用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的生物標志物的應用

1.本發明涉及一種用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的生物標志物的應用。


背景技術：

2.癌癥，是威脅人類健康的第二大殺手，全球每年有上百萬人死于癌癥。目前臨床上治療癌癥主要以化療為主。正確合理地應用抗腫瘤藥物是提高腫瘤患者生存率和生活質量，降低死亡風險、復發率和藥物不良發生率的重要手段，也是腫瘤綜合治療的重要組成部分，大部分抗腫瘤藥物都具有明顯毒副作用，可給人體造成傷害，對抗腫瘤藥物的應用要謹慎合理。
3.患者個體對上述抗腫瘤藥物的治療效果在使用前是未知的，目前在臨床上，醫生通常會開出產生對于治療疾病可能為最高成功率的第一線藥物治療，若第一治療無效，則開出替代的藥物治療。第一線藥物的成功率的預測尤為重要，因為第一治療通常是最重要的并提供成功治療的最佳時間，而且第一線藥物選擇失敗會對患者個體帶來嚴重的身心傷害。因此，如何提高針對患者個體的最有效的初始藥物的選擇成功率為迫切需要解決的問題。
4.hrd是腫瘤組織的一個常見特征，目前正廣泛受到臨床關注，因其與dna交聯劑(如鉑類藥物)以及聚 adp核糖聚合酶抑制劑(poly adp
?
ribose polymerase inhibitors,parpi)的敏感性有關。parp抑制劑的作用機理是基于dna修復損傷機制，通過抑制dna修復蛋白結合，并使parp從dna缺口處解離，阻斷后續的單鏈dna修復過程。parp抑制劑是第一種成功利用合成致死概念獲得批準在臨床使用的抗癌藥物。在細胞內，如果parp功能被抑制就會導致dna單鏈斷裂的積累，進而會導致dna雙鏈斷裂。而如果細胞發生brca1/2基因突變或hrr通路其他基因突變，就會引起hrd，從而誘導腫瘤細胞凋亡。從作用機理而言，有同源重組缺陷(hrd)的腫瘤細胞對鉑類藥物或parp抑制劑更敏感，如奧拉帕利。
5.由于目前hrd的檢測費用太高，很多病人無法承擔。另外，目前也有許多沒有明顯hrd的患者對鉑類藥物或parp抑制劑治療也有很好的藥敏性。因此，有必要尋找新的可以預測腫瘤患者對鉑類藥物或parp 抑制劑的藥敏性的方法。


技術實現要素：

6.本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的生物標志物的應用。
7.本發明的第一方面，提供一種用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的生物標志物的應用，所述生物標志物為第一基因集或第一基因集中的一種或多種基因所構成的子集或第一基因集的表達產物或第一基因集中的一種或多種基因所構成的子集的表達產物；
8.所述第一基因集為第二基因集、第三基因集、第四基因集、第五基因集、第六基因集、第七基因集、第八基因集、第九基因集、第十基因集、第十一基因集所構成的合集；
9.第二基因集為以下基因構成：c1qbp、tsr1、eif5a、ywhae、senp3、nup88、rnmtl1、eif4a1、timm22、 pelp1、eif5al1、dhx33、gemin4、prpf8、psmb6、ctdnep1、wrap53、mybbp1a、pfn1、rpa1、pfas、 med11、sco1、glod4、slc25a11、dvl2、derl2、elp5、phf23、cntrob、smg6、pafah1b1、mettl16、 trappc1、vps53、c17orf85、cluh、smyd4、rnf167、neurl4、mis12、med31、rabep1、pitpna、spag7、 aurkb、crk、ube2g1、zzef1、rpain、txndc17、dph1、ankfy1、emc6、kiaa0753、fxr2、inpp5k、c17orf59、 mink1、camta2、mpdu1、wdr81、polr2a、itgae、sgsm2、stx8、ndel1、znf232、cyb5d1、arrb2、 pld2、cyb5d2、acadvl、ctns、tmem107、lsmd1、ctc1、rnasek、tax1bp3、fam57a、b9d1、c17orf97；
10.第三基因集為以下基因構成：c1qbp、eif5a、tsr1、senp3、eif4a1、rnmtl1、nup88、timm22、eif5al1、 gemin4、pelp1、psmb6、dhx33、ywhae、prpf8、wrap53、ctdnep1、pfn1、sco1、mybbp1a、pfas、 rpa1、glod4、med11、derl2、phf23、pafah1b1、elac2、elp5、slc25a11、trappc1、cntrob、dvl2、mettl16、smg6、cluh、med31、smyd4、c17orf85、rnf167、vps53、mis12、spag7、pitpna、rabep1、 emc6、aurkb、neurl4、dph1、ube2g1、txndc17、crk、zzef1、rpain、kiaa0753、fxr2、mpdu1、 ankfy1、itgae、wdr81、inpp5k、c17orf59、mink1、camta2、polr2a、stx8、ndel1、cyb5d1、sgsm2、 ctns、lsmd1、tax1bp3、acadvl、znf232、cyb5d2、pld2、arrb2、tmem107、rnasek、ctc1、fam57a、 c17orf97；
11.第四基因集為以下基因構成：c1qbp、tsr1、eif5a、senp3、eif4a1、rnmtl1、nup88、timm22、pelp1、 eif5al1、ywhae、dhx33、prpf8、gemin4、psmb6、wrap53、ctdnep1、pfn1、sco1、rpa1、glod4、 mybbp1a、pfas、derl2、med11、cntrob、pafah1b1、trappc1、slc25a11、phf23、smyd4、dvl2、 elp5、elac2、c17orf85、smg6、mettl16、cluh、vps53、rnf167、spag7、mis12、med31、pitpna、 rabep1、neurl4、aurkb、dph1、ube2g1、crk、txndc17、emc6、zzef1、rpain、kiaa0753、fxr2、 ankfy1、mink1、mpdu1、c17orf59、inpp5k、camta2、cox10、itgae、wdr81、ndel1、stx8、polr2a、 sgsm2、cyb5d1、acadvl、lsmd1、pld2、cyb5d2、arrb2、ctns、tax1bp3、tmem107、znf232、rnasek、 ctc1、sat2、fam57a、c17orf97；
12.第五基因集為以下基因構成：c1qbp、tsr1、eif5a、senp3、eif4a1、nup88、rnmtl1、timm22、pelp1、 eif5al1、dhx33、gemin4、psmb6、ywhae、ctdnep1、prpf8、wrap53、pfn1、sco1、rpa1、glod4、 mybbp1a、derl2、pfas、med11、cntrob、trappc1、pafah1b1、elp5、dvl2、slc25a11、phf23、smyd4、 smg6、c17orf85、elac2、mettl16、cluh、rnf167、mis12、spag7、vps53、med31、neurl4、pitpna、 rabep1、aurkb、dph1、txndc17、ube2g1、zzef1、rpain、crk、emc6、fxr2、kiaa0753、ankfy1、 mink1、mpdu1、camta2、c17orf59、inpp5k、itgae、cox10、stx8、wdr81、ndel1、polr2a、sgsm2、 lsmd1、cyb5d1、tmem107、arrb2、acadvl、cyb5d2、pld2、znf232、tax1bp3、ctns、rnasek、ctc1、 srr、fam57a；
13.第六基因集為以下基因構成：c1qbp、tsr1、eif5a、senp3、ywhae、nup88、rnmtl1、eif4a1、timm22、 pelp1、eif5al1、gemin4、dhx33、prpf8、psmb6、ctdnep1、wrap53、mybbp1a、pfn1、rpa1、pfas、 med11、sco1、glod4、slc25a11、dvl2、derl2、elp5、cntrob、phf23、smg6、pafah1b1、mettl16、 trappc1、vps53、c17orf85、smyd4、cluh、neurl4、rnf167、mis12、med31、rabep1、pitpna、spag7、 aurkb、crk、ube2g1、zzef1、rpain、txndc17、dph1、ankfy1、
emc6、kiaa0753、fxr2、inpp5k、c17orf59、 mink1、camta2、mpdu1、wdr81、itgae、polr2a、sgsm2、stx8、ndel1、znf232、cyb5d1、ctns、 arrb2、pld2、cyb5d2、acadvl、tmem107、lsmd1、ctc1、rnasek、tax1bp3、fam57a、c17orf97；
14.第七基因集為以下基因構成：khdrbs1、nup88、ywhae、hnrnpc、gemin4、rpa1、sfpq、snrnp40、 eif4a1、ccdc181、dhx33、cbfb、ruvbl1、pcgf6、rnmtl1、nlgn1、ube2g1、taf5、c1qbp、mybbp1a、 col27a1、tsr1、dfna5、rqcd1、senp3、ilf2、vash2、rcor2、paqr9、mcmbp、nfatc3、cacybp、sco1、 lrfn5、lrrc8c、cct8、haus6、wrap53、tpst1、elac2、anp32e、pfas、s100a3、fam129c、pelp1、 ankle1、ncs1、scml1、mex3a、eif5a、hmx2、crk、cpsf6、nolc1、fxr2、nae1、or10g7、cep97、 mettl16、tmem39b、kpna6、npw、bub3、cenpv、cox10、ssx2ip、sema6b、xrcc5、prpf8、ppm1g、 zc3hc1、tmem206、p2rx5、pitpna、znf618、smarcd1、fxn、lsm12、hoxa10、rpain、c10orf2、ankfy1、 rpf1、mpzl1、slitrk3、timm22、nudt21、kif21b、blmh、sh2b3、cep170、znf124、wscd1、pprc1、 sf3b3、cbx2、ebf1、zcchc18、thrap3、cutc、itpripl1、usp13、nrf1、rnps1、serbp1、rp1
