協同提升機械強度（儲能模量≥1?kpa）與生物活性，消除金屬離子干擾，實現成骨細胞定向分化調控。
10、在一些其他實施方式中，所述明膠和生物活性多肽的濃度比為（32-100）：2.81；所述tgase酶的濃度為8.0-15.0?u/ml。
11、通過調控明膠、生物活性多肽和tgase酶的濃度，達到多肽基水凝膠對前成骨細胞分化等細胞行為調控的目的，并通過調整水凝膠中的機械強度和生物活性位點促進細胞分化。
12、第二方面，本發明提供了第一方面所述的酶促多肽基水凝膠的制備方法，包括以下步驟：
13、將明膠溶解于tris-hcl緩沖溶液中，經攪拌、加熱和靜置，制得明膠溶液；將生物活性多肽溶液和明膠溶液混合，加入tgase酶溶液和ca2+依賴液，孵育即得酶促多肽基水凝膠。
14、該制備方法中水凝膠合成的成本較低，生物活性多肽溶解于緩沖溶液中，使其ph接近生理ph值。孵育過的復配水凝膠混合更加充分穩定。
15、在一些其他實施方式中，所述加熱溫度為40-50℃，攪拌時間為20-60?min，靜置的時間為24-72?h。
16、具體地，所述加熱處理的溫度為40、45或50℃，攪拌時間為20、30、40?、50和60min，靜置時間為24、30、36、40、48、50、60或72?h。
17、優選的，所述加熱處理溫度為45℃，攪拌時間為40?min，靜置的時間為48?h。
18、在一些其他實施方式中，所述明膠溶液的濃度為32-100mg/ml，所述生物活性多肽溶液的濃度為2.81mg/ml，所述明膠溶液和生物活性多肽溶液的混合體積比為1:(1-2)；所述溶液為tris-hcl緩沖溶液。
19、具體地，明膠溶液的濃度為32、64、80、100?mg/ml，所述生物活性多肽溶液的濃度為2.81mg/ml，所述明膠溶液和生物活性多肽溶液混合體積比為1:1、1:1.5或1:2。
20、在一些其他實施方式中，所述tgase酶溶液的濃度為8.0-15.0?u/ml，所述ca2+依賴液的濃度為0.8-0.12?mm；
21、所述孵育的溫度為35-40℃，時間為18-48h。
22、所述tgase酶溶液包括二硫蘇糖醇（dtt）、tgase和tris-hcl緩沖溶液，其中，dtt與tgase的質量比為(2-4)×10-3；tgase酶溶液的濃度為10.0-15.0u/ml。
23、具體地，tgase酶溶液的濃度為10、11、12、13、14或15?u/ml，孵育的溫度為35、37、38或40℃，孵育時間為18、24、30、36、40或48?h。
24、優選地，tgase酶溶液的濃度為10.0?u/ml，孵育的溫度為37℃，時間為24?h。
25、第三方面，本發明提供了第一方面所述的酶促多肽基水凝膠在骨缺損修復中的應用。
26、在一些其他實施方式中，所述骨缺損修復為成骨細胞礦化、增殖和分化。
27、第四方面，本發明提供一種骨缺損修復材料，包括第一方面所述的酶促多肽基水凝膠。
28、本發明的有益效果：
29、（1）本發明針對骨缺損修復中現有生物材料存在的生物相容性缺陷、力學－生物學功能失耦聯及缺乏動態響應能力三大瓶頸，通過構建一種酶特異性觸發的全生物源多肽水凝膠體系，取得以下突破性成果：獲得生物相容性較好的多肽水凝膠，消除金屬離子和合成聚合物降解產物的干擾；實現力學與生物活性協同：創新設計物理－化學雙網絡交聯結構，可以精準調控水凝膠的生物活性和機械強度。
30、（2）本發明的具有生物活性的酶促多肽基水凝膠可以促進細胞的粘附、增殖、遷移和分化，對于骨組織的再生有著至關重要的作用；同時tgase酶溶液為水凝膠提供足夠的機械強度與天然硬組織相匹配，并突破了傳統細胞外基質模擬支架的組成成分單一、不均勻和生物活性位點較少的缺點，制備了具有特定機械強度和生物活性位點的多肽基水凝膠，通過對組裝基元的調控賦予多肽基水凝膠具有類似于真實組織粘彈性的性質。
31、（3）本發明通過調節水凝膠中的生物活性序列和濃度，達到多肽基水凝膠對前成骨細胞分化等細胞行為調控的目的，并通過調整水凝膠中的機械強度和生物活性位點促進細胞分化。