本發明涉及抗蟲研究，具體涉及一種利用葉片衰老相關基因nac109增強楊樹抗蟲性的方法。
背景技術：
1、本發明對于背景技術的描述屬于與本發明相關的相關技術，僅僅是用于說明和便于理解本發明的
技術實現要素：
，不應理解為申請人明確認為或推定申請人認為是本發明在首次提出申請的申請日的現有技術。
2、美國白蛾（hyphantriacunea）是一種原產于北美洲的鱗翅目害蟲，自20世紀中期傳入亞洲后迅速擴散，現已成為全球范圍內的重要檢疫性害蟲。在我國，美國白蛾被列為重大外來入侵物種，被列入《全國林業檢疫性有害生物名單》及《進境植物檢疫性有害生物名錄》，受到國家層面的高度關注。截至目前，該害蟲已在我國14個省（自治區、直轄市）的611個縣級行政區發生不同程度的危害，其分布范圍仍在持續擴大，擴散與蔓延風險極高，對我國森林生態安全、城市綠化系統以及農林經濟構成嚴重威脅。
3、美國白蛾之所以具有極強的入侵性和破壞力，主要源于其生物學特性與生態適應能力。一方面，在其入侵地缺乏原產地天敵（如寄生蜂、捕食性昆蟲等）的有效制約，導致種群數量呈指數級增長；另一方面，公眾和基層防控人員對其生活史、發生規律及危害特點認知不足，加之早期監測預警體系不健全、綠色防控技術儲備有限，使得防控工作往往滯后于蟲害爆發速度，難以實現有效遏制。
4、尤其值得關注的是，美國白蛾幼蟲具有典型的暴食性特征。其3齡以后進入暴食期，常以數十至數百頭聚集在枝梢吐絲結網，并在網幕內集中取食葉片。在高密度發生區域，幼蟲可在數日內將整株楊樹、柳樹、榆樹、桑樹等多種闊葉樹的葉片啃食殆盡，僅剩主脈，造成“夏樹冬景”的異常現象。這種劇烈的葉片損失不僅使樹木光合作用面積急劇減少，碳水化合物合成受阻，養分積累中斷，還嚴重干擾樹木正常的生理代謝與生長節律。長期反復受害會導致樹勢衰弱、抗逆性下降，進而誘發次期性病害或蟲害，最終引發成片林木枯死，對城市景觀、防護林體系乃至整個區域生態平衡造成不可逆的損害。
5、此外，美國白蛾繁殖力強、食性雜、擴散快、適應廣，一年可發生2–3代（北方2代，南方3代），單雌產卵量可達500–2000粒，且可通過成蟲飛行、蛹隨苗木運輸等方式實現遠距離傳播。這些特性進一步加劇了其防控難度。因此，亟需研發高效、環保、可持續的綜合防控技術體系，以應對這一日益嚴峻的生態安全挑戰。本發明正是在此背景下，針對現有技術中的不足，提出一種創新性解決方案，旨在提升對美國白蛾的監測精度與防控效能，降低其對生態環境和林業生產的危害。
技術實現思路
1、本發明實施例的目的是提供一種
2、一種利用葉片衰老相關基因nac109增強楊樹抗蟲性的方法，包括如下步驟：
3、（1）獲得ptnac109基因的cds序列：
4、（2）設計引導grna序列；
5、（3）構建靶向ptnac109基因編輯載體質粒；
6、（4）準備遺傳轉化農桿菌侵染液；
7、（5）使用農桿菌感染毛白楊植株；（6）篩選具有抗性的愈傷組織；
8、（7）誘導、延長及生根抗性芽；
9、（8）利用分子生物學手段驗證基因編輯效果；
10、（9）獲得抗蟲性增強的楊樹基因編輯新種質。
11、進一步的，步驟（1）具體包括如下步驟：
12、以野生型毛白楊的cdna為模板，通過pcr的方法擴增得到ptnac109基因的cds序列；引物為：
13、正向引物ptnac109-f:atggaaaacatttctggacttg
14、反向引物ptnac109-r:tcaatagttccagaaacaatcaag
15、pcr產物經純化以后，用t4連接酶在4℃連接t載體過夜，連接產物通過42℃處理60秒熱激的方法轉到大腸桿菌，在氨芐霉素的lb培養基上篩選陽性克隆，并經測序鑒定ptnac109基因的序列；