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170o19.20、 prdx3、clmp、ptges3、tmpo、cnbp、usp10、nlgn2、asgr1、bcat1、kdelc1、skp2、klhl33、rrp1b、 fsd1l、itgae、cops3、cdc123、usp31、kiaa0020、snrpf、tert、cmtm3、fscn1、gins3、plk1、rfwd3、 tcp1、dnm1、pfdn2、mrpl42、podxl、lect2、c2orf44、or4e2、smndc1、scly、parp1、il27ra、usp22、 qtrtd1、snrpd1、elavl1、nsmce4a、sf3a3、dusp9、ccdc50、hnrnpd、nr0b1、tdg、sardh、vps53、 prr3、pgd、add2、ube2i、fbrsl1、rabep1、pfn1、hnrnpk、stoml2、rbmx、kars、aass；
15.第八基因集為以下基因構成：ywhae、hnrnpc、nup88、gemin4、aurkb、eif4a1、c1qbp、anp32e、 wrap53、rpa1、rpl22l1、slfn11、hnrnpa1、kif14、khdrbs1、serbp1、ube2g1、snrnp40、tsr1、cwc22、 heatr1、dhx33、caprin1、rnmtl1、ssrp1、pfas、hmga1、kif18a、haus6、derl2、ndc80、echdc1、nap1l1、mybbp1a、pelp1、psip1、kif20b、hnrnpu、or4e2、wdr43、cdc27、stoml2、fam57a、ppp1cc、 exosc3、kif11、kiaa0753、fscn1、eif5a、ahctf1、seh1l、ccdc138、xrcc5、nae1、odc1、polr1e、 slc16a1、blmh、nuf2、npm1、cox10、stag1、rpf1、cct4、nup37、dse、pcolce2、lbr、rbmx、 melk、map4k4、tmem39b、smc3、tmpo、pcgf6、c17orf85、rpl6、srsf3、ruvbl1、hoxa2、ilf3、 arhgap11a、soga2、hnrnpk、senp3、triml2、ect2、exosc9、thrap3、mettl16、skp2、taf1a、dfna5、 ncl、fam60a、crlf3、mcmbp、elp5、kif15、tra2b、elac2、thoc1、ncapd2、e2f7、nup133、cep170、 ttc27、fxr1、podxl、hjurp、elk3、saal1、adprm、cdc20、htr7、snrpf、taf5、rfc5、smchd1、 hmga2、exosc8、sco1、nudt21、arhgap19、emc6、kdm1a、fancg、cad、elavl1、sacs、tubb6、 metap2、nras、kiaa1524、nob1、pfn1、prpf8、cenpf、ncapg、cacybp、usp13、wdr75、hdac2、 bub1、ptbp1、tmem206、lmnb1、snx5、syncrip、nedd1、hspd1、riok1、aspm、xrn2、arntl2、 ran、nrbp1、or6k6、hmgb1、rbbp8、ywhaq、axl、snrpd1、hnrnpr、gins3、timm22、smarcd1、 hnrnpd、aass、hoxd10、psmb6、rpp30、tyms、bcat1、ttk、srpk1、knstrn、cops3、ada、gcfc2、 tomm20、smu1、myl6b、ssx2ip、tprkb、noc3l、pafah1b1、anp32b、senp1、col27a1、cep55、cdca3、 fez2、orc2、cenpa、prim2、kiaa0020、ckap4、apba2、pnpt1、ckap5、taf1b、ola1、polr2a、mrpl19、 mrpl42、ncs1、itgae、slc25a3、yars2、ppm1g、nop58、nop56、tcf3、ctdnep1、cks1b、g3bp1、 b3galnt2、dcaf15、mms22l、col13a1、gmps、tmem107、utp20、ppp1r8、lmnb2、fbxo5、gabpb1、 agpat5、kiaa0101、lyar、bag2、dimt1、dhx57、ilf2、rps6、dnmt1、igfbp6、smc4、bub1b、sfpq、 bud13、nlrp1、
slc17a9、mpzl2、saysd1、ankrd22、hist1h1t、s100a9、aim1l、cyp4f12、hvcn1、soga2、golga5、 cpne8、erp27、agfg2、bpifb1、bpifb2、ceacam6、dusp23、eps15、glb1、gpr19、myh14、or51i2、 orc2、papolb、rab25、rfc5、selenbp1、slc22a5、slurp1、tnfrsf21、fxr2、prpf8、cad、cbfb、fmo5、 pde4dip、pms1、sp6、aurkb、daam1、dnajb2、dock8、e2f7、elac2、fbxo32、fut3、krt7、nfatc3、 nkx2
?
5、pi3、qrfpr、sdr16c5、tmem45b、sema6b、tgm3、pcolce、pnkd、a2m、asip、card14、dusp16、 exosc9、fam83a、gpr162、hm13、hrct1、kctd17、lrriq1、mal2、myo1d、pcdh1、spg7、xrcc5、 znf276、znf577、hist1h4h、il36rn、nagk、phf23、or10h2、tcerg1、klhdc4、ptk2b、zdhhc24、prdx3、 tns4、macc1、krt16、tmed3、stmnd1、pax2、grhl1、pex7、dbn1、efemp1、safb、pcdhga8、ceacam1、 chmp7、riok3；
17.第十基因集為以下基因構成：slfn11、hnrnpc、mybbp1a、rpl22l1、ube2g1、eif4a1、nup88、gemin4、 pelp1、c1qbp、pfas、lrrc8c、elp5、sco1、col27a1、ywhae、rnmtl1、dhx33、nap1l1、wrap53、 exosc9、kctd17、eif5a、fez2、serbp1、pfn1、itgae、abi2、adc、axl、wdr75、apba2、tsr1、mrpl19、 tgfb1、anxa2、sacs、cox10、pcolce2、tp53、adarb1、npm1、itprip、b3galnt2、znf618、c17orf85、 snrnp40、hoxd9、fxr2、heatr1、mltk、kiaa0020、pcolce、ncl、odc1、gins3、gpx8、csgalnact1、 il27ra、fscn1、fxn、p2rx5、igfbp6、nlgn2、adcy7、senp3、ube2e3、derl2、nob1、timm22、psmb6、 rps2、notch1、hjurp、ilf2、cct4、polr2a、emc6、znf469、tyw3、ptma、eef1b2、nrbp1、aass、 rp1
?
170o19.20、rpa1、kifc3、elac2、rpf1、psip1、eif5al1、anxa1、lamc1、aurkb、pcgf6、stx8、 soga2、cbfb、psat1、thoc1、gfpt2、phf23、slfn13、foxf2、tyms、cercam、or4e2、akr1b1、xrcc5、 galnt14、adprm、tubb6、fndc8、s100a2、cep170、cct8、cyp26b1、metap1、hoxa2、snrpf、nlrp1、 mettl16、rpl26、bax、rpl12、cep128、asb1、bag2、rps6、ccdc181、nop58、hnrnpa1、kiaa0753、 fosl1、blmh、rcl1、hspd1、mocos、cops7b、pgam1、syde1、sphk1、anxa10、pkd2、spag7、dock10、 cacybp、cwc22、suclg2、fmnl1、orc2、snrpd1、ssx2ip、fermt1、usb1、prmt1、foxl1、taf1b、 col18a1、mff、pappa、ahctf1、prdx6、med11、kif20b、mier1、htr7、nav3、tert、socs2、smarcd3、 cad、taf1a、rbm43、llgl1、f2r、noc3l、ckap4、ctdnep1、cps1、kif14、scly、abcf2、prpf8、kcng1、 dmrt2、pxdn、flt1、dtwd1、anp32e、rab34、prrx1、dhx30、npm3、polr1e、elk3、focad、mapk12、 ywhaq、ttc27、cpne8、ccdc102a、hnrnpu、ccl21、r3hdm1、rps27l、tax1bp3、acadvl、ppm1m、 smox、kiaa0101、ikbip、slfn12、mlkl、shmt1、cops3、pfkp、znf286b、gcfc2、mcl1、slc4a7、triml2、 socs3、uhrf2、cacng6、slfn12l、znf286a、irf2、thap4、six1、b3gntl1、smchd1、crk、mat2b、 gli2、otud4、uck2、nphp1、crlf3、mettl17、cdc20、memo1、tma16、kif7、rpl3、apobec3h、snrpg、 mrc2、c20orf27、helb、utp20、apobec3c、elfn1、rrp1b、begain、epha2、wdr43、arrb2、rin1、 prkcdbp、e2f7、prkd3、ptpn14、rps9、gldc、rpl17、supt16h、fam131c、eif4e2、rnf145、eif3a、 chsy1、eya4、bzw1、agpat4、nkx2
?
