一種微生物生產聯苯羧酸的方法與流程

本發明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到產朊假絲酵母生物催化制備醫藥中間體 4’-聯苯-2-羧酸 的技術。

背景技術：

生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環境友好等突出優點,是可持續發展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的應用領域之一,在工業生物催化中一直扮演著重要角色。

芳烴的羧化反應是一類重要的反應，其產物為芳烴羥基羧酸，是重要的藥物合成起始原料。但是，現在的生產采用傳統的化學合成，用芳烴與CO2反應，反應壓力高達10MPa，溫度高達140-380℃，反應選擇性差，副產物多。采用微生物催化，則可能改變這種狀況。采用微生物催化，可以在常溫、常壓下反應生產芳烴羥基羧酸，條件溫和，選擇性高，副反應少，產率高。

本發明將采用微生物催化反應，生產芳烴羥基羧酸： 4’-聯苯-2-羧酸。

技術實現要素：

本發明采用產朊假絲酵母催化制備 4’-聯苯-2-羧酸 ，反應式如下：

底物 4-丁基聯苯（1）經產朊假絲酵母催化反應，得到產物 4’-聯苯-2-羧酸 （2）。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用產朊假絲酵母作為催化劑，因為其催化反應的效果最好，副產物極少，反應收率高。

許多假絲酵母都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經實驗，本發明選用產朊假絲酵母菌株為ATCC 9256，其催化反應效果最佳。

由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。盡管表面活性劑增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，屬于液-液2相反應，底物、產物的相間傳質為反應的限制環節，所以，還需采取措施，以提高反應速度。增加非均相反應的反應界面，是提高非均相反應的有效措施之一。加入表面活性劑后，在強烈攪拌下，反應液成為乳液，使得催化反應界面大幅度增加，從而大幅度提高反應速度。特別是，加入的表面活性劑，必須生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。大量實驗表明，對于本反應，加入支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚21-22g/L是最佳的。

反應結束后，用有機溶劑萃取產物。需要破乳，有多種方法可以破乳，包括鹽析法：加入氯化鈉、硫酸銨或氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈣、硫酸鎂；凝聚法：加入聚合氯化鋁、明礬等；或者將上述2類混合加入；加熱等。不同產物，所用的方法不同，實驗表明，對于本反應，加入2.1%的硫酸鈣+0.1%聚合氯化鋁是最佳的。

羧化反應中，采用NaHCO₃提供CO₂,實際上，有多種物質可以提供CO₂,但是，通過大量實驗，結果表明，對于本發明，使用NaHCO₃是最佳的。由于加入NaHCO₃會使反應液的pH升高，而適宜的pH，對微生物催化反應致關重要，所以，不能一次加入，必須采用流加方式加入NaHCO₃。然而，即使流加NaHCO₃，反應液的pH仍然升高，所以，還必須采取措施，維持反應液處于適宜的pH，使微生物能夠正常發揮生物催化作用。通過大量實驗表明，流加鹽酸水溶液是適宜的方法，調節NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH處于最佳范圍，使生物催化反應正常進行。

可以明顯看出，本發明所涉及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、CO₂供體選擇，還有反應溫度，反應時間，反應pH，底物濃度，生物催化反應液成分確定等，眾多因素均需考慮，并且，它們相互影響。特別是，需要從實驗室小試、中試，直到工業規模反應，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所以，實驗設計至管重要，如此多的因素，生物催化反應動力學理論分析和實驗工作量巨大。

培養介質：

1、種子培養基成份為: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固體培養基時添加15g/L的瓊脂粉。

2、培養液成份：葡萄糖20-22 g/L，麥芽浸膏23-25 g/L， (NH₄)₂SO₄ 4.8-5.3 g/L，KH₂PO₄ 9-11 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，CaCl₂ 0.35-0.4 g/L,硫酸銨0.2-0.25g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L,pH5.2。

2、固體培養基成份： 在液體培養基中加入2%的瓊脂粉。

微生物發酵液制備。產朊假絲酵母ATCC 9256經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至27-28℃，將產朊假絲酵母種子液接種至發酵罐，接種比例為6.8-7.3％，通氣比為1.2-1.4V/V?分鐘，27-28℃培養45-48小時，發酵液中濕酵母細胞濃度為82-88g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。

用HPLC測產品收率及純度，C18柱，紫外檢測器，波長254nm，流動相為pH3的磷酸緩沖液：甲醇=90:10。

生物催化反應：發酵罐,即制備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物 4-丁基聯苯 ，使濃度為85-90 g/L，補加以下成份，使濃度為：麥芽浸膏22-26 g，支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚21-22g/L，木糖30-33g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽糖36-41g/L；調節pH為5.1-5.4，攪拌使反應液乳化，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應溫度 30℃，反應時間為39-42小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH5.1-5.4，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.3-0.35V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.3-0.35倍反應液體積，反應結束后，破乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙酯萃取反應液萃取3次，合并有機相，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物 4’-聯苯-2-羧酸 ，反應轉化率97.3-99％，產品收率95.3-97.1％。

