一種用于基因分型的轉基因小鼠DNA提取試劑盒及提取方法與流程

技術領域本發明屬于DNA提取領域，具體涉及一種用于基因分型的轉基因小鼠DNA提取試劑盒及提取方法。

背景技術：
自1980年第一只轉基因小鼠誕生以來，轉基因技術得到了迅猛發展，很多研究者紛紛開展轉基因小鼠的研究工作，這導致實驗所需的轉基因小鼠的品系和數量日益增加。由于轉基因小鼠(例如基因敲除小鼠和免疫缺陷小鼠等)種群的維持是通過親代雜合子繁育而獲得，因此，該研究的開展將使小鼠的基因分型(包括DNA的提取和后續PCR對目的基因的檢測)成為大量、頻繁的常規工作。開發簡便、經濟、有效的基因型鑒定方法將有利于提高轉基因小鼠基因分型的工作效率，而DNA提取則是該過程中關鍵的第一步。目前傳統的DNA提取方法包括酚\/氯仿提取法和高鹽提取法，這些方法雖然能夠獲取較高純度和較高得率的組織DNA，但都有一些不足之處：一是步驟較繁瑣，例如多次涉及離心；二是涉及的試劑過多，例如均采用了氯仿、乙醇、蛋白酶K等試劑；三是時間偏長，大部分實驗步驟包含過夜流程。即便是近年來的相關文獻公開的方法和現有試劑盒(例如Dakewei、Promega和Sigma公司試劑盒等)提供的方法，其DNA提取部分所花時間也在30min到數小時之間，而且含有耗材(如收集柱等)和多種試劑(如裂解液、中和液、蛋白酶K等)。上述問題都在一定程度上增加了實驗成本(包括試劑成本、耗材成本和人力成本)，從而制約了轉基因小鼠基因分型的工作效率。針對以往基因分型技術存在的不足，申請人立足在國內外相關實驗室的工作積累和科研經驗，申請了以鼠尾DNA提取為目標的發明專利(ZL201110294538.4)并獲授權，該試劑盒對操作時間和試劑盒內容進行了革新，簡化了常規提取流程，減少了試劑和耗材，從而有效提高了基因分型的工作效率。該發明專利(ZL201110294538.4)授權3年來，申請人一直致力于該試劑盒的優化和完善。結果發現，在確保基因分型結果準確的前提下，提取轉基因小鼠DNA的試劑成分、實驗流程、操作時間和組織取材還存在進一步簡化、縮短和拓展的空間。這既包括對試劑成分創造性的優化，也包括通過重復實驗對試劑用量、操作時間和取材范圍的完善。通過上述改進，試劑成分類型減少50％，保留試劑用量減少45％，操作時間縮短33％；獲得了新方法提取轉基因小鼠DNA的有效存放期限，以指導本領域技術人員合理安排基因分型時間；擴大了取材范圍，即除鼠尾外，還可以根據工作需要和實際情況采用轉基因小鼠腳趾(常用于剪取腳趾位置作為轉基因小鼠的編號，以區分更多的小鼠樣本)作為檢測模板。

技術實現要素：
本發明的目的是在申請人前期獲得的發明專利(ZL201110294538.4)的基礎上，提供一種操作更加簡便、成本更加低廉的用于基因分型的轉基因小鼠DNA提取試劑盒，同時，本發明還提供了該試劑盒提取轉基因小鼠DNA的提取方法。本發明的具體技術方案為：一種用于基因分型的轉基因小鼠DNA提取試劑盒，包括X液，X液由終濃度為0.02～0.04N的NaOH溶液和終濃度為1.8～2.5mM的EDTA溶液組成。作為優選，所述X液的配置方法為：將10N的NaOH溶液置于50mL容器中，再分別加入0.5M的EDTA溶液和ddH2O，混勻后即得X液。采用上述試劑盒提取轉基因小鼠DNA的方法，步驟如下：(1)取小鼠尾尖或腳趾0.2～0.5cm組織，置于1.5mLEP管中；(2)在EP管中加入100μLX液；(3)將EP管置于沸水中加熱15～20min，或置于100℃的微量恒溫器中加熱15～20min；(4)取出EP管，冰浴1～2min后所得試樣即可用于基因分型，或置于4℃保存待用。本發明是立足于基因分型實驗的實際需要，對申請人前期獲得的發明專利(ZL201110294538.4)進行進一步優化和完善。