5、ddx31、thrap3、tmem206、ldhb、pon2、pip5k1a、ppm1g、 stoml2、hoxa10、fam189b、slc25a3、grpel1、mt2a、haus6、rqcd1、nolc1、col13a1、anp32b、 akap7、fam57a、c12orf10、ercc3、g3bp1、exoc6b、yars2、twf1、dfna5、neil2、cdc123、gtpbp4、 amotl2、nfkb2、hoxd8、gid4、fam101b、il18r1、lsm6、pemt、shc1、ncor1、rpsa、snx5、slc39a10、 desi2、adam17、parp1、dio2、rab7l1、alkbh5、dpy19l1、ifit5、ccdc74b、slc12a4、enpp7、hoxd13、 sfpq、ssfa2、ac007040.11、kif1c、fam50b、nasp、pfdn2、hoxd10、kiaa1432、lphn2、csnk2a2、rcor2、sfxn1、serpind1、actr2、reck、cct7、
prpf4、kri1、rp11
?
303e16.8、clspn、hells、fhl3、bnc2、gpc1、tubb6、ptrf、c3orf72、rps2、ogfod1、 ipo5、prnp、nfe4、slirp、fam189b、nt5dc2、eif5a2、rcc1、zfp64、zc3hc1、adsl、ifrd2、mapk12、 atp8b2、cachd1、rmdn2、hnrnpr、pnpt1、hnrnpk、kbtbd6、znf483、rhebl1、mad2l2、urb2、 crk、usp1、tex10、cdca2、chac2、reep2、mettl12、khsrp、gpatch4、slc41a1、elavl1、fance、 lrfn5、nuak1、mpst、tubb、ccdc102a、lurap1、c12orf10、hspe1、hoxc8、st3gal2、qrfpr、actb、 ankrd13b、socs3、psip1、kif14、ccdc8、eif3a、larp6、bms1、apex1、trpv2、qars、med31、gdf11、 ewsr1、hprt1、kif20b、hoxc5、prr3、anks6、nup93、mt1a、kynu、twf2、ccdc50、fxr1、naca、 vcam1、adm5、eif2b3、sec14l4、spata5l1、hbe1、hspa4l、map2k4、susd5、srm、hapln3、sfxn1、ski、slc38a5、trim62、itgae、msn、ddx31、samd1、rp11
?
169k16.7、hoxa3、snrpg、rpsa、chst12、 bap1、flt1、fgfr1、relb、noc2l、isl2、rpl14、hoxa1、apobec3c、rsl1d1、higd1b、srsf3、echs1、 rpf2、mthfd1、usp11、asmtl、ppp1cc、rab31、rabep1、rpp30、slc35b4、heatr2、tuba1c、bbip1、 ip6k1、osbpl6、cops2、trim16、rhoa、polr1a、smarcc1、tmem206、tead4、cpne7、dph2、hmx3、 per1、hoxa4、klhl21、prmt5、ttyh2、s1pr3、farsa、thoc6、alas1、wars2、cdkl1、pfdn2、csdc2、 ifltd1；
19.所述特定抗腫瘤藥物為順鉑和/或一種或多種parp抑制劑。
20.所述生物標志物為第十二基因集或第十二基因集中的一種或多種基因所構成的子集或第十二基因集的表達產物或第十二基因集中的一種或多種基因所構成的子集的表達產物；
21.所述第十二基因集為以下基因構成：mybbp1a、ube2g1、eif4a1、nup88、gemin4、pelp1、c1qbp、 pfas、sco1、ywhae、rnmtl1、dhx33、wrap53、tsr1、fxr2、timm22、rpa1、mettl16、prpf8、crk、 ankfy1。
22.所述生物標志物為第十三基因集或第十三基因集中的一種或多種基因所構成的子集或第十三基因集的表達產物或第十三基因集中的一種或多種基因所構成的子集的表達產物；
23.所述第十三基因集為以下基因構成：pelp1、mybbp1a、tsr1、dhx33、gemin4、wrap53、c1qbp和 nup88。
24.所述生物標志物為第十三基因集或第十三基因集的表達產物。
25.本發明提供的第二方面，提供一種預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的方法，包括以下步驟：
26.獲得來自受試者的包含癌細胞的生物學樣品；
27.檢測來自受試者的包含癌細胞的生物學樣品中如上述的生物標志物的表達水平；
28.所述生物標志物的整體表達水平升高，指示腫瘤患者對特定腫瘤藥物的敏感性為高敏感性的可能性升高；
29.所述特定抗腫瘤藥物為順鉑和/或一種或多種parp抑制劑。
30.進一步地，檢測基因表達水平的方法具體采用基因芯片、pcr、免疫組織化學、elisa中的一種或多種組合。
31.進一步地，還包括以下步驟：檢測hr狀態。
32.本發明提供的第三方面，提供檢測如上述的生物標志物的表達水平的試劑在制備用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的試劑中的應用,所述特定抗腫瘤藥物為順
鉑和/或一種或多種parp抑制劑。
33.本發明提供的第四方面，提供一種用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的生物芯片，其上設有用于檢測如上述的生物標志物的表達水平的探針或探針陣列,所述特定抗腫瘤藥物為順鉑和/或一種或多種parp抑制劑。
34.本發明提供的第五方面，提供一種用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的試劑盒，其中包含有用于能特異性擴增如上述的生物標志物的pcr引物,所述特定抗腫瘤藥物為順鉑和/或一種或多種parp 抑制劑。
35.本發明提供的第六方面，提供一種癌癥的細胞模型，所述細胞模型中包含如上述的生物標志物，且細胞模型分為生物標志物的整體表達水平高于閾值的高表達組和生物標志物的整體表達水平低于閾值的低表達組。
36.一種篩選癌癥藥物的方法，包括以下步驟：
37.(1)建立如上述的癌癥的細胞模型；
38.(2)用待篩選藥物作用于步驟(1)所建立的細胞模型；
39.若待篩選藥物作用后高表達組相比低表達組死亡率高，則為目標藥物。
40.一種預測腫瘤患者對如上述的篩選癌癥藥物的方法所篩選的目標藥物的敏感性的方法，包括以下步驟：
41.獲得來自受試者的包含癌細胞的生物學樣品；
42.檢測來自受試者的包含癌細胞的生物學樣品的如上述的生物標志物的表達水平。
43.本發明一種用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的生物標志物的應用。通過檢測生物標志物的表達可以預測對順鉑和parp抑制劑的治療效果。
附圖說明
44.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，根據這些附圖獲得其他的附圖仍屬于本發明的范疇。
45.圖1為parp抑制劑/順鉑藥物細胞系敏感性數據的數據預處理；(a)為通過ccle和gdbc數據庫繪制的泛腫瘤細胞系中藥物敏感性(z
?
scaled ln(ic50))的分布(n＝478、493、485、444)；(b)為經過線性回歸去除組織特異性效應后的泛腫瘤細胞系藥物敏感性(z
?
scaled ln(ic50))分布(n＝478、493、485、 444)；(c)為vst轉化后的代表性基因的基礎表達水平在泛癌細胞系中的分布；(d)vst轉化的代表性基因基礎表達水平經過線性回歸去除組織特異性效應后泛癌細胞系的分布。
46.圖2中，(a)為造血細胞系和非造血細胞系藥物敏感性的比較(n＝478,493,485,444)；(b)為線性回歸去除組織特異性(實現不同組織得的細胞系之間的可比性)后的造血細胞系和非造血細胞系藥物敏感性的比較(n＝478,493,485,444)。
47.圖3為通過wgcna算法對來自gdbc的多種dna損傷劑作用機制的分類。
48.圖4為根據ccle細胞系數據庫計算出的每種藥物的相應共表達基因模塊；具體地，(a)olaparib
?
1， (b)rucaparib，(c)talazoparib，(d)順鉑，(e)olaparib；此處及以下附圖說明中，olaparib
?
1和olaparib 分別來自指代gdbc兩個不同研究中心分別對olaparib進
行檢測的實驗結果。
49.圖5為根據coexpedia建立的人類基因共表達網絡計算出的每種藥物的相應共表達基因模塊；具體地， (a)olaparib，(b)olaparib
?
