使用固定的易位蛋白的edge測序
[0001]
序列表隨此提交的2019年11月8日創建的大小為1 kb的文本文件edge_st25在此通過引用并入。
技術領域
[0002]
在至少一個方面，本公開涉及用于核酸測序的系統、裝置和方法。
背景技術：
[0003]
單堿基分辨率dna測序是生物技術領域的重要目標。迄今為止，大多數技術都需要從小讀取大幅度重建序列或重復運行以獲得保真度。
技術實現要素：
[0004]
本公開通過公開用于核酸測序的系統、裝置和方法，解決了現有技術的一個或多個問題，該系統、裝置和方法以單堿基對分辨率對多核苷酸鏈例如長讀取進行測序。這種方式的優點是，易位蛋白充當受控的定位位點，以將多核苷酸鏈帶入傳感區，且同時在傳感區內提供受控的易位速率。
[0005]
在另一方面，提供了一種用于核酸測序的系統。該系統包括至少一個裝置，該裝置包括氧化電極、還原電極以及位于氧化電極和還原電極之間的介電構件。特征在于，介電構件將還原電極與氧化電極分開最多10nm的第一距離。蛋白附接到介電構件的表面。該蛋白能夠易位具有被氧化還原標記修飾核苷酸的多核苷酸鏈，或者能夠接收具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸。蛋白的附接使得多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在易位期間達到距介電構件表面最多10納米(nm)的第二距離內。氧化和還原電極產生電場，該電場延伸到反應區域，在該反應區域發生多核苷酸鏈穿過蛋白的易位。有利地，當具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸位于反應區域時，空間尺寸允許從還原電極到氧化還原標記到氧化電極的快速電子轉移(即幾乎同時)。
[0006]
在另一方面，提供了一種用于形成核酸測序裝置的方法。該方法包括提供包括氧化電極、還原電極和介電構件的裝置的第一步驟。特征在于，介電構件將還原電極與氧化電極分開最多10 nm的第一距離。該方法包括通過氧化電極、還原電極或兩者產生電場的第二步驟。該方法還包括將蛋白附接到介電構件的表面的第三步驟。蛋白能夠易位具有被氧化還原標記修飾的核苷酸的多核苷酸鏈，或者能夠接收具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸到介電構件的表面。蛋白附接于介電構件的表面，使得多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在易位期間在距介電構件表面最多10 nm處經過。該方法允許制造包括具有易位蛋白的裝置的陣列，所述易位蛋白至少部分地在介電構件的表面上對齊，并且任選地均勻分布。有利地，當檢測到電流中的變化時，這允許更強的信號。
[0007]
在仍另一方面，提供了一種用于核酸測序的方法。該方法包括提供至少一個裝置的第一步驟，所述裝置包括氧化電極、還原電極、介電構件和附接于介電構件的表面的蛋白。特征在于，介電構件將還原電極與氧化電極分開最多10 nm的第一距離。該蛋白能夠易位具有被氧化還原標記修飾的核苷酸的多核苷酸鏈，或者能夠接收具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸。蛋白的附接使得多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在易位期間達到距介電構件表面最多10 nm的第二距離內。該方法包括引導電流通過氧化和還原電極的第三步驟，其中氧化和還原電極產生電場，所述電場延伸到反應區域，在該反應區域發生多核苷酸鏈穿過蛋白的易位。該方法包括將所述蛋白暴露于包含多核苷酸鏈的樣品的第四步驟，這允許多核苷酸鏈易位通過所述蛋白。該方法包括檢測在氧化和還原電極中電流的變化的第五步驟。當多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸位于反應區域時，變化識別出從還原電極到氧化還原標記和到氧化電極的電子轉移。有利地，當具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸位于反應區域時，空間尺寸允許從還原電極到氧化還原標記到氧化電極的快速電子轉移(即幾乎同時)。
附圖說明
[0008]
為了進一步理解本公開的性質、目的和優點，應參考以下結合附圖進行閱讀的詳細描述，其中相似的參考數字表示相似的元件，并且其中：圖1a顯示包括裝置的用于核酸測序的系統的前視圖。
[0009]
圖1b顯示附接至介電構件的易位蛋白的前視圖。
[0010]
圖1c顯示包括裝置的用于核酸測序的系統的頂視圖。
[0011]
圖1d顯示用于核酸測序的系統的頂視圖，該系統包括來自還原電極和氧化電極的重疊。
[0012]
圖1e顯示用于核酸測序的系統的側視圖，該系統包括來自還原電極和氧化電極的重疊。
[0013]
圖2a、2b和2c顯示用于平面電極對的修飾的三種不同幾何形狀的示意圖。
[0014]
圖3和圖4顯示非平面設計的兩種不同幾何形狀的示意圖，其中將電極對制造為孔形式的堆疊，且將孔在一側填充。
[0015]
圖5顯示用于制造裝置的過程的示意圖。
[0016]
圖6和圖7顯示包括裝置陣列的系統。
[0017]
圖8a顯示包括兩個裝置的系統。
[0018]
圖8b顯示圖8a的系統的蛋白的慣量主軸。
[0019]
圖9a顯示包括裝置的系統。
[0020]
圖9b顯示圖9a的系統的蛋白的慣量主軸。
[0021]
圖10顯示包括三個裝置的系統。
[0022]
圖11顯示包括三個裝置的系統。
[0023]
圖12顯示用于制造裝置的過程的示意圖。
[0024]
圖13是用于聚合酶介導的氧化還原dna測序的方法的示意圖。聚合酶錨定在兩個電極之間的納米尺度電介質的表面。聚合酶可以與dna和引物鏈結合，并通過聚合酶鏈反應
開始摻入核苷酸。如圖13所公開，陰影的c堿基代表氧化還原修飾的胞嘧啶核苷酸，其可與傳感區內的相鄰電極發生氧化和還原反應。隨著它們被摻入，具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的氧化還原修飾的核苷酸的探測可用于確定鏈的dna序列。
[0025]
圖14是用于聚合酶介導的氧化還原dna測序的可選方法的示意圖。聚合酶錨定在兩個電極之間的納米尺度電介質的表面。聚合酶可以與dna和引物鏈結合，并通過聚合酶鏈反應開始摻入核苷酸。在該實例中，沿著鏈的陰影物質表示氧化還原修飾的胞嘧啶核苷酸，其可以與傳感區內的相鄰電極發生氧化和還原反應。具有共價鍵合至先前摻入dna中的修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的氧化還原修飾的核苷酸的探測可用于確定鏈的dna序列。
[0026]
圖15和16顯示核酸測序的方法和系統。
[0027]
圖17顯示產生具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的氧化還原修飾的核苷酸的合成路線。
[0028]
圖18顯示用于單個核苷酸的“點擊(click)”介導的氧化還原修飾的合成路線。
[0029]
圖19顯示摻入核苷酸的“點擊”介導的氧化還原修飾的合成路線。
具體實施方式
[0030]