主要體現為：只選取X液中的NaOH溶液和高溫因素對組織進行直接裂解，使其DNA得以充分釋放，并采用X液中的EDTA溶液與Mg2+整合，減少Dnase的活性，從而進一步保護DNA樣品的完整性，并對作用時間進行了完善。發明人針對基于轉基因小鼠的基因分型對DNA純度和得率乃至保存時間的要求并不太高的特點，本發明直接舍去常規實驗中均會采用的中和液，同時不選用蛋白酶K和酚\/氯仿等試劑；為確保基因分型的準確性，以進一步指導本領域技術人員合理安排時間，本發明還對X液單獨作用后的溶液有效存放時間進行了探索，確定了最好又最經濟的時間；發明人又進一步嘗試用轉基因小鼠除尾尖外的組織如腳趾用于DNA提取，拓展了取材范圍。通過上述措施，有效減少了試劑類型，進一步簡化了操作流程、縮短了實驗時間，并擴大了應用范圍。申請人在第三軍醫大學第三附屬醫院創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室使用該試劑盒進行了大量基因分型實驗，結果可靠。本發明的有益效果是：本發明對試劑盒的試劑類型進行了優化，采用NaOH溶液和EDTA溶液組成的X液提取轉基因小鼠DNA，減少了試劑類型，并進一步簡化了操作流程、縮短了實驗時間，并獲得了新方法提取轉基因小鼠DNA的有效存放期限，同時本發明的試劑盒可以用于尾尖和腳趾組織DNA的提取，擴大了試劑盒的應用范圍。附圖說明圖1是實施例4中AhR系列小鼠基因分型結果；圖2是實施例5中Foxp3-GFPKI小鼠基因分型結果；圖3是實施例6中Musculinfl\/+小鼠DNA不同存放時間的基因分型結果。具體實施方式下面通過具體實施例對本發明作進一步說明，實驗中所用轉基因小鼠背景均為C57BL\/6，PCR方法采用申請人所在實驗室改進的基因分型技術(唐婉琦,楊雪,張醇,范霞,嚴軍,梁華平.利用改進的聚合酶鏈反應方法鑒定芳香烴受體敲除小鼠.第三軍醫大學學報,2014,36(16):1761-1763.)，DNAMarker為DL2000，其自上而下帶型分子量依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。本發明所采用的其他原料和設備若非特指，均可從市場購得或是本領域常用的，實施例中的其他方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。實施例1：試劑盒配制取100μL、10N的NaOH溶液置于50mL容器中，再分別加入160μL、0.5M的EDTA溶液和39.74mL的ddH2O，混勻后得到由終濃度為0.025N的NaOH溶液和終濃度為2.0mM的EDTA溶液組成的X液，將得到的X液配制成轉基因小鼠DNA提取試劑盒。實施例2：試劑盒配制取80μL、10N的NaOH溶液置于50mL容器中，再分別加入144μL、0.5M的EDTA溶液和39.78mL的ddH2O，混勻后得到由終濃度為0.02N的NaOH溶液和終濃度為1.8mM的EDTA溶液組成的X液，將得到的X液配制成轉基因小鼠DNA提取試劑盒。實施例3：試劑盒配制取160μL、10N的NaOH溶液置于50mL容器中，再分別加入200μL、0.5M的EDTA溶液和39.64mL的ddH2O，混勻后得到由終濃度為0.04N的NaOH溶液和終濃度為2.5mM的EDTA溶液組成的X液，將得到的X液配制成轉基因小鼠DNA提取試劑盒。實施例4：C57BL\/6背景的AhR系列小鼠基因分型配對的C57BL\/6背景的AhR+\/-成年小鼠購自美國JacksonLaboratory，置于第三軍醫大學第三附屬醫院實驗動物中心，按照SPF級動物標準飼養和繁殖，幼鼠斷奶分籠后剪取腳趾，進行AhR基因分型。