1，(c)rucaparib，(d)talazoparib，(e)順鉑。
50.圖6為z變換后的olaparib藥物敏感性數據與基因表達水平的皮爾遜相關值分布。
51.圖7為基于藥物敏感性
?
基因表達相關值進行gsea富集分析得到的kegg通路(a)olaparib
?
1，(b) rucaparib，(c)talazoparib，(d)順鉑，(e)olaparib。
52.圖8中，(a)多種腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的順鉑lnic
50
值比較；(b)多種腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的rucaparib的lnic
50
值比較。
53.圖9中，(a)多種腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的olaparib的lnic
50
值比較；(b) 多種腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的talazoparib的lnic
50
值比較；p值是用單邊t檢驗計算的。
54.圖10中，(a)卵巢腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的順鉑、olaparib、rucaparib、 talazoparib的lnic
50
值比較(上圖)、hr功能正常的卵巢腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的順鉑、olaparib、rucaparib、talazoparib的lnic
50
值比較(下圖)；(b)乳腺腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的順鉑、olaparib、rucaparib、talazoparib的lnic
50
值比較(上圖)、hr功能正常的乳腺腫瘤細胞系根據基因集整體表達水平分組后對應的順鉑、olaparib、rucaparib、talazoparib的lnic
50
值比較(下圖)；p值是用單邊t檢驗計算的。
55.圖11為將hr功能正常的細胞系通過qpcr檢測8個基因的表達水平，將它們分為高表達和低表達細胞系，并比較它們對parp抑制劑以及順鉑的藥物敏感性；(a)qpcr結果將所有腫瘤細胞系分為基因集高表達組和低表達組；(b)克隆形成實驗檢測目的細胞系對抑制劑/順鉑的敏感性；紅色標記：基因集表達低的細胞系；藍色標記：基因集表達高的細胞系。
56.圖12中，(a)parp抑制劑/順鉑誘導高表達組而非低表達組細胞系中npm從核仁向核質的易位；紅色標記：基因集表達低的細胞系；藍色標記：基因集表達高的細胞系；(b)atm抑制劑可有效阻止高表達組細胞系(bt549)的npm從核仁釋放到核質中，而atr和dna
?
pk抑制劑無此效果。
57.圖13為parp抑制劑/順鉑對第十三基因集高表達或低表達的細胞系處理后的免疫熒光染色結果；免疫熒光染色表明，parp抑制劑/順鉑對第十三基因集高表達或低表達的細胞系處理均可導致dna損傷：順鉑/parp抑制劑處理4小時后，出現了大量γh2ax foci；紅色：第十三基因集低表達的細胞系；藍色：第十三基因集高表達的細胞系。
58.圖14為具有高基因表達的細胞系經parp抑制劑/順鉑處理后核糖體蛋白的釋放；atm抑制劑可阻止 bt549細胞的核糖體蛋白(rpl10a和rpl26)(bt549)從核糖體上解離。
59.圖15為高表達組細胞系(即順鉑/parp抑制劑敏感細胞系)中，敲低rpl11使細胞對順鉑/parp抑制劑產生抗性。*用于指示shrpl11
?
1和ctrl之間的差異；#用來指示shrpl11
?
2和ctrl之間的差異。
60.圖16為western blot檢測細胞系中rpl11的敲低效果。
61.圖17為順鉑/parp抑制劑作用于rpl11敲低與否的第十三基因集高表達細胞系的
γh2ax和rad51的免疫熒光染色比較，表明rpl11敲低對順鉑/parp抑制劑造成的第十三基因集高表達的細胞系中的dna雙鏈損傷和hr修復均無影響。
62.圖18為dna修復試驗結果，表明rpl11敲低對順鉑/parp抑制劑處理后的第十三基因集高表達的細胞系的hr效率沒有影響。
63.圖19為rpl11敲低對順鉑/parp抑制劑處理后低表達組細胞系的細胞存活的影響。
64.圖20中，(a)第十三基因集的八個基因的敲低效率；(b)免疫熒光染色表明第十三基因集的八個基因的敲低只在具有第十三基因集高表達的細胞系中誘導核糖體應激；(c)集落形成試驗表明，敲低第十三基因集后，具有第十三基因集高表達的細胞被賦予對parp抑制劑/順鉑的抗性；紅色：第十三基因集低表達的細胞系；藍色：第十三基因集高表達的細胞系。
65.圖21為通過第十三基因集和hr狀態的聯合檢測對parp抑制劑或順鉑的藥敏性預測；(a)總體生存分析表明通過第十三基因集和hr狀態的聯合檢測可以將tcga順鉑治療的患者分為4組(n＝84)；(b)通過基于hr狀態的單變量cox回歸對第十三基因集低表達的tcga順鉑治療患者進行整體生存率分析(危險比＝4.082；95％ci 1.529
?
10.9；p＝0.0026；n＝42)；(c)通過基于hr狀態的單變量cox回歸對第十三基因集低表達的tcga順鉑治療的患者的無進展生存分析(危險比＝2.031；95％ci 0.9434
?
4.373；p＝0.065；n＝42)； (d)通過基于hr狀態的單變量cox回歸對第十三基因集低表達的tcga順鉑治療患者無病生存分析(危險比＝6.551；95％ci 1.813
?
23.67；p＝0.001；n＝24)；(e)用置換試驗比較前述基因集與隨機選擇的8基因序列對hr正?；颊呖傮w生存的預測效果(p＝0.004)；(f)用置換試驗比較前述基因集與隨機選擇的8 基因序列對hr正?；颊邿o進展生存的預測效果(p＝0.006)；(g)用置換試驗比較前述基因集與隨機選擇的8基因序列對hr正?；颊邿o病生存的預測效果(p＝0.024)；(h)通過基于第十三基因集總體表達的單變量cox回歸對來自hennessy隊列的順鉑治療病人的總體生存分析(危險比＝4.39；95％ci 1.238
?
15.56； p＝0.013；n＝21)和(i)無進展生存分析(危險比＝3.815；95％ci 1.216
?
11.97；p＝0.012；n＝20)(該隊列病人沒有提供hr狀態信息)。
66.圖22為(a)tcga中進行順鉑治療的hr正?；颊叩幕诘谑蚣膯我蛩豤ox回歸總體生存分析(危險比＝5.54；95％ci 1.16
?
26.43；p＝0.018；n＝21)；(b)tcga中用順鉑治療的hr正?；颊叩幕诘谑蚣膯我蛩豤ox回歸無進展區間期分析(危險比＝3.412；95％ci 1.104
?
10.55；p＝0.026；n＝21)，p值以對數顯示；(c)tcga中用順鉑治療的hr正常患者的基于第十三基因集的單因素cox回歸無病間期分析(危險比＝6.143；95％ci 1.176
?
32.08；p＝0.016；n＝13)，p值以對數顯示；(d)第十三基因集和hr狀態的聯合檢測預測來自bcape的乳腺癌患者源性腫瘤細胞(pdtcs)對parp抑制劑的體外藥敏反應；虛線上方的值表示pdtcs對parp抑制劑敏感；虛線下方的值表示對pdtcs對parp抑制劑有抗性；圓形：第十三基因集表達預測敏感；三角形：第十三基因集表達預測耐藥；紅色表示分類偏差的pdtcs，藍色表示具有藥物特異性耐藥機制的pdtcs，綠色表示通過hr狀態校正的pdtc分類；(e
?
g)第十三基因集和hr狀態的聯合檢測bcape在3個獨立驗證中預測了對乳腺癌pdx模型中parp抑制劑的體內藥敏反應；(h) 第十三基因集預測卵巢pdx模型中對parp抑制劑的體內藥敏反應；(i)先通過第十三基因集檢測篩選，然后進一步通過hr狀態檢測篩選的流程示意圖。
67.圖23為在parp抑制劑/順鉑治療期間，atm通過平衡控制hr修復和核糖體應激兩條途徑對細胞命運的影響，(a
?
b)atm抑制劑(ku)對parp抑制劑/順鉑誘導的核糖體應激的影響；(c)atm抑制劑對第十三基因集低表達的細胞系中細胞hr功能的影響；(d)atm抑制劑對第十三基因集高表達的細胞系中細胞 hr功能的影響；(e
?
