一種高純度環黃芪醇生產精制的方法與流程

技術領域本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種高純度環黃芪醇生產精制的新方法。

背景技術：
黃芪中的有效成分包括黃酮類，皂苷類，多糖類及氨基酸類。其中黃芪皂苷具有強心、降壓、抗腫瘤、降低糖尿病大鼠血糖和促進胰島素分泌等作用。從黃芪根中已分離鑒定出數十種黃芪皂苷，黃芪甲苷為皂苷的主要有效成分。環黃芪醇(Cycloastragenol)，屬于三萜皂苷類化合物，主要由黃芪甲苷(AstragalosideⅣ)的水解得到，物理性質為無味、無定型白色粉末。環黃芪醇是從黃芪中發現的端粒酶激活劑，通過增加端粒酶活性，延緩端粒變短，從而被認為具有延緩衰老的作用。中國專利CN1809364B提出以酸水解黃芪甲苷，經硅膠柱層析純化得到環黃芪醇的方法，但實踐證明其生成開環副產物-黃芪醇的比例較高且工藝復雜，難以工業化生產的問題。中國專利CN103880910B采用氧化還原的方法制備環黃芪醇，反應步驟較多，使用了強氧化劑高碘酸、高碘酸鈉或高碘酸鉀，強還原劑硼氫化鈉、硼氫化鉀等，且反應過程中加入乙二醇后產生大量甲醛，對操作人員產生一定傷害，不符合綠色環保的要求。