根據需要，本文公開了本公開的詳細實施方案；然而，應當理解，所公開的實施方案僅是示例性的，并且可以以各種和替代的形式來體現。附圖不一定是按比例的；一些特征可能被放大或最小化以顯示特定組件的細節。因此，本文公開的具體結構和功能細節都不應被解釋為限制性的，而僅僅是作為指導本領域技術人員的代表性基礎。
[0031]
除了在實施例中或在明確另行指明之處外，本說明書中表示材料量或反應條件和/或使用條件的所有數值量應被理解為用詞語“大約”修飾。首字母縮寫詞或其他縮寫詞的第一個定義適用于本文中該相同縮寫詞的所有后續使用，并在必要的修改后適用于最初定義的縮寫詞的常規語法變體；并且，除非有相反的明確說明，否則通過與之前或之后針對同一特性所引用的相同技術來確定該特性的測量結果。
[0032]
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本公開所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。
[0033]
還應當理解的是本公開不限于下述的具體實施方案和方法，因為具體的組分和/或條件毫無疑問可以變化。此外，本文所使用的術語僅用于描述特定實施方案，而無意以任何方式進行限制。
[0034]
還必須要注意的是，在說明書和所附權利要求中使用時，單數形式“一個/種(a)”、“一個/種(an)”和“所述/該(the)”包括復數形式的指示物，除非上下文另有明確說明。例如，提及單數形式的組件意在包括多個組件。
[0035]
術語“或”和“和”可以互換使用，并且可以理解為表示“和/或”。
[0036]
術語“包含”與“包括”、“具有”、“含有”或“特征在于”同義。這些術語是包括性的且開放式的，并且不排除其他未記載的要素或方法步驟。
[0037]
短語“由...組成”排除權利要求中未指定的任何要素、步驟或成分。當此短語出現在權利要求實體的一個從句中而不是緊接在前序部分之后時，它僅限制該從句中列出的要素；總體上，其他要素不排除在權利要求范圍內。
[0038]
短語“基本上由...組成”將權利要求的范圍限制到指定的材料或步驟、以及不實質上影響所要求保護的主題的基本的和新的特征的那些。
[0039]
可以替代地使用術語“包括/包含”、“由...組成”和“基本上由...組成”。當使用這三個術語中的一個時，當前公開和要求保護的主題可以包括使用其他兩個術語中的任一個。
[0040]
在本公開中，術語“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們指任何長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三維結構，并且可以執行已知的或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：單鏈、雙鏈或多鏈dna或rna，基因組dna，cdna，dna-rna雜合物，或包含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然的、化學或生物化學修飾的、非天然的、或衍生的核苷酸堿基的聚合物。術語“多核苷酸”和“核酸”應理解為包括適用于所描述的實施方案的單鏈(例如有義或反義)和雙鏈多核苷酸。多核苷酸可以包含一個或多個修飾核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話，可以在聚合物裝配之前或之后賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸的序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸在聚合之后可進一步被修飾，諸如通過與標記組分綴合而被修飾。
[0041]
術語“序列同一性”或“同一性”是指如通過序列比較算法或通過目測檢查所測量的，當在指定的比較窗口上進行比對以獲得最大對應性時，兩個核酸或氨基酸序列中相同的殘基的指定百分比。在序列在保守取代中不同時，可以向上調整序列同一性百分比以對取代的保守性進行校正。通過這種保守取代而不同的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。進行這種調整的手段是本領域技術人員眾所周知的。通常，這涉及將保守取代評分為部分不匹配而不是完全不匹配，從而增加序列同一性百分比。
[0042]
術語“比較窗口”是指至少約20個連續位置的區段，其中在兩個序列最佳地比對之后，可以將序列與相同數目的連續位置的參考序列進行比較。在一個改進方案中，比較窗口是從15到30個連續位置，其中在將兩個序列最佳地比對之后，可以將序列與相同數目的連續位置的參考序列進行比較。在另一個改進方案中，比較窗口通常是約50至約200個連續位置，其中在將兩個序列最佳地比對之后，可以將序列與相同數目的連續位置的參考序列進行比較。
[0043]
術語“互補性”或“互補”是指核酸通過傳統的watson-crick或其他非傳統類型與另一核酸序列形成氫鍵的能力?；パa性百分比表示核酸分子中可以與第二核酸序列形成氫鍵(例如watson-crick堿基配對)的殘基百分比(例如6個中的4個、5個和6個為66.67％、83.33％和100％互補)?！巴耆パa”是指核酸序列的所有連續殘基將與第二核酸序列中相同數目的連續殘基氫鍵鍵合。如本文所用，“基本上互補”是指至少40％、50％、60％、62.5％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互補性程度，或在4、5、6、7和8個核苷酸區域上之間的百分比，或者是指在嚴格條件下雜交的兩個核酸。
[0044]
如本文所用，術語“易位蛋白(translocator)”、“易位蛋白(translocating protein)”、“酶”和“蛋白”是指能夠易位多核苷酸鏈的任何肽、寡肽、多肽、基因產物、表達產物或蛋白。能夠易位多核苷酸鏈的蛋白的實例括dna聚合酶、rna聚合酶、核糖體、單鏈結合蛋白、拓撲異構酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸內切酶、鋅指核酸酶、rna引導的dna核酸內切酶、轉錄激活子樣效應子核酸酶、crispr蛋白及其組合。
[0045]
除非相反地明確說明，否則所有r基團(例如r
i
，其中i為整數)包括氫、烷基、低級烷基、c
1-6
烷基、c
6-10
芳基、c
6-10
雜芳基、-no2、-nh2、-n(r'r'')2、-n(r'r''r''')
3+
l-、cl、f、br、-cf
3、-ccl3、-cn、-so3h、-po3h2、-cooh、-co2r'、-cor'、-cho、-oh、-or'、-o-m
+
、-so
3-m
+
、-po
3-m
+
、-coo-m
+
、-cf2h、-cf2r'、-cfh2和-cfr'r''，其中r'、r''和r'''是c
1-10
烷基或c
6-18
芳基；單個字母(例如“n”或“o”)為1、2、3、4或5；在本文公開的化合物中，ch鍵可被烷基、低級烷基、c
1-6
烷基、c
6-10
芳基、c
6-10
雜芳基、-no2、-nh2、-n(r'r'')2、-n(r'r''r''')
3+
l-、cl、f、br、-cf3、-ccl3、-cn、-so3h、-po3h2、-cooh、-co2r'、-cor'、-cho、-oh、-or'、-o-m
+
、-so
3-m
+
、-po
3-m
+
、-coo-m
+