f)atm抑制劑對parp抑制劑/順鉑藥物敏感性的影響；(g)確定parp抑制劑/順鉑治療期間細胞命運的新模型；紅色：第十三基因集表達低的細胞系；藍色：第十三基因集高表達的細胞系。
.具體實施方式
68.為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步地詳細描述。
69.除非另外定義，本文所用的技術和科學術語具有本發明所述領域普通技術人員所通常理解的相同含義。
70.藥物遺傳學/基因組學是對參與個體對外來化合物或藥物的應答的遺傳因子/基因組因子的研究。可將對本發明的標志物的表達具有刺激作用或抑制作用的試劑或調節劑施用于個體以在患者中(預防性或治療性)治療癌癥。理想地是還將個體的藥物基因組學與所述治療聯合考慮。治療的代謝的差異通過改變藥理活性藥物的劑量和血液濃度之間的關系可能導致嚴重的毒性或治療失敗。因此，了解個體的藥物基因組學允許選擇對于預防性治療或治療性治療有效的試劑(例如，藥物)。所述藥物基因組學還可用來確定適當的劑量和治療方案。因此，可在個體中確定本發明的標志物的表達水平，從而選擇適于個體的治療性治療或預防性治療的試劑。
71.當生物標志物在個體中指示異常進程、疾病或其他病癥或作為異常進程、疾病或其他病癥的標志時，該生物標志物與在個體中指示正常進程、無疾病或其他病癥或作為正常進程、無疾病或其他病癥的標志的生物標志物的表達水平或值相比較，通常被描述為過表達的或低表達的。“上調”、“上調的”、“高表達”、“高表達的”和其任何變化形式互換地用來指大于在健康或正常個體中通常檢測到的生物標志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標志物的值或水平。該術語還可指大于在特定疾病的不同階段可檢測到的生物標志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標志物的值或水平。
[0072]“下調”、“下調的”、“低表達”、“低表達的”和其任何變化形式互換地用來指小于在健康或正常個體中通常檢測到的生物標志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標志物的值或水平。該術語還可指小于在特定疾病的不同階段可檢測到的生物標志物的值或水平(或值或水平的范圍)的生物樣品中的生物標志物的值或水平。
[0073]
在本文中，“高表達”、“高表達的”、“低表達”、“低表達的”為相對于“閾值”的表達，高于“閾值”的為“高表達”、“高表達的”，低于閾值的為低表達”、“低表達的”。一種方式，“閾值”可以基于患者數據集獲得，所分析的患者數據集是源自于已經通過特定抗腫瘤藥物治療最終為有效/無效的癌癥患者的腫瘤細胞組織樣品，根據癌癥患者的腫瘤細胞組織樣品得到的表達譜計算相應的整體表達水平，統計分析確定“閾值”,“閾值”為區分通過特定抗腫瘤藥物治療有效/無效的的最優統計值或較優統計值；另一種方式，“閾值”可以基于患者數據集獲得，所分析的患者數據集源自于已經通過特定抗腫瘤藥物治療最終為有效 /無效的癌癥患者的腫瘤細胞組織樣品，并且剔除hr檢測為缺陷的樣品，統計分析確定“閾值”,
“
閾值”為區分通過特定抗腫瘤藥物治療有效/無效的的最優統計值或較優統計值。
[0074]
如本文所用的，癌癥包括但不限于，白血病、腦癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉癌、乳癌、皮膚癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、內分泌系統癌、子宮內膜癌、食管癌、神經膠質瘤、淋巴瘤、神經母細胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂體腫瘤、腎癌等。
[0075]
本發明涉及用于預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的生物標志物的應用，其特征在于：所述生物標志物為第一基因集或第一基因集中的一種或多種基因所構成的子集或第一基因集的表達產物或第一基因集中的一種或多種基因所構成的子集的表達產物；
[0076]
所述第一基因集為第二基因集、第三基因集、第四基因集、第五基因集、第六基因集、第七基因集、第八基因集、第九基因集、第十基因集、第十一基因集所構成的合集。
[0077]
第二基因集、第三基因集、第四基因集、第五基因集、第六基因集的基因為如表1所列基因構成，是對每個藥物(順鉑和多種parp抑制劑)通過wgcna算法獲得的與藥敏性最負相關的共表達基因子網絡。第七基因集、第八基因集、第九基因集、第十基因集、第十一基因集分別如表2
?
6所列基因構成，是對每個藥物(順鉑和多種parp抑制劑)通過計算基因表達水平與藥敏性的皮爾遜相關性，得到的與藥敏性最負相關的表達基因。
[0078]
所述特定抗腫瘤藥物為順鉑和/或一種或多種parp抑制劑。
[0079]
優選地，所述生物標志物為第十二基因集或第十二基因集中的一種或多種基因所構成的子集或第十二基因集的表達產物或第十二基因集中的一種或多種基因所構成的子集的表達產物；
[0080]
所述第十二基因集為以下基因構成：mybbp1a(geneid:10514)、ube2g1(geneid:7326)、eif4a1(geneid: 1973)、nup88(geneid:4927)、gemin4(geneid:50628)、pelp1(geneid:27043)、c1qbp(geneid:708)、 pfas(geneid:5198)、sco1(geneid:6341)、ywhae(geneid:7531)、rnmtl1(also known as mrm3)(geneid: 55178)、dhx33(geneid:56919)、wrap53(geneid:55135)、tsr1(geneid:55720)、fxr2(geneid:9513)、 timm22(geneid:29928)、rpa1(geneid:6117)、mettl16(geneid:79066)、prpf8(geneid:10594)、 crk(geneid:1398)、ankfy1(geneid:51479)。所述第十二基因集為通過對第二基因集、第三基因集、第四基因集、第五基因集、第六基因集、第七基因集、第八基因集、第九基因集、第十基因集、第十一基因集進行交集獲得。
[0081]
優選地，所述生物標志物為第十三基因集或第十三基因集中的一種或多種基因所構成的子集或第十三基因集的表達產物或第十三基因集中的一種或多種基因所構成的子集的表達產物；
[0082]
所述第十三基因集為以下基因構成：pelp1、mybbp1a、tsr1、dhx33、gemin4、wrap53、c1qbp和 nup88。所述第十三基因集為對第十二基因集進一步篩選得到的，在一些實施例中，對第十三基因集進行進一步驗證，確定第十三基因集用于預測腫瘤對順鉑和parp抑制劑的敏感性的準確率非常高。第一基因集中的每個基因都與第十三個基因集以及與特定抗腫瘤藥物的藥敏性數據具有較強的相關性，因此其中的一種或多種基因所構成的基因集可能具有與第十三基因集類似的藥敏性預測潛能。
[0083]
本發明還提供一種預測腫瘤患者對特定抗腫瘤藥物的敏感性的方法，包括以下步驟：
[0084]
獲得來自受試者的包含癌細胞的生物學樣品；
[0085]
檢測來自受試者的包含癌細胞的生物學樣品中如上述的生物標志物的表達水平；
[0086]
所述生物標志物的整體表達水平升高，指示腫瘤患者對特定腫瘤藥物的敏感性為高敏感性的可能性升高；
[0087]
所述特定抗腫瘤藥物為順鉑和/或一種或多種parp抑制劑。
[0088]
生物標志物的整體表達水平可以通過本領域技術人員可以獲知的所有的評估方法，在本發明的一些實施例中，具體采用pca評分量化第十三基因集。
[0089]
進一步地，本發明提出了將本發明提供的生物標志物與hr狀態的聯合檢測的方法，本發明提供的生物標志物的檢測可以與臨床hr狀態檢測兼容，具有更廣泛的臨床應用潛力，hr狀態的檢測相關步驟可以為目前已知的所有hr狀態檢測方法，包括cosmic mutation signature 3，hr score，hr相關基因突變情況檢測等。由于本發明提供的生物標志物測試比hr測試更便宜省時，所以先檢查本發明提供的生物標志物會更快，更優成本效益。
[0090]
在上述大量的開創性研究的基礎上，本領域技術人員根據所屬技術領域所有的普通技術知識和常規實驗手段，可以直接得到以本發明提供的生物標志物作為檢測目標的診斷試劑(pcr引物和探針)及試劑盒、設有用于檢測相關基因集中的一種或多種基因的表達水平的探針或探針陣列的生物芯片以及其它常見的診斷產品。
[0091]
在上述大量的開創性研究的基礎上，本領域技術人員根據所屬技術領域所有的普通技術知識和常規實驗手段，可以直接得到以本發明提供的生物標志物為高表達的癌癥的細胞模型，通過細胞模型可以篩選出與順鉑和parp抑制劑同一藥物作用機制的抗腫瘤藥物(可以為目前已知的所有具有抗腫瘤藥效的藥物和未知的具有抗腫瘤藥效的新藥)，基于此方法可以擴展本發明藥敏性預測的所針對的藥物范圍。
[0092]
進一步的，該癌癥的細胞模型可以用于篩選癌癥藥物，通過與正常細胞的藥物作用后的細胞存活量的對比可以篩選出具有一定dna損傷作用的藥物。本發明所提出的癌癥的細胞模型可以為通過對相關基因集的表達水平的檢測篩選出的，也可以采用本領域技術人員所知曉的常規方法對細胞中相關基因集的表達水平的提高。
[0093]
實施例一、順鉑和所有parp抑制劑的共同作用機制
[0094]
為了研究dna損傷治療劑的不同作用機制，進行大數據分析。從癌癥藥物敏感性基因組學(gdsc) 中獲得人類癌細胞系的藥物敏感性數據(ln(ic50)，從癌癥細胞系百科全書(ccle)獲得細胞系rna
?
