本發(fā)明屬于真菌菌核調(diào)控，具體涉及一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、近年來，隨著分子生物學(xué)與遺傳學(xué)的發(fā)展，研究表明非編碼rna在真菌發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。其中，srna長度為18nt~22nt的非編碼分子，能夠介導(dǎo)基因沉默，調(diào)控真核生物的發(fā)育進(jìn)程、信號傳導(dǎo)及代謝穩(wěn)態(tài)。目前，srna作為介導(dǎo)基因沉默的非編碼分子，已應(yīng)用于多個領(lǐng)域。如在植物中，外源施用或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的srna以調(diào)控抗逆性和抗病性。在醫(yī)學(xué)與動物研究中，基于srna的分子干預(yù)被用于疾病治療和代謝調(diào)控。在微生物領(lǐng)域，初步實現(xiàn)srna對基因表達(dá)的調(diào)控，如抑制毒力因子表達(dá)等。在真菌中，內(nèi)源性srna已被發(fā)現(xiàn)能夠通過靶向調(diào)控代謝酶、轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)構(gòu)蛋白等基因，影響生長、分化與代謝活動。然而，目前缺乏對菌核發(fā)育的srna應(yīng)用研究。
2、菌核是核盤菌等菌核形成真菌在環(huán)境逆境中長期存活的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其形成過程包括菌絲聚集、細(xì)胞分化及代謝物積累過程。因此基于核盤菌建立的菌核發(fā)育調(diào)控模型可為藥食用真菌的人工栽培與品質(zhì)調(diào)控提供參考。然而，現(xiàn)有菌核發(fā)育依賴的是核盤菌的自然發(fā)育過程，不可控。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種調(diào)控真菌菌核發(fā)育的ssc-milr240的應(yīng)用。
2、為了方便理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)將本發(fā)明的物質(zhì)和簡寫羅列如下：絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶基因，簡寫為stk。紡錘體組裝檢查點組件基因，簡寫為mad。atp依賴性dna解旋酶基因，簡寫為spoc。
3、本發(fā)明的目的是提供一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，所述應(yīng)用是指通過敲除ssc-milr240或者抑制ssc-milr240表達(dá)，解除對stk基因、mad基因和spoc基因在菌核發(fā)育期表達(dá)的抑制，促進(jìn)菌核發(fā)育。
4、其中，所述ssc-milr240為seq?id?no.1所示的核苷酸序列。
5、優(yōu)選的，所述試劑包括：包含用于敲除seq?id?no.1所示的基因的敲除質(zhì)粒。
6、優(yōu)選的，所述敲除質(zhì)粒由seq?id?no.1所示的基因的上下游片段和pcx62載體同源重組無縫克隆鏈接獲得。
7、優(yōu)選的，所述敲除的方法是同源重組敲除方法。
8、優(yōu)選的，所述同源重組敲除方法，包含以下步驟：用pre-ssc-milr240-5up和pre-ssc-milr240-5dn擴增ssc-milr240的上游同源片段，得到上游片段；用pre-ssc-milr240-3up和pre-ssc-milr240-3dn擴增ssc-milr240的下游同源片段，得到下游片段；將上游片段、下游片段、pcx62載體和潮霉素抗性基因同源重組無縫克隆鏈接，得到pcx62-δssc-milr240-hph；將pcx62-δssc-milr240-hph轉(zhuǎn)化，篩選，跨接pre-ssc-milr240-yup和pre-ssc-milr240-ydn，導(dǎo)入核盤菌，得到ssc-milr240敲除的核盤菌。
9、優(yōu)選的，所述上游同源臂長度為1.0kb~1.5kb。下游同源臂長度為1.0kb~1.5kb。
10、優(yōu)選的，所述pre-ssc-milr240-5up的核苷酸序列為5′-tatcgataagcttgatatcgcaagatgcctagctccg-3′。
11、所述pre-ssc-milr240-5dn的核苷酸序列為5′-ctagctccagcggcgcgccgcaatgaagtagagtgggtgag-3′。
12、所述pre-ssc-milr240-3up的核苷酸序列為5′-gatgccgaccgggccggccgctgaagagaattgggcatc-3′。
13、所述pre-ssc-milr240-3dn的核苷酸序列為5′-cggccgctctagaactagtgcgtcgatatcgtcaactacc-3′。
14、所述pre-ssc-milr240-yup的核苷酸序列為ctcacccactctacttcattg。