、-cf2h、-cf2r'、-cfh2和-cfr'r''取代，其中r'、r''和r'''是c
1-10
烷基或c
6-18
芳基；帶有正電荷的部分或結構的指示表示存在一個或多個負平衡離子以平衡電荷，類似地，帶有負電荷的部分或結構的指示表示存在一個或多個正平衡離子以平衡電荷；百分比，“的份數”和比率值按重量計；術語“聚合物”包括“寡聚物”、“共聚物”，“三元共聚物”等；除非另有說明，提供給任何聚合物的分子量是指重均分子量；關于與本發明有關的對給定目的適用的或優選的一組或一類材料的描述表示該組或類的任何兩個或多個成員的混合物同樣是適用或優選的；用化學術語對成分的描述是指添加到說明書中指定的任何組合時的成分，并且不一定排除一旦混合后混合物的成分之間的化學相互作用；首字母縮寫詞或其他縮寫詞的第一個定義適用于本文中該相同縮寫詞的所有后續使用，并且在必要的修改后適用于最初定義的縮寫詞的常規語法變體；并且，除非有相反的明確說明，否則通過與之前或之后針對同一特性所引用的相同技術來確定該特性的測量結果。
[0046]
如本文所用的術語“烷基”是指c
1-20
直鏈、支化、環狀、飽和或至少部分不飽和和在一些情況下完全不飽和(即烯基和炔基)的烴鏈，包括例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和丙二烯基(allenyl)。“低級烷基”是指具有1個至約8個碳原子(即c
1-8
烷基)，例如1、2、3、4、5、6、7或8個碳原子的烷基。低級烷基也可以指上面列出的任何兩個碳原子數之間的范圍。“高級烷基”是指具有約10個至約20個碳原子，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個碳原子的烷基。高級烷基還可以指上面列出的任何兩個碳原子數之間的范圍。
[0047]
如本文所用，術語“芳基”意指芳族取代基，其可以是單芳環或稠合在一起、共價連接或連接到共用基團(例如但不限于，亞甲基或亞乙基部分)的多芳環。共用連接基團也可以是羰基，如在二苯甲酮中，或氧，如在二苯基醚中。芳基的實例包括但不限于苯基、萘基、聯苯和二苯醚等。芳基包括雜芳基，其中一個或多個芳環包括雜原子(例如，n、o、s或se)。示例性的雜芳基基團包括但不限于呋喃基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、異喹啉基、噻吩基等。芳基任選可被一個或多個可以是相同或不同的芳基取代基取代(“取代的芳基”)，其中“芳基取代基”包括烷基(飽和或不飽和)、取代的烷基(例如鹵代烷基和全鹵代烷基，例如但不限于
–
cf3)、環烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、鹵素、硝基、羥基、酰基、羧基、烷氧基(例如甲氧基)、芳氧基、芳烷氧基、硫代烷基、硫代芳基、硫代芳烷基、氨基(例如，氨基烷基、氨基二烷基、氨基芳基等)、磺?；蛠喕酋；?br/>[0048]
還應當理解，整數范圍明確地包括所有中間整數。例如，整數范圍1-10明確包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。同樣，范圍1到100包括1、2、3、4
?…?
97、98、99、100。類似地，當要求任何范圍時，可以將作為上限和下限之差除以10的增量的中間數字作為替代上限或下限。
例如，如果范圍是1.1至2.1，可以選擇以下數字1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0作為下限或上限。在本文闡述的具體實例中，濃度、溫度和反應條件(例如壓力、ph等)可以以四舍五入為三位有效數字所示的值的正負50％進行實施。在一個改進方案中，濃度、溫度和反應條件(例如壓力、ph等)可以以四舍五入為實例中提供的值的三位有效數字所示的值的正負30％進行實施。在另一個改進方案中，濃度、溫度和反應條件(例如ph等)可以以四舍五入為實例中提供的值的三位有效數字所示的值的正負10％進行實施。
[0049]
在本文闡述的實施例中，濃度、溫度和反應條件(例如，壓力、ph、流速等)可以以表示約為或截短至實例中提供的值的兩位有效數字的值的正負50％進行實施。在一個改進方案中，濃度、溫度和反應條件(例如，壓力、ph、流速等)可以以表示約為或截短至實例中提供的值的兩位有效數字的值的正負30％進行實施。在另一個改進方案中，濃度、溫度和反應條件(例如，壓力、ph、流速等)可以以表示約為或截短至實例中提供的值的兩位有效數字的值的正負10％進行實施。
[0050]
在整個本申請中，在引用了出版物的情況下，這些出版物的公開內容以其整體通過引用并入本申請，以更充分地描述本發明所屬領域的技術水平。
[0051]
本公開公開了一種可以以單堿基對分辨率讀取長讀取的裝置。本公開還并入添加易位蛋白(例如生物聚合酶)作為將dna引入探測裝置的方法，如描述于2018年6月15日提交的美國專利申請號16/009,766和于2017年11月3日提交的美國臨時申請號62/581,366，其兩者以其整體通過引用并入。這種方式的優點是易位蛋白充當將dna帶入傳感區的受控定位位點，并同時在傳感區內提供受控的易位速率，這是對單堿基分辨率測序要控制的兩個參數。
[0052]
為了實現將諸如dna的多核苷酸鏈降低至傳感區域內、控制易位速度并減少生產工作裝置所需的制造步驟數的目的，將易位蛋白(例如dna聚合酶)結合到氧化和還原電極之間的介電間隙或元件上的表面。
[0053]
圖1a示出了用于核酸測序的系統10。系統10包括至少一個裝置12，裝置12包括氧化電極18、還原電極20以及位于氧化電極18和還原電極20之間的介電構件16。特征在于，介電構件16將還原電極20與氧化電極16分隔開最多10 nm的第一距離28。蛋白22附接24到電介質的表面25。蛋白22能夠易位具有被氧化還原標記修飾的核苷酸的多核苷酸鏈，或者能夠接收具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸。眾所周知，核苷酸包括核苷堿基，其有時被稱為核堿基。在本上下文中，術語氧化還原標記包括完全功能性氧化還原標記或可以反應以形成功能性氧化還原標記的部分。此外，術語“共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基”是指包括氧化還原標記的部分與核苷酸共價鍵合。在至少一方面，修飾核苷酸由于與之結合的氧化還原標記而被修飾。蛋白22的附接24使得多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在易位期間達到距介電構件的表面最多10 nm的第二距離內。氧化和還原電極18,20產生延伸到反應區域的電場，在該反應區域發生多核苷酸鏈穿過蛋白的易位。有利地，當具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸位于反應區域時，空間尺寸允許從還原電極到氧化還原標記到氧化電極的快速電子轉移(即幾乎同時)。而且，空間尺寸使得擴散不是電子傳遞的重要貢獻因素。
[0054]
圖1a還示出了包括電極對格式裝置14的裝置12，所述電極對格式裝置14包括位于