seq 數據，從rna
?
seq數據中僅選擇編碼基因。排除了無法識別的基因以及所有樣品的表達均為零的基因。對于具有多個記錄的基因，我們計算了其多個記錄的表達水平的總和作為其表達水平，用于隨后的加權相關網絡分析(wgcna)和pearson相關分析。在進行下游分析之前，對剩余基因的rnaseq數據通過deseq2 的方差穩定轉化(vst)函數進行vst轉化。使用基于組織來源以及癌癥亞型注釋(“ccle_primary_site”，“ccle_primary_hist”，“ccle_hist_subtype_1”)的線性回歸去除藥物敏感性數據和vst轉化的基因表達數據的組織特異性。然后將藥物敏感性數據進行z變換。
[0095]
隨機選擇10種dna損傷治療劑(順鉑(cisplatin)、奧拉帕尼(olaparib)、rucaparib、他唑帕尼 (talazoparib)、替莫唑胺(temozolomide)、依托泊苷(etoposide)、5
?
fu、jq12、絲裂霉素c(mitomycin
?
c)、博來霉素(bleomycin))。這些數據集中，有兩個關于
olaparib的數據集，分別來自于兩個研究中心(馬薩諸塞州總醫院和維康桑格研究所)。如圖1a，b所示，細胞系藥物敏感性形成了偏態分布，部分經vst轉化的基礎基因表達形成了雙峰分布(圖1c)，這可以歸因于來源組織和組織學亞型的不同(圖2)。通過使用線性回歸模型消除這些影響，建立了藥物敏感性(圖1b)和基礎基因表達(圖1d)的標準化分布。然后，進行了wgcna以鑒定與這些藥物敏感性數據(ln(ic50))相關的共表達的基因模塊(圖4)。與藥物敏感性數據最負相關的共表達基因模塊構成了藥物“簽名”。根據這些藥物的“簽名”，將10種dna損傷治療劑分為4個不同的組(圖3)。多種大核糖體蛋白和小核糖體蛋白富含于5
?
氟尿嘧啶(5
?
fu)的模塊化內基因樞紐中，表明該藥物是核糖體的直接毒物?？梢园l現順鉑和所有這三種parp抑制劑(奧拉帕尼，魯卡帕里布和他拉唑帕尼)均被歸為同一組(紅色組)(圖3、表1)，表明這些藥物可能通過共同的機制起作用。進一步，通過geo人體組織芯片計算得到了類似的共表達基因集，表明通過細胞系數據進行分析得到的結果與體內數據是類似的。這些結果共同表明，parp抑制劑和順鉑具有共同的作用機制。
[0096]
表1順鉑和parp抑制劑的簽名模塊基因(signature gene modules)
[0097]
[0098]
[0099][0100]
表1中的5組不同藥物的簽名模塊基因分別構成上述的第二基因集、第三基因集、第四基因集、第五基因集、第六基因集。
[0101]
實施例2：核糖體的生物發生與細胞對parp抑制劑/順鉑的敏感性相關性
[0102]
為了得到可預測parp抑制劑和順鉑敏感性的生物學途徑，對wgcna衍生的這些藥物的特征模塊中的基因進行了go富集分析。通過wgcna r軟件包使用預處理后的編碼基因表達水平構建了有符號的共表達網絡。計算了每個基因模塊的本征基因與預處理后的藥物敏感性(ln(ic50))之間的皮爾遜相關系數。與 ic50最負相關的共表達基因模塊構成藥物的“簽名”。這些wgcna衍生的藥物特征模塊中的基因通過基因本體分析和可視化工具(gorilla)進行go富集分析。確定的生物學過程，分子功能和細胞成分go術語包括rrna加工(p＝4.48e
?4)，rna結合(p＝2.76e
?5)和核仁(p＝6.54e
?4)，表明參與核糖體生物發生的核仁基因富含parp抑制劑和順鉑的藥物特征模塊。
[0103]
通過皮爾遜的相關性分析，進一步將基因表達水平與parp抑制劑和順鉑的敏感性數據相關聯(圖6，表2
?
6)。皮爾遜細胞系數據的相關性分析過程如下：計算數據預處理后藥物敏感性(ln(ic50))和基因表達水平之間的皮爾遜相關系數，然后進行z變換。錯誤發現率(fdr)通過qvalue r package計算出的p值進行估算。通過webgestalt使用gsea的通路注釋對藥物敏感性與基因表達的相關性進行了基因集富集分析。通過對藥物敏感性
?
基因表達相關性進行gsea分析，確定了這些藥物的最主要的與藥物敏感性負相關的富集途徑，并且對多個不同parp inhibitor以及順鉑的分析結果高度一致，表明它們都是與rna代謝相關的途徑(圖7)。結果表明，核糖體合成是預測細胞對parp抑制劑/順鉑藥物反應的潛在通路。表2
?
6中所列基因分別構成了上述的第七基因集、第八基因集、第九基因集、第十基因集、第十一基因集。
[0104]
表2基因表達水平與olaparib的敏感性數據
[0105]
[0106]
[0107][0108]
表3基因表達水平與olaparib
?
1的敏感性數據
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114][0115]
表4基因表達水平與talazoparib的敏感性數據
[0116]
[0117]
[0118]
[0119][0120][0121]
表5基因表達水平與talazoparib的敏感性數據
[0122]
[0123]
[0124]
[0125][0126]
表6基因表達水平與cisplatin的敏感性數據
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133][0134]
實施例3：通過相關基因集預測細胞系對順鉑和parp抑制劑的反應
[0135]
基于上述實施例的研究分析，核糖體合成途徑是對parp抑制劑/順鉑反應的潛在預測指標。因此，基于這種藥物機制，我們開發了一種新策略來選擇代表性基因作為細胞對parp抑制劑/順鉑敏感性的生物標志物。我們的假說是參與核糖體合成的藥物靶標子網絡具有預測藥物敏感性的潛力。藥物簽名模塊可能代表藥物治療靶向的生物過程，與對這些藥物的敏感性負相關的基因可能代表藥物靶基因。因此，我們獲取多個parp inhibitor以及順鉑的藥物簽名模塊基因以及它們各自與敏感性負相關的基因(fdr<0.05)；通過取交集獲得21個候選基因(mybbp1a、ube2g1、eif4a1、nup88、gemin4、pelp1、c1qbp、pfas、sco1、 ywhae、rnmtl1、dhx33、wrap53、tsr1、fxr2、timm22、rpa1、mettl16、prpf8、crk、ankfy1)，其中有8個基因(mybbp1a,nup88,gemin4,pelp1,dhx33,c1qbp,wrap53和tsr1)參與核糖體合成。因此，我們認為這8個基因構成了parp抑制劑和順鉑的參與核糖體合成的藥物靶標共表達子網絡，從而具有預測細胞對parp抑制劑/順鉑敏感性的潛力，這8個基因構成了第十三基因集。
[0136]
癌細胞系的藥物敏感性數據可從gdsc數據庫中下載，第十三基因集中所有基因的表達水平可從ccle 數據庫中獲得。pca得分(評分方法具體可參考文獻如下：marchion,d.c.,et al.bad phosphorylationdetermines ovarian cancer chemosensitivity and patient survival.clin cancer res 17,6356
?
6366 (2011).)是根據第十三基因集中基因的表達計算得出的用以評估基因集在細胞中的整體表達水平，從而用來預測這些細胞系的敏感性(基于中位數截止值的“高”與“低”)。細胞系的hr狀態由ghandi等人發表 (ghandi,m.,et al.next
?
generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.nature 569,503
?