首先采用實施例1配制的試劑盒提取幼鼠腳趾DNA，方法為：(1)剪取小鼠腳趾組織0.2cm，置于1.5mLEP管中；(2)在EP管中加入100μLX液；(3)將EP管置于沸水中加熱20min；(4)取出EP管，冰浴2min后所得試樣即可用于基因分型。基因分型：①引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)：P1-WildtypeReverse-GGATTTGACTTAATTCCTTCAGCGG；P2–Common-TCTTGGGCTCGATCTTGTGTCAGGAACAGG；P3-MutantReverse-TGGATGTGGAATGTGTGCGAG。②加樣：按照P1、P2為1組、P2、P3為另一組的方法分別加樣，反應體系各為20μL，即模板1μL、2×TaqMasterMix10μL、P10.5μL、P20.5μL、ddH2O8μL，或模板1μL、2×TaqMasterMix10μL、P20.5μL、P30.5μL、ddH2O8μL。③PCR：首先94℃加熱3min，然后按94℃加熱30s，65.5℃加熱40s，72℃加熱1min順序進行35個循環，接著72℃加熱5min，置4℃暫存，產物取出后可置于-20℃保存。④檢測：1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電壓為130V，時間為35min。699bp單條帶為AhR+\/+小鼠，699bp和450bp雙條帶為AhR+\/-小鼠，450bp單條帶為AhR-\/-小鼠。圖1是本實施例小鼠基因分型結果，該實驗分別檢測野生型條帶和突變型條帶，然后將電泳結果上下拼接而成，以便于觀察。泳道M為DNAMarker(DL2000)，泳道1為AhR+\/+，泳道2為AhR+\/-，泳道3為AhR-\/-。結果顯示，AhR+\/+帶型為699bp，AhR+\/-帶型為699bp和450bp，AhR-\/-帶型為450bp。實施例5：C57BL\/6背景的Foxp3-GFPKI小鼠基因分型配對的C57BL\/6背景的Foxp3-GFPKI成年小鼠來自美國哈佛大學醫學院，置于第三軍醫大學第三附屬醫院實驗動物中心，按照SPF級動物標準飼養和繁殖，待幼鼠斷奶分籠后進行基因分型。首先采用實施例2配制的試劑盒提取幼鼠尾尖DNA，方法為：(1)剪取小鼠尾尖組織0.5cm，置于1.5mLEP管中；(2)在EP管中加入100μLX液；(3)將EP管置于100℃的微量恒溫器中加熱15min；(4)取出EP管，冰浴1min后所得試樣即可用于基因分型。基因分型：①引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)：P1-MusWTF–GTGTGAGTCAGTAGGACTGCAG；P2-MusWTR–ACGCCCCAACAAGTGCTCCAAT；P3-MusmutF–ACCCCTAGGAATGCTCGTCAAG。②加樣：按照P1、P2為1組、P2、P3為另一組的方法分別加樣，反應體系各為20μL，即模板1μL、2×TaqMasterMix10μL、P10.5μL、P20.5μL、ddH2O8μL，或模板1μL、2×TaqMasterMix10μL、P20.5μL、P30.5μL、ddH2O8μL。③PCR：首先94℃加熱3min，然后按94℃加熱30s，65.5℃加熱40s，72℃加熱1min順序進行35個循環，接著72℃加熱5min，置4℃暫存，產物取出后可置于-20℃保存。④檢測：1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電壓為130V，時間為35min。