氧化偏壓電極或氧化電極18與還原偏壓電極或還原電極20之間的介電構件16。美國專利申請號16/009,766和美國臨時申請號62/581,366公開了電極對格式裝置14的示例實施方案以及制造電極對格式裝置14的方法。美國專利申請號16/009,766和美國臨時申請號62/581,366均公開了使用氧化還原標記和穿梭原理的dna測序方法。簡而言之，穿梭檢測機制包括被納米級厚電介質隔開的兩個電極。電極保持在氧化和還原電勢下，以實現氧化還原分子的可逆電化學反應。兩個電極之間的小空間稱為傳感區，所述區域足夠小以使氧化還原分子與兩個電極相互作用并使電路完整。當氧化還原分子位于傳感區時，電子可以在還原電極和氧化電極之間“穿梭”，產生放大的電流信號，該信號遠高于單個電子轉移事件所預期的信號。此機制與納米間隙裝置不同，在納米間隙裝置中，氧化還原分子必須在電極之間來回擴散以產生可測量的電信號。
[0055]
各個實施方案的介電構件16包括具有介電常數的材料，使得氧化電極18和還原電極20之間的隧道電流的波動小于由從還原電極20到氧化還原標記并到氧化電極18的電子轉移所導致的電流變化。材料的實例包括硅酸鉿和硅酸鋯，金屬氧化物或氮化物，例如氧化鋁、二氧化鈦、氧化鉿、氧化鋯、氧化硅、氮化硅和六方氮化硼。
[0056]
在各個實施方案中，介電構件16將還原電極20與氧化電極18分開最多10 nm的第一距離28。在各個實施方案中，介電構件16在氧化電極18與還原電極20之間具有范圍在1 nm至10 nm的寬度28，優選地范圍在1 nm至4 nm。在各個實施方案中，在氧化電極18和還原電極20之間的介電構件16的寬度28是0.5nm、1 nm、1.25 nm、1.5 nm、1.75 nm、2 nm、2.25 nm、2.5 nm、2.75 nm、3 nm、3.25 nm、3.5 nm、3.75 nm、4 nm、4.25 nm、4.5 nm、4.75 nm、5 nm、5.25 nm、5.5 nm、5.75 nm、6 nm、6.25 nm、6.5 nm、6.75 nm、7 nm、7.25 nm、7.5 nm、7.75 nm、8 nm、8.25 nm、8.5 nm、8.75 nm、9 nm、9.25 nm、9.5 nm、9.75 nm或10 nm。在各個實施方案中，介電構件16的寬度28的范圍在上述指定寬度的任何兩個之間。
[0057]
一個參數是介電構件16的橫截面面積，其由厚度35和氧化電極18和還原電極20之間的長度31、33限定。介電構件16的橫截面面積優選地足夠小以允許電子穿梭，同時在電極之間提供足夠的絕緣以避免短路。
[0058]
在如圖1b所示的各個實施方案中，介電構件16具有厚度35，其范圍為5 nm至5000 nm，優選10 nm至1000 nm。在各個實施方案中，介電構件16的厚度35是5 nm、10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm或5000 nm。在各個實施方案中，介電構件16的厚度35的范圍在上述指定厚度的任何兩個之間。
[0059]
在各個實施方案中，氧化電極18具有與樣品或溶液接觸的寬度30，其范圍為5 nm至5000 nm，優選10 nm至1000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的氧化電極18的寬度30是5 nm、10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm或5000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的氧化電極18的寬度30的范圍在上述
指定寬度的任何兩個之間。
[0060]
在圖1c所示的各個實施方案中，氧化電極18具有與樣品或溶液接觸的長度31，其范圍為10 nm至10000 nm，優選50 nm至5000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的氧化電極18的長度31為10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm、5000 nm、6000 nm、7000 nm、8000 nm、9000 nm或10000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的氧化電極18的長度31的范圍在上述指定長度的任何兩個之間。
[0061]
在各個實施方案中，還原電極20具有與樣品或溶液接觸的寬度32，其范圍為5 nm至5000 nm，優選為10 nm至1000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的還原電極20的寬度32為5 nm、10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm或5000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的還原電極20的寬度32的范圍在上述指定寬度的任何兩個之間。
[0062]
在圖1c所示的各個實施方案中，還原電極20具有與樣品或溶液接觸的長度33，其范圍為10 nm至10000 nm，優選50 nm至5000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的還原電極20的長度33為10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm、5000 nm、6000 nm、7000 nm、8000 nm、9000 nm或10000 nm。在各個實施方案中，與樣品或溶液接觸的還原電極20的長度33的范圍在上述指定長度中的任何兩個之間。
[0063]
在如圖1d和1e所示的各個實施方案中，氧化電極18和還原電極20之間的重疊41具有：長度45，其范圍為10 nm至10000 nm，優選為50 nm至5000 nm；和寬度43，其范圍為1 nm至10 nm，優選為1 nm至4 nm。氧化電極18和還原電極20之間的重疊41可以理解為來自氧化電極18和還原電極20的電場的疊加。
[0064]
各個實施方案的重疊41的長度45是10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm、5000 nm、6000 nm、7000 nm、8000 nm、9000 nm或10000 nm。在各個實施方案中，長度45的范圍在上述指定長度的任何兩個之間。
[0065]
各個實施方案的重疊41的寬度43是氧化電極18和還原電極20之間的介電構件16的寬度28，其為0.5nm、1 nm、1.25 nm、1.5 nm、1.75 nm、2 nm、2.25 nm、2.5 nm、2.75 nm、3 nm、3.25 nm、3.5 nm、3.75 nm、4 nm、4.25 nm、4.5 nm、4.75 nm、5 nm、5.25 nm、5.5 nm、5.75 nm、6 nm、6.25 nm、6.5 nm、6.75 nm、7 nm、7.25 nm、7.5 nm、7.75 nm、8 nm、8.25 nm、
8.5 nm、8.75 nm、9 nm、9.25 nm、9.5 nm、9.75 nm或10 nm。在各個實施方案中，寬度43的范圍在上述指定寬度的任何兩個之間。
[0066]
在各個實施方案中，氧化電極18或還原電極20是平面電極。各個實施方案的氧化電極18或還原電極20包括諸如氮化鈦、鈀或鉑的材料。用于各個實施方案的系統和裝置中的電極的實例在美國專利申請公開號2017/0370870中公開，其以其整體通過引用并入。