508 (2019).)的cosmic突變特征3的水平確定。具有hr缺陷特征水平的乳腺癌細胞系低于前四分之一的量化的所有乳腺癌細胞系hr缺陷特征水平(95.46113286)被定義為正常hr功能組。hr缺陷特征水平低于所有卵巢癌細胞系的前三分之一的量化的所有卵巢癌細胞系hr缺陷特征水平(115.8824107)被定義為正常hr功能組。為了對來自所有腫瘤類型的細胞系進行綜合分析，如上所述，通過線性回歸模型消除了基因表達和藥物敏感性數據的組織特異性差異。使用單側t檢驗計算p值。
[0137]
利用pca評分來量化該共表達第十三基因集的總體表達水平。在所有檢查的藥物和腫瘤類型中，大多數情況下，第十三基因集高表達細胞系中的ln(ic50)中值較低(73個中
的57個；圖8和圖9)。對于卵巢癌細胞系，除了rucaparib以外，與低表達組相比，高表達組的ln(ic50)值沒有顯著降低(圖10a上圖)。這可能部分是由其中一些細胞系中現有的hr缺陷引起的，從而影響了結果。為了排除這些混雜因素，通過根據cosmic mutation signature 3(hr mutation signature)的水平篩選出hr野生型細胞系。當與低表達組相比時，高表達組的他拉唑帕拉，rucaparib和順鉑的ln(ic50)值均顯著降低(圖10a下圖)。對于乳腺癌細胞系，除olaparib外，所有基因水平高的細胞系中所有藥物的ln(ic50)值均顯著降低(圖10b上圖)。篩選出hr野生型細胞系后，第十三基因集可準確預測細胞對parp抑制劑/順鉑的敏感性(圖10b下圖)。
[0138]
實施例4：細胞實驗驗證第十三基因集的預測性
[0139]
在3種癌癥(卵巢癌、乳腺癌和結直腸癌)中選取11株hr正常的腫瘤細胞系(hek293t,ov90,hct116, ht29,zr75
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30,hcc1954和bt549從美國典型培養物保藏中心(atcc)購買，ovkate從jcrb cell bank購買， ov56,a2780 and igrov1從sigma購買，colo678從leibniz institute dsmz.購買)，使用qpcr評估基因表達。
[0140]
免疫熒光染色過程如下：用50μm順鉑(397sigma，p4394)，100μmolaparib(lc laboratories，o
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9201)， 10μmdna
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pk抑制劑azd7648(chemscene，cs
?
0091859)，10nm atm抑制劑ku55933處理蓋玻片上培養的指示細胞(abcam，ab120637)或10μmatr抑制劑vx970(selleckchem，s7102)處理6小時。用 pbs洗滌一次后，將細胞在3％多聚甲醛中固定15分鐘，并在室溫下在0.5％triton x
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100溶液中透化5分鐘。然后將細胞用5％山羊血清封閉，并與所示的第一npm1(invitrogen，32
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5200)或γh2ax(cst，9718s) 抗體在4℃孵育過夜。隨后，將樣品洗滌并與alexa flour標記的二抗孵育60分鐘。進行dapi染色以可視化核dna。將蓋玻片用防褪色溶液固定在載玻片上，并使用nikon eclipse e800熒光顯微鏡觀察。
[0141]
核糖體分級過程如下：將bt549細胞以90％的密度接種到15cm培養皿中。用50μm順鉑，100μ molaparib或10nm atm抑制劑ku55933處理細胞6小時，用冰冷的pbs洗滌3次，然后輕輕刮入1.5ml 緩沖液a(250mm蔗糖，250mm kcl，5mm mgcl2，50mm tris
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hcl，ph 7.5，并補充1x蛋白酶抑制劑， pmsf，naf，β
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甘油磷酸酯，抑肽酶。加入igepal
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30至終濃度為0.7％(v/v)，并在冰浴中混合孵育20 分鐘。分離出5％的裂解液，并儲存以用于全細胞提取物的輸入。將剩余的裂解物在12,500rcf下離心10 分鐘。用緩沖液a平衡裂解物的蛋白質濃度，并用3m kcl將kcl水平調節至500mm。將裂解物上樣到聚丙烯試管(beckman coulter，328874)中的2.5ml蔗糖墊層(1m蔗糖，0.5m kcl，5mm mgcl2和50mmtris
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hcl ph 7.5)中。使用sw60ti轉子在beckman犁刀超速離心機(optima l
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80xp)中以45,000rpm將試管離心4小時。旋轉后，將核糖體沉淀重懸于1x上樣緩沖液中。樣品用于蛋白質印跡法以檢測rpl10a (abcam，ab174318)和rpl26(sigma
?
aldrich，hpa030449)的表達。gapdh(cst，2118s)被用作參照。
[0142]
γh2ax和rad51病灶的定量：在蓋玻片上培養的指示細胞以2gy輻射，然后釋放到新鮮培養基中，并在細胞培養箱中培養8小時。然后將細胞固定并如上所述用小鼠單克隆抗γh2ax(millipore，05
?
636) 抗體和兔單克隆抗rad51(abcam，ab133534)抗體染色。通過imagej軟件進行定量分析。
[0143]
根據qpcr結果，每種癌癥類型的細胞系分為高表達組和低表達組(圖11a)。進一步證實了第十三基因集的高表達預示著在hr常的細胞中對parp抑制劑/順鉑的易感性(圖
11b)。
[0144]
核糖體應激可以通過核仁完整性的破壞來評估，核仁完整性的破壞會導致核磷脂(npm)從核仁向核質的移位。進一步評估這些藥物對具有第十三基因集高表達和低表達的細胞系中核仁完整性的影響。免疫熒光染色表明，在基因集高表達的細胞系中，parp抑制劑/順鉑引起npm從核仁到核質的顯著移位，而在基因集低表達的細胞中則不會發生(圖12a)。這些結果表明，奧拉帕尼/順鉑在具有第十三基因集較高表達的細胞系中引起更嚴重的核糖體合成應激。
[0145]
進一步檢查了由parp抑制劑/順鉑引起的核糖體合成應激是否取決于dna損傷信號。免疫熒光染色表明，在基因表達水平高或低的細胞系中，奧拉帕尼/順鉑均在藥物處理4小時后誘導γh2ax foxi(圖13)。另外，在具有高基因表達的細胞系中，經parp抑制劑/順鉑處理后，atm抑制劑而不是atr和dna
?
pk抑制劑有效地阻斷了npm的釋放。atm抑制劑還顯著阻止了第十三基因集高表達的細胞系中核糖體結合的核糖體蛋白(rpl10a和rpl26)的大量減少(圖14)。這些結果表明，parp抑制劑/順鉑在具有第十三基因集高表達水平的hr正常細胞系中誘導了dna損傷信號激活的核糖體合成應激。
[0146]
核糖體合成應激導致rpl11(rpl11)的亞基釋放，從而誘導凋亡。因此，檢測了rpl11(rpl11)在第十三基因集高表達細胞和第十三基因集低表達細胞中藥物誘導的細胞死亡中的作用。使用shrna的 rpl11敲低對第十三基因集高表達的細胞中的hr功能沒有任何明顯的影響(圖17、圖18)，在基因集高表達但不是低表達的細胞中賦予了對這些藥物的抗性(圖15，圖16，圖19)。這些結果支持以下假設：核糖體合成應激途徑是具有第十三基因集高表達的hr正常細胞中parp抑制劑/順鉑誘導的細胞凋亡的主要途徑。
[0147]
總而言之，這些結果表明，具有第十三基因集高表達水平的腫瘤細胞，當通過parp抑制劑/順鉑導致的大量dna損傷時，會通過獨立于hr途徑的核糖體應激途徑死亡。
[0148]
實施例5：parp抑制劑/順鉑通過抑制第十三基因集基因觸發核糖體應激
[0149]
前述分析提示第十三基因集8個基因構成了parp抑制劑和順鉑的參與核糖體合成的藥物靶標共表達子網絡，因此我們推測parp抑制劑和順鉑是通過抑制第十三基因集所包含基因觸發核糖體應激。第十三基因集中8個基因的產物代表參與核糖體合成的多個弱連接功能模塊，細胞蛋白質網絡進化出分散的結構，以防止對單個模塊的攻擊破壞整個系統，因此，它需要同時針對參與特定生物學過程(如核糖體合成)的多個弱連接模塊，以破壞該過程或破壞核糖體合成。可能需要由parp抑制劑/順鉑誘導的對整個第十三基因集(即參與核糖體合成的藥物靶標共表達子網絡)累積抑制作用，而非單個基因，才能引起核糖體應激。
[0150]
為驗證該假說，我們檢測了在卵巢癌和結直腸癌細胞系中同時敲低第十三基因集八個基因的效果。敲低第十三基因集的八個基因在先前表達高的細胞系中誘導了核糖體應激，但在基因表達低的細胞系中不引起核糖體應激(圖20a、b)。另外，敲低八個基因后，先前第十三基因集為高表達的細胞系在敲低第十三基因集中8個基因的表達水平形成第十三基因集為低表達的細胞系后，對parp抑制劑/順鉑的耐藥性更高 (圖20c)。
[0151]
實施例6：第十三基因集表達水平和hr功能的聯合檢測預測臨床對parp抑制劑和cisplatin的藥敏性
[0152]
以下內容的結果表明第十三基因集和hr功能兩者的聯合檢測分析可以準確預測
對parp抑制劑/順鉑的敏感性。
[0153]
基因集表達水平和hr功能的結合預測臨床對parp抑制劑和cisplatin的藥敏性的方法，可以為以下兩種：
[0154]
第一種，先檢測hr功能，篩選出hr缺陷的病人；再對剩余的hr正常的病人檢測第十三基因集或其子集的表達，從中篩選敏感的病人。由于現有的hr功能檢測無法篩選出具有藥敏性的hr正常病人，因此，本方法可以解決該問題。
[0155]
第二種，如圖22i所示，先對病人檢測第十三基因集或其子集的表達，篩選出第十三基因集或其子集的整體表達水平為高表達的患者，然后可以利用hr狀態進一步從其余的第十三基因集或其子集的整體表達水平低表達的患者中選擇應答者。
[0156]
上述兩種聯合檢測的方式是等效的，但是由于第十三基因集表達水平檢測相比hr功能檢測成本更低、時間更短，因此更推薦第二種方法。
[0157]
因此，除了傳統已知對parp抑制劑/順鉑治療有反應的hr缺陷患者外，第十三基因集還可用于從其余的hr正?；颊咧羞x擇響應者。另一種方法是先篩選出所有第十三基因集高表達的患者作為潛在應答者，然后可以利用hr狀態進一步從其余的第十三基因集低表達的患者中選擇應答者(圖22i)
[0158]
首先檢查了hr狀態和第十三基因集對預測患者對順鉑反應的影響。對來自tcga的順鉑治療的卵巢癌患者進行了總生存期(os)分析。hr狀況由cosmic mutation signature 3指示。如所預期的，患者可大致分為四組：只有hr正常且第十三基因集表達低的患者對順鉑耐藥，而其他三組的患者則是潛在的反應者 (圖21a)。hr狀態可用于預測基因集表達低的患者的反應(危險比＝4.082；95％ci 1.529
?