15、所述pre-ssc-milr240-ydn的核苷酸序列為gatgcccaattctcttcag。
16、優(yōu)選的，所述應(yīng)用是指防控核盤菌引起的菌核病。
17、優(yōu)選的，所述擴增的程序方法為：98°c，4min預(yù)變性；98°c，10s、58°c，5s、72°c，1min/kb，30個循環(huán)。72°c，10min延伸，回收純化，得到擴增片段。
18、優(yōu)選的，所述防控菌核病的方法是，通過合成ssc-milr240模擬物或吸附ssc-milr240的模擬物配制成制劑施用于田間。
19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
20、1、本發(fā)明的敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，所述應(yīng)用是指通過敲除ssc-milr240或者抑制ssc-milr240表達(dá)，解除對stk基因、mad基因和spoc基因在菌核發(fā)育期表達(dá)的抑制，促進(jìn)菌核發(fā)育。其中，所述ssc-milr240為seq?id?no.1所示的核苷酸序列。ssc-milr240具有典型莖環(huán)結(jié)構(gòu)。ssc-milr240在菌核形成階段，表達(dá)量顯著上調(diào)，而stk、mad和spoc基因表達(dá)受抑制，表明其參與真菌發(fā)育調(diào)控。ssc-milr240敲除后體表現(xiàn)為菌絲生長速率無影響、菌核數(shù)量顯著增加、乙酰輔酶a含量及葡萄糖代謝異常，且本發(fā)明的敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑能促進(jìn)核盤菌的菌核發(fā)育，促使核盤菌進(jìn)入休眠狀態(tài)，減少菌核病的發(fā)病率。
21、2、本發(fā)明所述的ssc-milr240可作為真菌菌核發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵分子靶點，用于開發(fā)基于rna調(diào)控的真菌發(fā)育和代謝調(diào)控技術(shù)，以真菌內(nèi)源途徑實現(xiàn)發(fā)育和代謝調(diào)控，具有作用特異性強、環(huán)境安全性高、可直接轉(zhuǎn)化為rna干預(yù)防控或菌株改良技術(shù)等優(yōu)勢。
1.一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指通過敲除ssc-milr240或者抑制ssc-milr240表達(dá)，解除對stk基因、mad基因和spoc基因在菌核發(fā)育期表達(dá)的抑制，促進(jìn)菌核發(fā)育；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑包括：包含用于敲除seq?id?no.1所示的基因的敲除質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述敲除質(zhì)粒由seq?id?no.1所示的基因的上下游片段和pcx62載體同源重組無縫克隆鏈接獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述敲除的方法是同源重組敲除方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述同源重組敲除方法，包含以下步驟：用pre-ssc-milr240-5up和pre-ssc-milr240-5dn擴增ssc-milr240的上游同源片段，得到上游片段；用pre-ssc-milr240-3up和pre-ssc-milr240-3dn擴增ssc-milr240的下游同源片段，得到下游片段；將上游片段、下游片段、pcx62載體和潮霉素抗性基因同源重組無縫克隆鏈接，得到pcx62-δssc-milr240-hph；將pcx62-δssc-milr240-hph轉(zhuǎn)化，篩選，跨接pre-ssc-milr240-yup和pre-ssc-milr240-ydn，導(dǎo)入核盤菌，得到ssc-milr240敲除的核盤菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述上游同源臂長度為1.0kb~1.5kb；下游同源臂長度為1.0kb~1.5kb。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述pre-ssc-milr240-5up的核苷酸序列為5′-tatcgataagcttgatatcgcaagatgcctagctccg-3′；
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指防控核盤菌引起的菌核病。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種敲除ssc-milr240或抑制ssc-milr240表達(dá)的試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述防控菌核病的方法是，合成ssc-milr240模擬物或吸附ssc-milr240的模擬物配制成制劑施用于田間。