技術實現要素：
本發明的目的是提出一種高純度環黃芪醇生產精制的方法，該方法反應條件溫和，操作方便，適合大規模工業化生產。本方法使用80%以上黃芪甲苷為原料，采用兩相酶水解的方法對黃芪甲苷進行水解，然后再采用萃取，重結晶方法得到高含量的環黃芪醇。環黃芪醇化學結構式如下：黃芪醇（環黃芪醇開環副產物）結構如下：一種高純度環黃芪醇生產精制的方法，包括以下步驟：A、兩相酶水解反應使用黃芪甲苷為原料，將其加入PH為5-9的緩沖溶液中，黃芪甲苷和緩沖溶液的固液質量比例為1:50-1:100，充分攪拌形成懸浮液；向懸浮液中加入水解酶，黃芪甲苷和水解酶的質量比為1:1-9:1；加入非水溶性有機溶劑，使之成兩相，有機溶劑和緩沖溶液體積比為0.5:1-3:1；在25-45℃條件下酶水解20-60h；B、萃取酶水解反應結束后，靜置待水相和有機相完全分離后，取上層有機相溶液；然后加入一定量的非水溶性有機溶劑到緩沖溶液中進行萃取，有機溶劑和緩沖溶液的體積比為0.5:1-3:1；靜置待水相和有機相完全分離后，取上層有機相溶液；合并兩次有機相溶液，過濾，減壓回收有機相溶液得到環黃芪醇的粗品；C、重結晶取上述環黃芪醇粗品加入到重結晶溶劑中，環黃芪醇粗品和溶劑質量比為1:30-1:80,加入溶劑質量0.05%-0.2%的活性炭，溫度25-90℃充分攪拌10-120min；過濾，將其放入溫度為10至-25℃的冰柜中放置，析出環黃芪醇晶體，過濾，干燥即得大于或等于95%純度的環黃芪醇。上述兩相酶水解反應中黃芪甲苷的原料含量應不低于80%。上述非水溶性有機溶劑為正丁醇，乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，石油醚或其混合物。上述水解酶為β-葡萄糖苷酶，蝸牛酶，柚苷酶，纖維素酶或以上幾種酶的組合。上述重結晶溶劑為乙酸乙酯，石油醚，甲醇，乙醇，氯仿，二氯甲烷，丙酮或其混合物。本發明和現有的技術相比，優勢在于：一、黃芪甲苷原料采用兩相酶水解的方法進行水解，反應步驟少，轉化率較高，并有效的避免了專利CN1809364B在實際操作過程中采用酸水解易導致產生開環副產物-黃芪醇的問題。酶水解溫度為25-45℃，反應溶劑為水、少量有機溶劑，有機溶劑全部回收，可重復二、本發明中環黃芪醇精制采用結晶的方法和其他專利中使用硅膠柱上樣洗脫進行純化相比較，具有操作方便，操作效率高，更加適合進行工業化推廣。具體實施方式下面結合實施例對本發明進一步說明，但不以此作為對本發明的限制。實施例1A、兩相酶水解1000ml0.02MKH2PO4-NaOHPH5.0緩沖溶液中，加入20g90%黃芪甲苷和4.0gβ-葡萄糖苷酶攪拌混懸，加入1000ml乙酸乙酯，緩慢攪拌，在37℃反應48h；B、萃取酶水解反應結束后，靜置1h，取上層的乙酸乙酯溶液；在水相中加入500ml的乙酸乙酯充分攪拌然后靜置1h，待水相和有機相完全分離后，取上層乙酸乙酯溶液；合并兩次乙酸乙酯溶液，過濾，回收乙酸乙酯得到環黃芪醇的粗品10.68g，經HPLC檢測環黃芪醇粗品的純度為83.20%，轉化率78.98%；C、重結晶取上述環黃芪醇粗品5g加入到250ml乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑中，乙酸乙酯和石油醚的比例為1:1，加入0.25g活性炭，70℃加熱攪拌30min；過濾，待重結晶溶劑溫度降到室溫以后將其放入溫度為0至-5℃的冰柜中靜置24h，析出環黃芪醇晶體，過濾，干燥即得環黃芪醇3.14g；經HPLC檢測，環黃芪醇純度為99.08%。轉化率73.83%。實施例2A、兩相酶水解800ml0.04MNaH2PO4-NaOHPH5.5緩沖溶液中，加入10g80%黃芪甲苷和2.0g蝸牛酶攪拌混懸，加入800ml二氯甲烷，緩慢攪拌，在40℃反應58h；B、萃取酶水解反應結束后，靜置1.5h，取下層的二氯甲烷溶液；在水相中加入500ml的二氯甲烷充分攪拌然后靜置1h，待水相和有機相完全分離后，取下層二氯甲烷溶液；合并兩次二氯甲烷溶液，過濾，回收二氯甲烷得到環黃芪醇的粗品4.25g，經HPLC檢測環黃芪醇粗品的純度為78.32%，轉化率為66.57%；C、重結晶取上述環黃芪醇粗品2g加入到100ml乙酸乙酯中，加入0.15g活性炭，60℃加熱攪拌60min；過濾，待重結晶溶劑溫度降到室溫以后將其放入溫度為-5至-10℃的冰柜中靜置12h，析出環黃芪醇晶體，過濾，干燥即得環黃芪醇1.29g。實施例3A、兩相酶水解1500ml0.04MNaH2PO4-NaOHPH6.0緩沖溶液中，加入20g85%黃芪甲苷和3.0g柚苷酶、1.0g蝸牛酶攪拌混懸，加入1000ml氯仿，緩慢攪拌，在30℃反應60h；B、萃取酶水解反應結束后，靜置2h，取下層的氯仿溶液；在水相中加入1000ml的氯仿充分攪拌然后靜置1h，待水相和有機相完全分離后，取下層氯仿溶液；合并兩次氯仿溶液，過濾，回收氯仿得到環黃芪醇的粗品11.29g，經HPLC檢測環黃芪醇粗品的純度為79.41%，轉化率為84.38%；C、重結晶取上述環黃芪醇粗品5g加入到400ml丙酮和石油醚的混合溶劑中，丙酮和石油醚的比例為2:1，加入0.8g活性炭，40℃加熱攪拌120min；過濾，待重結晶溶劑溫度降到室溫以后將其放入溫度為-25至-20℃的冰柜中靜置24h，析出環黃芪醇晶體，過濾，干燥即得環黃芪醇3.24g；經HPLC檢測，環黃芪醇純度為99.05%，轉化率為80.60%。實施例4A、兩相酶水解2200ml0.03MKH2PO4-NaOHPH8.0緩沖溶液中，加入40g98%黃芪甲苷和4.0gβ-葡萄糖苷酶、20.0g蝸牛酶和2.0g纖維素酶攪拌混懸，加入4000ml乙酸乙酯和1000ml石油醚，緩慢攪拌，在37℃反應48h；B、萃取酶水解反應結束后，靜置1h，取上層的乙酸乙酯和石油醚溶液；在水相中加入1000ml的乙酸乙酯充分攪拌然后靜置1h，待水相和有機相完全分離后，取上層乙酸乙酯溶液；合并兩次溶液，過濾，回收溶劑得到環黃芪醇的粗品37.85g，經HPLC檢測環黃芪醇粗品的純度為83.48%,轉化率為80.60%；C、重結晶取上述環黃芪醇粗品10g加入到450ml乙醇中，加入0.5g活性炭，90℃加熱回流100min；過濾，待重結晶溶劑溫度降到室溫以后將其放入溫度為；經HPLC檢測，環黃芪醇純度為99.85%，轉化率為87.84%。