[0067]
易位蛋白22是能夠結合多核苷酸鏈(例如雙鏈或單鏈dna和rna)的蛋白并使多核苷酸鏈易位或穿梭通過所述蛋白。易位蛋白的實例包括dna聚合酶(例如taq聚合酶)、rna聚合酶(例如t7 rna聚合酶)、核糖體、單鏈結合蛋白、拓撲異構酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸內切酶、鋅指核酸酶，rna引導的dna核酸內切酶、轉錄激活子樣效應子核酸酶和crispr蛋白。
[0068]
例如，保持且掃描通過dna鏈的其他潛在酶包括核酸酶，例如核酸外切酶、核酸內切酶、脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶；解旋酶和crispr蛋白。crispr蛋白的實例是crispr-cas型和crispr相關蛋白，包括但不限于cas9和csf1。在crispr相關的酶的情況下，各個實施方案的裝置包括使用grna靶標作為引導，其可被設計為不識別被測序的dna鏈的任何部分。所述酶控制整個靶標dna在傳感區內的易位和讀出。
[0069]
在各個實施方案中，蛋白22附接到介電構件16的表面25，使得多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在距所述介電構件表面最多10nm處經過。在各個實施方案中，蛋白附接到介電構件的表面，使得多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在距所述介電構件表面0nm、0.25nm、0.5nm、0.75nm、1 nm、1.25 nm、1.5 nm、1.75 nm、2 nm、2.25 nm、2.5 nm、2.75 nm、3 nm、3.25 nm、3.5 nm、3.75 nm、4 nm、4.25 nm、4.5 nm、4.75 nm、5 nm、5.25 nm、5.5 nm、5.75 nm、6 nm、6.25 nm、6.5 nm、6.75 nm、7 nm、7.25 nm、7.5 nm、7.75 nm、8 nm、8.25 nm、8.5 nm、8.75 nm、9 nm、9.25 nm、9.5 nm、9.75 nm或10 nm處經過。在各個實施方案中，多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸經過所述介電構件表面的距離的范圍在上述指定距離中任何兩個之間。
[0070]
圖2a、2b、2c、3和4顯示并入在不同結構內的裝置12。
[0071]
圖2a顯示裝置12，其包括電極18,20和在結構100中具有附接的易位蛋白22的介電構件16，結構100將裝置12或蛋白22暴露于可向其添加樣品的開口101。圖2b顯示裝置12，其包括電極18,20和并入在通道(納米通道)的壁102內的具有附接的易位蛋白22的介電構件16，其中裝置12或蛋白22暴露于可向其添加樣品的通道103。附接在平面電極之間的介電構件上的蛋白(例如聚合酶)并不需要納米通道，而是可以位于通道或開放溶液中，如圖14所示(開放和通道)。
[0072]
圖2c顯示裝置12，其包括電極18,20和具有附接的易位蛋白22的介電構件16作為孔104的底板104。裝置12或蛋白22暴露于可向其添加樣品的通道105。
[0073]
圖3顯示作為孔106的一部分的多個裝置12。裝置12包括電極18,20和具有附接的易位蛋白22的介電構件16。如圖3所示，孔106具有相對的側壁108,110，其附接至限定通道114的底板112?？梢詫⒀b置12并入側壁108,110或底板112中，以使蛋白22定位于通道114內。例如，在孔的邊緣形成所述結構的情況下(如圖3所示)，替代的制造方法是可能的。
[0074]
圖4顯示側壁116,118，其限定了與通道114相比尺寸減小的通道120，其中裝置12
可以并入側壁116中，以使蛋白22定位于通道114內。裝置12包括電極18,20和具有附接的易位蛋白22的介電構件16。
[0075]
制造圖2a、2b、2c、3和4中所示的裝置12的電極對格式裝置14的方法描述于美國專利申請號16/009,766和美國臨時申請號62/581,366，并經過修改。
[0076]
圖5顯示制造各個實施方案的裝置12的方法的示意圖。在步驟34中，介電構件16的表面25經修飾26以包括附接劑24。在步驟36和38中，易位蛋白22通過與附接劑24的附接40而附接至介電構件16。易位蛋白22的綴合可以通過使用雙官能偶聯劑24控制，所述雙官能偶聯劑24在一端與介電構件反應，例如硅烷化學反應或有機亞磷酸(organophosphorous acids)化學反應，而在另一端與生物分子反應，例如羧基、醛、磺酸、異硫氰酸酯、nhs酯、環氧化物或碳二亞胺化學。應當理解，步驟34、36和38 (例如34 >> 36,38)可以順序地、同時地或以不同的順序(例如36,38 >> 34)發生。所述化學反應優選相對于金屬電極，是對介電材料(例如，氧化鋁)是選擇性的，使得共價結合發生在電極之間的介電構件上且不發生在金屬電極的頂部上。在一個實例中，所述雙官能偶聯劑是3-氨基丙基三乙氧基硅烷。經由硅烷化學反應附接的實例由sin、eun jung等人的"surface modification of aluminum oxide for biosensing application." biomedical engineering: applications、basis and communications 24.02 (2012): 111-116公開，其以其整體通過引用并入。經由有機亞磷酸化學反應附接的實例由mutin、p. hubert等人的"selective surface modification of sio2
??
tio2 supports with phosphonic acids." chemistry of materials 16.26 (2004): 5670-5675公開，其以其整體通過引用并入?？蛇x地，易位蛋白可以物理吸附到介電層上，而不是共價連接。在一個實例中，結果是共價偶聯在兩個電極之間的聚合酶，其中結合口袋允許其中的化學物質與電極相互作用。這樣，在dna復制時，當氧化還原修飾的堿基進入酶活性位點時，其開始與電極發生電化學氧化和還原反應。這允許電子穿梭，其用于檢測用于測序的修飾堿基的存在。
[0077]
圖6和7顯示包括裝置12的陣列42,44的系統1020,1040。在各個實施方案中，所述系統包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、10000或100000個裝置。在各個實施方案中，裝置的數量的范圍在上述指定數量的裝置中的任何兩個之間。在一個改進方案中，每個陣列中的蛋白均勻分布。
[0078]
圖8a、8b、9a和9b顯示蛋白22在介電構件16的表面上至少部分對齊。在此方面，對齊是指在多個裝置12中每個蛋白的慣量主軸的定向不是隨機的。
[0079]
圖8a顯示包括具有附接的蛋白22、22'的兩個裝置12的系統。如圖8a所示，蛋白22和22'對齊。為簡單起見，在圖8a中，僅描繪了相應的慣量主軸51和54且顯示在蛋白之間對齊。圖8b顯示蛋白22和22'的定向，使得相應的慣量主軸51、54可以彼此偏離角度a2。