實施例1

培養液成份：葡萄糖20-22 g/L，麥芽浸膏23-25 g/L， (NH₄)₂SO₄ 4.8-5.3 g/L，KH₂PO₄9-11 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，CaCl₂ 0.35-0.4 g/L,硫酸銨0.2-0.25g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L,pH5.2。

微生物發酵液制備。產朊假絲酵母ATCC 9256經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至27-28℃，將產朊假絲酵母種子液接種至發酵罐，接種比例為6.8-7.3％，通氣比為1.2-1.4V/V?分鐘，27-28℃培養45-48小時，發酵液中濕酵母細胞濃度為82-88g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。

生物催化反應：15L發酵罐,即制備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物 4-丁基聯苯 ，使濃度為85-90 g/L，補加以下成份，使濃度為：麥芽浸膏22-26 g，支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚21-22g/L，木糖30-33g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽糖36-41g/L；調節pH為5.1-5.4，攪拌使反應液乳化，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應溫度 30℃，反應時間為39-42小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH5.1-5.4，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.3-0.35V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.3-0.35倍反應液體積，反應結束后，破乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙酯萃取反應液萃取3次，合并有機相，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物 4’-聯苯-2-羧酸 ，反應轉化率97.3-99％，產品收率95.3-97.1％。

實施例2

培養液成份：葡萄糖20-22 g/L，麥芽浸膏23-25 g/L， (NH₄)₂SO₄ 4.8-5.3 g/L，KH₂PO₄9-11 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，CaCl₂ 0.35-0.4 g/L,硫酸銨0.2-0.25g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L,pH5.6。

微生物發酵液制備。產朊假絲酵母ATCC 9256經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至27-28℃，將產朊假絲酵母種子液接種至發酵罐，接種比例為6.8-7.3％，通氣比為1.2-1.4V/V?分鐘，27-28℃培養45-48小時，發酵液中濕酵母細胞濃度為82-88g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。

生物催化反應：150L發酵罐,即制備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物 4-丁基聯苯 ，使濃度為85-90 g/L，補加以下成份，使濃度為：麥芽浸膏22-26 g，支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚22g/L，木糖30g/L、蔗糖25g/L、麥芽糖41g/L；調節pH為5.1-5.4，攪拌使反應液乳化，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應溫度 30℃，反應時間為39小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH5.1-5.4，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.35V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.35倍反應液體積，反應結束后，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙酯萃取反應液各萃取1次，合并有機相，蒸出乙酸乙酯，得到產物 4’-聯苯-2-羧酸 ，反應轉化率97.3％，產品收率95.3％。

實施例 3

培養液成份：葡萄糖20-22 g/L，麥芽浸膏23-25 g/L， (NH₄)₂SO₄ 4.8-5.3 g/L，KH₂PO₄9-11 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，CaCl₂ 0.35-0.4 g/L,硫酸銨0.2-0.25g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L,pH5.6。

微生物發酵液制備。產朊假絲酵母ATCC 9256經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至27-28℃，將產朊假絲酵母種子液接種至發酵罐，接種比例為6.8-7.3％，通氣比為1.2-1.4V/V?分鐘，27-28℃培養45-48小時，發酵液中濕酵母細胞濃度為82-88g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。

生物催化反應：1000L發酵罐,即制備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物 4-丁基聯苯 ，使濃度為85-90 g/L，補加以下成份，使濃度為：麥芽浸膏22-26 g，支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚22g/L，木糖33g/L、蔗糖28g/L、麥芽糖41g/L；調節pH為5.1-5.4，攪拌使反應液乳化，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應溫度 30℃，反應時間為39小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH5.1-5.4，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.3V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.3倍反應液體積，反應結束后，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙酯萃取反應液各萃取1次，合并有機相，蒸出乙酸乙酯，得到產物 4’-聯苯-2-羧酸 ，反應轉化率98.2％，產品收率96.1％。

實施例 4

培養液成份：葡萄糖20-22 g/L，麥芽浸膏23-25 g/L， (NH₄)₂SO₄ 4.8-5.3 g/L，KH₂PO₄9-11 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，CaCl₂ 0.35-0.4 g/L,硫酸銨0.2-0.25g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L,pH5.6。

微生物發酵液制備。產朊假絲酵母ATCC 9256經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至27-28℃，將產朊假絲酵母種子液接種至發酵罐，接種比例為6.8-7.3％，通氣比為1.2-1.4V/V?分鐘，27-28℃培養45-48小時，發酵液中濕酵母細胞濃度為82-88g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。

生物催化反應：15000L發酵罐,即制備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物 4-丁基聯苯 ，使濃度為90 g/L，補加以下成份，使濃度為：麥芽浸膏25 g，支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚22g/L，木糖32g/L、蔗糖27g/L、麥芽糖40g/L；調節pH為5.1-5.4，攪拌使反應液乳化，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應溫度 30℃，反應時間為41小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH5.1-5.4，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.33V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.33倍反應液體積，反應結束后，破乳，用逆流萃取機萃取，萃取液為乙酸乙酯，蒸出有機相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到產物 4’-聯苯-2-羧酸 ，反應轉化率99％，產品收率97.1％。