由于Foxp3-GFP位于X染色體上，因此，對于♂小鼠而言，無Foxp3-GFP+\/+基因型，而220bp條帶為Foxp3-GFP+\/-小鼠；對于♀小鼠而言，220bp單條帶為Foxp3-GFP+\/+小鼠，220bp和420bp雙條帶為Foxp3-GFP+\/-小鼠，420bp單條帶為Foxp3-GFP-\/-小鼠。圖2是本實施例小鼠基因分型結果，該實驗分別檢測Foxp3-GFPKI野生型和突變型條帶，然后將電泳結果上下拼接而成，以便于觀察。泳道M為DNAMarker(DL2000)，泳道1為NegativeCtrl(Foxp3-GFP-\/-)，泳道2為PositiveCtrl(Foxp3-GFP+\/+)，泳道3為Foxp3-GFP+\/-(♂)，泳道4為Foxp3-GFP+\/-(♀)。結果顯示，Foxp3-GFP+\/+(♀)帶型為220bp，Foxp3-GFP+\/-(♂)帶型為220bp(此時的“-”實際由Y染色體代替)，Foxp3-GFP+\/-(♀)帶型為220bp和420bp，Foxp3-GFP-\/-帶型為420bp。實施例6：Musculinfl\/+小鼠DNA存放不同時間基因分型配對的C57BL\/6背景的Musculinfl\/+成年小鼠由北京百奧賽圖基因生物技術有限公司研發，置于第三軍醫大學第三附屬醫院實驗動物中心，按照SPF級動物標準飼養和繁殖，待幼鼠斷奶分籠后進行基因分型。首先采用實施例3配制的試劑盒提取幼鼠腳趾DNA，方法為：(1)剪取小鼠腳趾組織0.2cm，置于1.5mLEP管中；(2)在EP管中加入100μLX液；(3)將EP管置于100℃的微量恒溫器中加熱18min；(4)取出EP管，冰浴2min后得到可用于基因分型的試樣。將得到的試樣分為4個樣本：D0樣本、D3樣本、D7樣本、D14樣本，其中，D0樣本不保存，即刻用于基因分型，D3樣本、D7樣本、D14樣本分別室溫保存3天、7天、14天后用于基因分型。基因分型：①引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)：P1–MusWTF–GGATTCCCTTGGGAAAGTGGTTTC；P2-MusWTR–CCTGTCTTGTTCACAGGCCCA；P3–MusmutF–AGGACGGCACCTTCATCTAC。②加樣：按照P1、P2為1組、P2、P3為另一組的方法分別加樣，反應體系各為20μL，即模板1μL、2×TaqMasterMix10μL、P10.5μL、P20.5μL、ddH2O8μL，或模板1μL、2×TaqMasterMix10μL、P20.5μL、P30.5μL、ddH2O8μL。③PCR：首先94℃加熱3min，然后按94℃加熱30s，65.5℃加熱40s，72℃加熱1min順序進行35個循環，接著72℃加熱5min，置4℃暫存，產物取出后可置于-20℃保存。④檢測：1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電壓為130V，時間為35min。269bp單條帶為Musculin+\/+小鼠，269bp和457bp雙條帶為Musculinfl\/+小鼠，457bp單條帶為AhR-\/-小鼠。圖3是本實施例小鼠DNA存放不同時間的基因分型結果，該實驗分別檢測Musculinfl\/+野生型和突變型條帶，然后將電泳結果上下拼接而成，以便于觀察。泳道M為DNAMarker(DL2000)，泳道1為D14樣本，泳道2為D7樣本，泳道3為D3樣本，泳道4為D0樣本。結果顯示，樣本DNA室溫存放14天、7天、3天以及即刻檢測得到的帶型清晰，均為269bp和457bp(Musculin+\/+帶型為269bp，Musculinfl\/+帶型為269bp和457bp，Musculinfl\/fl帶型為457bp)，說明利用該優化試劑盒獲得的轉基因小鼠DNA可以室溫存放至少14天。