[0080]
圖9a和圖9b顯示其中蛋白22和22'稍微未對齊的一般情況。蛋白22限定相關的慣量主軸l1，l2，l
3，
而蛋白22'限定相關的慣量主軸l'1，l'2，l'3。第一慣量主軸l1，l'1可彼此偏離最大角度a1，第二慣量主軸l2，l'2可彼此偏離最大角度a2，且第三慣量主軸l3，l'3可彼此偏離最大角度a3，其中角度a1，a2和a3中的每個角度最多為60度。由于蛋白22至少基本上均勻地定向在介電構件16的表面上，因此，蛋白之間的相應慣量主軸的偏差具有彼此相對較小的角度。在一個改進方案中，a1，a2和a3最多為45度。在進一步的改進方案中，a1，a2和a3最多為0
°
、1
°
、2
°
、3
°
、4
°
、5
°
、6
°
、7
°
、8
°
、9
°
、10
°
、11
°
、12
°
、13
°
、14
°
、15
°
、16
°
、17
°
、18
°
、19
°
、
20
°
、21
°
、22
°
、23
°
、24
°
、25
°
、26
°
、27
°
、28
°
、29
°
、30
°
、31
°
、32
°
、33
°
、34
°
、35
°
、36
°
、37
°
、38
°
、39
°
、40
°
、41
°
、42
°
、43
°
、44
°
、45
°
、46
°
、47
°
、48
°
、49
°
、50
°
、51
°
、52
°
、53
°
、54
°
、55
°
、56
°
、57
°
、58
°
、59
°
或60
°
。在各個實施方案中，偏差的范圍在在上述指定度數的任何兩個之間。
[0081]
圖10和11顯示蛋白22在介電構件16的表面上至少部分對齊。在此方面，對齊是指蛋白均勻地分布在包括多個裝置12的預定區域上。
[0082]
圖10顯示包括三個裝置12的系統1100。如圖8所示，蛋白22附接在這樣的位置，以使蛋白22內發生易位57的反應區域或用于氧化電極18和還原電極20的傳感區57相對于介電構件16位于相同位置。
[0083]
圖11顯示包括三個裝置12的系統1120。如圖9所示，蛋白22附接在不同的位置，以使在蛋白22內發生易位57,57',57''的反應區域或用于氧化電極18和還原電極20的傳感區57,57',57''位于區域58內。在各個實施方案中，將蛋白附接到介電構件，以使蛋白的反應區域或傳感區彼此的距離為0 nm、0.1 nm、0.2 nm、0.3 nm、0.4 nm、0.5 nm、0.6 nm、0.7 nm、0.8 nm、0.9 nm、1 nm、1.1 nm、1.2 nm、1.3 nm、1.4 nm、1.5 nm、1.6 nm、1.7 nm、1.8 nm、1.9 nm和2nm。在各個實施方案中，所述距離的范圍在上述指定距離中的任何兩個之間。
[0084]
圖12顯示系統1020、1040、1100、1120的制造的示意圖，包括用于形成核酸測序裝置的方法。所述方法包括在步驟60之前，提供包括氧化電極18、還原電極20和介電構件16的裝置14。特征在于，介電構件16將還原電極20與氧化電極20隔開最多10nm的第一距離。所述方法包括通過氧化電極18、還原電極16或兩者產生電場66的第二步驟62。所述方法還包括將蛋白22附接24到介電構件16的表面25的第三步驟64。蛋白22能夠將具有用氧化還原標記修飾的核苷酸的多核苷酸鏈易位，或者能夠將具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸接收至介電構件的表面，從而使多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在易位期間，以距所述介電構件表面最多10nm的第二距離經過。在步驟64中，易位蛋白22 (例如聚合酶)被電場66引導至介電構件16，并被電場66誘導成至少基本均勻的定向。在不同的實例中，可以如下方式選擇電壓，使得它們通過電學方式以對稱的力吸引帶電的聚合酶，從而使聚合酶結合在電極之間。可選地，可以產生橫向電場以控制聚合酶分子的定向，使得相對均勻的定向可以導致改善的傳感器性能?？刂频鞍锥ㄏ虻臋M向電場的實例公開在emaminejad, sam等人，"tunable control of antibody immobilization using electric field. "proceedings of the national academy of sciences 112.7 (2015): 1995-1999，其以其整體通過引用并入。
[0085]
例如，在聚合酶固定過程中由電極產生的電場可用于將生物分子引導至介電層并誘導在表面上的均勻定向。例如，可以如下方式選擇電壓，使得它們通過電學方式以對稱的力吸引帶電的聚合酶，從而使聚合酶結合在電極之間。在需要將聚合酶選擇性吸附到介電層上的情況下，可以設置電極上的電壓以產生不利于聚合酶附接到電極上的表面電荷(當表面電荷與聚合酶的等電點匹配時，吸附減少)。可選地，可以產生橫向電場來控制聚合酶分子的定向，因為均勻定向可以提高傳感器的性能(參見emaminejad等人)。
[0086]
圖13、14、15和16顯示了核酸測序的方法。所述方法包括提供至少一個裝置的第一步驟，所述裝置包括氧化電極18、還原電極20、介電構件16和附接24到介電構件16的表面25的蛋白22。特征在于，介電構件16將還原電極20與氧化電極18隔開最多10nm的第一距離。蛋白22能夠將具有用氧化還原標記修飾的核苷酸的多核苷酸鏈易位，或者能夠接收具有共價
鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸。蛋白22的附接64使得多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在易位期間達到距介電構件16的表面25最多10 nm的第二距離內。所述方法包括引導電流通過氧化電極18和還原電極20的第三步驟，其中氧化電極18和還原電極20產生延伸到反應區域的電場，在所述反應區域發生多核苷酸鏈穿過蛋白22的易位。所述方法包括使蛋白22暴露于包含多核苷酸鏈的樣品的第三步驟，其允許多核苷酸鏈穿過蛋白22易位。所述方法包括檢測氧化電極18和還原電極20中的電流變化的第四步驟。當多核苷酸鏈的具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸在反應區域時，所述變化識別出從還原電極20至氧化還原標記以及至氧化電極18的電子轉移。
[0087]