10.9；p＝0.0026， n＝42)(圖21b)。最重要的是，該第十三基因集可用于預測hr正?；颊叩姆磻?危險比＝5.54；95％ci 1.16
?
26.43；p＝0.018，n＝21)(圖21a)。我們進一步對這些患者進行了無進展間期(pfi)和無病間期(dfi)。同樣，hr狀態是基因集表達低的患者的指標(pfi：危險比＝2.031，95％ci 0.9434
?
4.373，p＝0.065，n＝42； dfi：危險比＝6.551，95％ci 1.813
?
23.67，p＝0.001，n＝24)(圖21c
?
d)，而第十三基因集可準確預測hr 正?；颊叩姆磻?pfi：危險比＝3.412，95％ci 1.104
?
10.55，p＝0.026，n＝21；dfi：危險比＝6.143，95％ci 1.176
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32.08，p＝0.016，n＝13)(圖22b
?
c)。通過隨機選擇1000個包含8個隨機基因的基因集進行置換試驗，與前述第十三基因集對具有正常hr功能的患者生存預測的性能(危險比)進行比較(os的p＝0.004； pfi的p＝0.006；p＝0.024dfi)(圖21e
?
f)。置換實驗結果表明，在hr正常的患者中，第十三基因集的表達確實較隨機選擇的基因集可以更加有效地對順鉑的反應進行預測。我們還找到另一組來自hennessy的順鉑治療的卵巢癌患者數據。盡管這些患者的hr狀態尚不清楚，但第十三基因集高表達的患者仍比低表達的患者敏感得多(os：危險比＝4.391，95％ci 1.238
?
15.56，p＝0.013，n＝21；pfs：危險比＝3.815，95％ci 233 1.216
?
11.97，p＝0.012，n＝20)(圖21h
?
i)。這些結果表明基因集高表達的患者是順鉑的敏感者。
[0159]
從bcape數據庫預測一組乳腺癌的ptdc對parp抑制劑(talazoparib/olaparib)的體內外藥敏反應。選擇所有第十三基因集高表達或hr缺陷的ptdc作為parp敏感的ptdcs。這種方法成功地識別了所有 talazoparib敏感的ptdcs，其中hci010和stg195的第十三基因集表達水平雖然較低，但是由于存在體細胞的brca突變和brip1突變，通過檢查hr狀態可以預測它們是敏感模型(圖22d，g)。在驗證離體反應時，第十三基因集的檢測僅將導致1個偏
差數據(vhio244)(圖22d)。此外，通過第十三基因集的檢測對四個pdx小鼠模型talazoparib藥物敏感性預測結果被體內實驗所證實。通過第十三基因集的檢測對六個 pdx小鼠模型olapatib藥物敏感性預測結果也被體內實驗所證實。在一項針對olaparib的獨立研究中，pdx 小鼠模型的體內實驗還證明了第十三基因集對hci006，hci001和hci010的olaparib藥敏反應的預測結果。盡管在3次獨立的體內藥敏性驗證模型以及之前的體外藥敏性驗證模型中導致2兩個偏差的樣本(vhi0179 和stg139)，這些偏差可能是由藥物特異性耐藥機制引起的(圖22d
?
f)。具體而言，被預測對parp抑制劑敏感的vhio179，對olaparib敏感(圖22f)，但對talazoparib耐藥(圖22d
?
e)。被預測對parp抑制劑敏感的stg139，對talazoparib敏感(圖22d)，但對olaparib耐藥(圖22f)?？傊藘蓚€具有藥物特異性耐藥機制的模型外，本發明的模型在離體實驗驗證中預測了這些ptdc對parp抑制劑的反應，準確度為93.8％(16個中的15個)(圖22d)，并且在3個獨立的體內驗證中具有100％的準確性(圖22f
?
h)。
[0160]
我們還獲得了另一組卵巢癌的ptdc，其中在pdx小鼠模型中已驗證了5種ptdc對niraparib的體內藥敏反應。相關第十三基因集預測了這些模型對niraparib的體內藥敏反應具有100％的準確性，包括對 niraparib(ph039和ph087)敏感的兩組hr正常模型(圖22h)。這兩個抗藥性模型ph095和ph080據報道分別包含brca2突變和cdk12突變，這表明hr基因突變檢測hr狀態并不一定是可靠的。但是，所有抗藥性模型均為第十三基因集低表達的(圖22h)，從而證明該第十三基因集是對niraparib藥物反應的可靠指標。
[0161]
綜上所述，hr狀態和第十三基因集的聯合檢查相比hr狀態檢測可更有效篩選對順鉑/parp抑制劑有藥敏性的患者。
[0162]
實施例7：parp抑制劑/順鉑治療期間atm同時誘導核糖體應激以及hr修復通路對細胞命運的影響
[0163]
我們的研究證實依賴atm的核糖體應激是parp抑制劑/順鉑在具有第十三基因集高表達的癌細胞中誘導細胞死亡的重要途徑。另一方面，缺乏atm的細胞會表現出嚴重的hr修復缺陷。因此，許多研究嘗試研究atm突變造成的對parp抑制劑/順鉑的潛在合成殺傷力。但是，許多矛盾的結果引起了人們對atm 在hr修復中的作用的懷疑。本實施例的研究表明，在parp抑制劑/順鉑治療期間，atm可能對細胞存活產生兩種相反的作用：一種是atm激活的hr修復促進細胞存活，另一種是atm誘導的核糖體應激促使細胞凋亡(圖23g)，atm信號的激活會導致兩條途徑的博弈，二者最終博弈的結果決定細胞的命運，因此，這也解釋了為何基因集表達水平和hr功能的聯合檢測可以準確的篩選出絕大多數對藥物敏感的病人。
[0164]
本實施例利用atm抑制劑來測試atm信號在parp抑制劑/順鉑治療過程中的作用。結果表明，中等劑量的atm抑制劑(5μm)對細胞hr修復沒有明顯影響(圖23d)，并有效抑制了parp抑制劑/順鉑誘導的核糖體應激(圖23a
?
b)。因此，這種中等劑量的atm抑制劑確實賦予了具有第十三基因集高表達的細胞系對parp抑制劑/順鉑的抗性(圖23f)。
[0165]
另一方面，高劑量的atm抑制劑(10μm)既阻斷了核糖體應激并顯著破壞了細胞的hr修復(圖 23a
?
d)，在具有第十三基因集高表達的細胞中相較中等劑量的atm抑制劑(5μm)導致更多的細胞死亡 (圖23f)。這暗示細胞死亡是由hr修復缺陷引起的，盡管它仍可能通過對核糖體應激的抑制賦予了這些細胞對parp抑制劑/順鉑的輕度抗性，(圖23f)。相反，高水平的atm抑制劑(10μm)會嚴重破壞第十三基因集低表達細胞系中的hr修復(圖23c)，從而
使這些原本抵抗的細胞變得對parp抑制劑/順鉑敏感 (圖23e)。
[0166]
因此，這些結果進一步表明，第十三基因集是parp抑制劑/順鉑治療期間除hr狀態外另一個影響細胞存活的重要因素，并且atm信號通過同時控制hr修復和核糖體應激來平衡細胞命運。
[0167]
以上所揭露的僅為本發明較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利范圍，因此依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬本發明所涵蓋的范圍。