圖13顯示裝置12，其包括在氧化電極18和還原電極20之間的介電構件16，其中dna聚合酶22,68附接24到介電構件16。當電流被引導通過電極18,20，被引導到包括dna聚合酶68的活性位點72的傳感區70時，由氧化電極18和還原電極20產生電場66。使用引物74，dna聚合酶68通過摻入游離的脫氧核苷酸(dntp) 80和經修飾82以包含氧化還原標記83的dntp，而產生堿基鏈78的互補鏈76。當修飾的dntp 82或氧化還原標記在dna復制期間進入活性位點72和傳感區70時，發生從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移84。在圖13舉例說明的實施方案中，在通過聚合酶68的dna復制期間，氧化還原標記83可進入活性位點72或與活性位點72相鄰，使得具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸82的每次摻入，都產生堿基特異性信號。在不同的實例中，可以在沒有氧化還原標記83擴散的情況下發生電子轉移。由于可以確定聚合酶的摻入速度，所以可以將堿基作為信號對時間的函數分配?？梢圆僮魉鲅b置，以使在復制過程中一次對一個堿基進行氧化還原修飾。多個裝置可以并行運行，以實現同時檢測不同的堿基。在溶液中具有氧化還原物質的情況下，存在如下的可能性，即在溶液中自由擴散的氧化還原標記物質也可在電極內相互作用。然而，自由擴散穿過傳感區的分子的時間常數與在摻入期間被限制在傳感區中的分子的時間常數將是不同的。因此，查看信號的頻域可允許區分擴散信號與易位信號。在不同的實例中，聚合酶68錨定在2個電極18,20之間的納米級介電構件16的表面上。聚合酶68可與dna 78和引物74結合，并通過聚合酶鏈反應開始摻入核苷酸80,82。傳感區70在氧化電極18和還原電極20之間的重疊內。
[0088]
在各個實施方案中，從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移84發生的速率(即電子轉移速率)在＃x 10
6 s-1
到＃x 10
12 s-1
的范圍，其中＃是范圍1到10的任何值。在各個實施方案中，電子轉移速率是＃x 10
6 s-1
、＃x 10
7 s-1
、＃x 10
8 s-1
、＃x 10
9 s-1
、＃x 10
10 s-1
、＃x 10
11 s-1
、＃x 10
12 s-1
，其中＃是范圍1到10的任何值。在各個實施方案中，電子轉移速率是在上述指定速率的任何兩個之間選擇的速率。例如，從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移的速率以＃x 10
6 s-1
的速率發生，其中＃為范圍1到10的任何值。
[0089]
在各個實施方案中，在引導步驟中氧化電極18和還原電極20的電壓彼此不同。
[0090]
在可選的實施方案中，電子設備的前端可以以全差分的方式布置。當電流流入前端的一個電極時，具有相同幅度但極性不同的電流流入前端的第二輸入電極。這避免了耦合到兩個電極的干擾通過信號路徑傳輸。這個實施方案的實例公開在，描述于美國專利申請號16/009,766和美國臨時申請號62/581,366中。
[0091]
在另一個實施方案中，在前端最前的第一階段中使用高通特性，這避免了會導致前端信號路徑過載的差分dc電流(來自隧道效應或來自流經聚合酶的電流)。這樣避免信號由于“寄生的(parasitic)”dc電流而被推到測量范圍的極限。來自檢測的堿基的電流變化將經由高通傳輸并在電子信號鏈中處理。
[0092]
各個實施方案的氧化還原標記83是能夠被氧化電極18氧化并被還原電極20還原的化合物。氧化還原標記的實例包括二茂鐵(環戊-1,3-二烯；鐵(2+))及其衍生物、蒽醌(蒽-9,10-二酮)、亞甲基藍([7-(二甲基氨基)吩噻嗪-3-亞基]-二甲基氮雜鎓；氯化物)和吩噻嗪(10h-吩噻嗪)、鋨和釕絡合物、四硫富瓦烯、氨基酚、硝基酚、赤蘚紅b、atto mb2等。在所應用的電勢下，氧化還原物質經歷可逆的氧化-還原反應，以實現穿梭檢測原理。
[0093]
在各個實施方案中，所述方法和系統包括用不同的氧化還原標記修飾的dntp 82，其中每個氧化還原標記具有不同的氧化還原電勢。在實例中，所述方法包括具有不同氧化還原標記的兩種、三種或四種核苷酸dntp。例如，可以修飾腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以包括氧化還原標記，并且可以修飾胞嘧啶或鳥嘌呤以包括不同的氧化還原標記。如何復制dna鏈以摻入氧化還原修飾的核苷酸的實例公開在美國專利申請號16/009,766和美國臨時申請號62/581,366中。
[0094]
在各個實施方案中，具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸82具有下式：其中：x是
或或是單鍵、雙鍵、三鍵，lk不存在或是含烴的連接基團，包括烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環烷基或含雜原子的環系統，r1是h或oh，并且r2是氧化還原標記。
[0095]
具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的修飾核苷酸82的實例包括具有下式的化合物：
或。
[0096]
具有共價鍵合至修飾核苷酸的核苷堿基的氧化還原標記的前體的修飾核苷酸82的實例包括具有下式的化合物：
或
m是1-12，n是1-100，并且o是3-12。
[0097]
圖14類似于圖13，但是不同之處在于，堿基鏈78'包括具有與其附接的氧化還原標記的氧化還原修飾的核苷酸86。使用引物74，dna聚合酶22,68通過摻入游離dntp 80而產生堿基鏈78'的互補鏈76'。在dna復制期間，堿基鏈78'的修飾核苷酸86或氧化還原標記83進入活性位點70或傳感區72時，發生從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移84，其改變流過電極18,20的電流，并產生堿基特異性信號。摻入方法可以包括已經具有如圖14中舉例說明的、用氧化還原摻入物質修飾的單鏈的dna，其描述于美國專利申請號16/009,766和美國臨時申請號62/581,366。可選地，使用未修飾的dna，并且氧化還原修飾的堿基在溶液中。
[0098]
圖15類似于圖13和14，但是不同之處在于使用附接24到介電構件16的核酸酶22,88，而不是dna聚合酶68。核酸酶88結合多核苷酸鏈90，多核苷酸鏈90具有帶有與其附接的氧化還原標記的氧化還原修飾的核苷酸86。在將多核苷酸鏈90消化成片段92期間，核酸酶88使多核苷酸鏈90易位，以使多核苷酸鏈90的氧化還原修飾的核苷酸86或氧化還原標記83進入傳感區70。然后，發生從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移84，其改變流過電極18,20的電流，并產生堿基特異性信號。
[0099]
圖16與圖13、14和15相似，但不同之處在于使用附接24至介電構件16的crispr相關蛋白-9核酸酶22,94。包含恒定區96和靶向區98的crispr單引導rna (sgrna)或crispr靶向rna(crrna)位于crispr相關蛋白-9核酸酶94內。靶向區域98的多核苷酸序列具有這樣的序列，使得crispr相關蛋白-9核酸酶94使具有氧化還原修飾的核苷酸86,83的多核苷酸鏈90易位而不產生雙鏈斷裂。在易位期間，多核苷酸鏈90的修飾核苷酸86或氧化還原標記83進入傳感區70。然后，發生從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移84，其改變流過電極18,20的電流，并產生堿基特異性信號。
[0100]
在各個實施方案中，從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移84發生的速率(即電子轉移速率)在＃x 10
6 s-1
到＃x 10
12 s-1
的范圍，其中＃是范圍1到10的任何值。在各個實施方案中，電子轉移速率是＃x 10
6 s-1
、＃x 10
7 s-1
、＃x 10
8 s-1
、＃x 10
9 s-1
、＃x 10
10 s-1
、＃x 10
11 s-1
、＃x 10
12 s-1
，其中＃是范圍1到10的任何值。在各個實施方案中，電子轉移速率是在上述指定速率的任何兩個之間選擇的速率。例如，從還原電極20到氧化還原標記83以及到氧化電極18的電子轉移的速率以＃x 10
6 s-1
的速率發生，其中＃為范圍1到10的任何值。
[0101]
在各個實施方案中，在引導步驟中氧化電極18和還原電極20的電壓彼此不同。
[0102]
各個實施方案的氧化還原標記83是能夠被氧化電極氧化并被還原電極還原的化合物。氧化還原標記的實例包括二茂鐵(環戊-1,3-二烯；鐵(2+))及其衍生物、蒽醌(蒽-9,10-二酮)、亞甲基藍([7-(二甲基氨基)吩噻嗪-3-亞基]-二甲基氮雜鎓；氯化物)和吩噻嗪(10h-吩噻嗪)、鋨和釕絡合物、四硫富瓦烯、氨基酚、硝基酚、赤蘚紅b、atto mb2等。在所應用的電勢下，氧化還原物質經歷可逆的氧化-還原反應，以實現穿梭檢測原理。
[0103]
在各個實施方案中，所述方法和系統包括用不同的氧化還原標記修飾的核苷酸86，每個所述氧化還原標記具有不同的電勢。在實例中，所述方法包括具有不同氧化還原標記的兩種、三種或四種核苷酸。例如，可以修飾腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以包括氧化還原標記，并且可以修飾胞嘧啶或鳥嘌呤以包括不同的氧化還原標記。如何復制dna鏈以摻入氧化還原修飾的核苷酸的實例公開在美國專利申請號16/009,766和美國臨時申請號62/581,366的圖4和5以及[0017]-[0019]段中。
[0104]
在各個實施方案中，修飾的核苷酸86具有下式：其中：y是核糖、脫氧核糖或氫(h)，z是磷酸或氫，x是
是單鍵、雙鍵、三鍵，lk不存在或是含烴的連接基團，包括烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環烷基或含雜原子的環系統，r1是h或oh，并且r2是氧化還原標記。
[0105]
具有與其附接的氧化還原標記的修飾核苷酸86的實例包括具有下式的化合物：
。
[0106]
具有與其附接的氧化還原標記前體的修飾核苷酸86的實例包括具有下式的化合物：
其中y是核糖、脫氧核糖或氫(h)，z是磷酸或氫，m是1-12，n是1-100，并且o是3-12。
[0107]
下文提供了合成修飾的dntp 82或形成具有與其附接的氧化還原標記的氧化還原修飾的核苷酸86的dntp的方法的實例。
[0108]
可以通過合成包含標記的核苷酸，將氧化還原標記直接引入靶標dna，所述包含標記的核苷酸可以在pcr期間摻入dna鏈中(圖17和18)?？蛇x地，可以使用兩步方法(圖19)：可以通過pcr將包含化學“手柄”的核苷酸引入dna鏈，然后進行另一個化學修飾步驟，在此步驟期間，電化學標記附接至“手柄”。對于此策略，主要的要求是所選的化學反應與dna分子中存在的任何其他反應性基團正交，與水溶液相容，并是定量的?！包c擊”化學滿足上述所有要求，并且已成為用于修飾dna和蛋白的通用工具。點擊化學是疊氮化物與炔烴之間的反應，產生共價產物
?-?
1,5-二取代的1,2,3-三唑，其通常由銅(i)催化。對于無銅的“點擊”反應，可將空間應變炔烴與疊氮化物反應，或將反式環辛烯與四嗪偶聯(“第三代點擊化學”)?？梢酝ㄟ^pcr步驟，將炔烴、反式環辛烯、疊氮化物或四嗪手柄引入dna中，在所述pcr步驟中引入相應的修飾核苷酸(參見化合物1-8)，然后與含有其他相應反應性基團的電化學標記進行點擊反應。反應性基團可通過碳鏈或環氧乙烷(peg)鏈連接至氧化還原標記(化合物9-12)。
[0109]
反應性基團可以通過碳鏈或環氧乙烷(peg)鏈連接至氧化還原標記(參見下文“點擊”修飾的氧化還原標記的實例)。
[0110]
盡管上文提供的實例顯示了在堿基上修飾的核苷酸，但是氧化還原標記或手柄也可以附接到戊糖。這些實例也顯示在verma, sandeep, and fritz eckstein. "modified oligonucleotides: synthesis and strategy for users." (1998): 99-134，其以其整體通過引用并入。
[0111]
在可選的實施方案中，通過監測偏置電極之間的隧道電流的變化，核苷酸本身是報道子。進入聚合酶的核苷酸的化學性質以及核苷酸進入結合口袋后酶結構的變化，將導致隧道效應效率的化學變化，從而產生可以區分存在的堿基的隧道電流變化?？梢允褂迷鰪娝淼佬首兓目蛇xdna修飾來增強信號，例如通過使用聚合物主鏈(pna)而不是脫氧核糖主鏈(dna)，因為與標準堿基相比，不帶電的主鏈將是對電場更顯著的改變。也可以使用其他化學物質，其最終目的是使堿基進入傳感區時對隧道電流的破壞最大化。
[0112]
在其他實施方案中，電子設備的前端可以以全差分的方式布置。當電流流入前端的一個電極時，具有相同幅度但極性不同的電流流入前端的第二輸入電極。這避免了耦合
到兩個電極的干擾通過信號路徑傳輸。其次，可以將高通特性整合在前端最前的第一階段中。這將避免差分dc電流(來自隧道效應或來自流經聚合酶的電流)使前端信號路徑過載。換言之，這將避免信號由于“寄生的”dc電流而被推到測量范圍的極限。來自需要檢測的堿基的電流變化，將經由高通傳輸并在電子信號鏈中處理。
[0113]
各個實施方案的方法還包括測序rna。可以使用逆轉錄酶(rt)酶在上游加工rna，以生成隨后可以使用固定的dna聚合酶來讀取的cdna?？蛇x地，可以將rt酶固定至表面，并且隨著rna序列的復制，通過rt酶的氧化還原修飾的dntp的摻入將用于確定原始rna模板。
[0114]
本文公開的過程、方法或算法可以傳遞給處理設備、控制器或計算機或由其實現，所述處理設備、控制器或計算機可包括任何現有的可編程電子控制單元或專用電子控制單元。類似地，可以將所述過程、方法或算法作為可由控制器或計算機執行的多種形式的數據和指令儲存，其包括但不限于永久地存儲在不可寫存儲介質(諸如rom設備)上的信息，以及可變地存儲在可寫存儲介質(例如軟盤、磁帶、cd、ram設備以及其他磁性和光學介質)上的信息。所述過程、方法或算法也可以在可執行軟件對象中實現?？蛇x地，可以使用適當的硬件組件(例如專用集成電路(asic)、現場可編程門陣列(fpga)、狀態機、控制器或其他硬件組件或裝置)或硬件、軟件和固件組件的組合，來全部或部分地實現所述過程、方法或算法。
[0115]
雖然上文描述了示例性實施方案，但是并沒有期望這些實施方案描述權利要求書所涵蓋的的所有可能形式。在說明書中使用的措辭是描述性的而非限制性的措辭，并且應理解在不脫離本公開的精神和范圍的情況下可以進行各種變化。如先前所描述，各個實施方案的特征可以被組合以形成可能未明確描述或舉例說明的本公開的進一步實施方案。盡管可以將各個實施方案描述為就一個或多個期望的特征而言，提供優點或優于其他實施方案或現有技術的實現方式，但是本領域普通技術人員認識到可以折衷一個或多個特征或特點，來實現期望的整體系統屬性，這取決于特定的應用和實現。這些屬性可以包括但不限于成本、強度、耐用性、生命周期成本、可銷售性、外觀、包裝、尺寸、可維修性、重量、可制造性、易于組裝等。因此，就一個或多個特征而言，在所描述的任何實施方案不如其他實施方案或現有技術的實現方式理想的程度上，這些實施方案并沒有在本公開的范圍以外，并且對于特定應用而言會是理想的。