16、進一步的，步驟（2）具體包括如下步驟：
17、克隆目的基因片段，分析體毛白楊ptnac109基因序列，根據序列，在crispr-p2.0（http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/）網站設計并篩選出基因編輯引導grna：
18、grna1：atgctagagcaatcggagatg
19、grna2：gatctacagaggaaaatccc。
20、進一步的，步驟（3）具體包括如下步驟：
21、取pylcrispr/cas9-n質粒加入到大腸桿菌top10感受態中，冰上靜置2分鐘；42℃處理60秒水浴熱激后放置在冰上3分鐘，加入500?μl的lb液體培養基，4000?g離心3分鐘，將沉淀涂布在含有?kanamycin的lb固體培養基上，直至長出單克隆；挑取單克隆，在液體培養基中培養；提取質粒純化，稀釋得到質粒載體；將設計的grna1和grna2構建到基因編輯載體pylcrispr/cas9-n上。
22、進一步的，步驟（4）具體包括如下步驟：
23、將已構建的基因編輯載體導入農桿菌eha105菌株中；
24、獲取單菌落：把攜帶靶向ptnac109基因編輯序列的eha105農桿菌接種到lb固體培養基，于28℃下培養48小時；小規模培養農桿菌：從單菌落中挑取部分接種至lb液體培養基，在28℃、200?rpm條件下培養一天；擴大農桿菌培養：將經過一天培養的農桿菌全部轉移至新鮮lb液體培養基中，繼續在28℃、200?rpm條件下培養直至od600達到0.8；
25、進行二次擴增：按照1:100的比例將擴大培養后的農桿菌接種到新的lb液體培養基中，在相同條件下培養直到od600值為0.6；制備感染懸浮液：收集二次培養后的eha105農桿菌，通過離心獲得沉淀，并用重懸液（wpm液體培養基，含30?g/l蔗糖，100?μm/l乙酰丁香酮）重新懸浮該沉淀；隨后添加氧化石墨烯溶液調整濃度至0.01-0.05‰以備感染使用。
26、進一步的，步驟（5）具體包括如下步驟：
27、選擇一個月大的毛白楊無菌苗，切成邊長0.5-1.0?cm的小方塊；浸入準備好的懸浮液中浸泡10-30分鐘，期間每五分鐘輕輕搖晃數次，促進農桿菌與植物材料的共同培養；侵染后過濾掉多余液體，吸干水分，然后將葉片反面向下放置于直徑9?cm的含有共培養基的培養皿內，在22-25℃和完全黑暗環境中共同培養一天；之后將培養皿置于4-7℃環境下2小時，再回到22-25℃繼續培養兩天。
28、進一步的，步驟（6）具體包括如下步驟：
29、將處理過的葉片轉移到愈傷誘導培養基（wpm固體培養基，含30?g/l蔗糖，1.0?mg/l?萘乙酸，2.0?mg/l?玉米素，350?mg/l?cefotaxime，6.5?g/l瓊脂，0.01~0.05‰的氧化石墨烯）上，在22-25℃、光照強度150?μmol?m-2?s-1及光照16小時/黑暗8小時的周期下培養兩周，每隔一周更換一次培養基；再轉移到含抗性成分的愈傷誘導培養基（wpm固體培養基，含30?g/l蔗糖，1.0?mg/l?萘乙酸，2.0?mg/l?玉米素，350?mg/l?cefotaxime，50?mg/lkanamycin，6.5?g/l瓊脂，0.01~0.05‰的氧化石墨烯）上，同樣的環境條件下繼續培養2-3周，定期更換培養基，直到觀察到白色愈傷組織形成。
30、進一步的，步驟（7）具體包括如下步驟：
31、切除周圍的白色愈傷組織并移植到抗性芽誘導培養基（wpm固體培養基，含30?g/l蔗糖，0.1?mg/l?萘乙酸，2.0?mg/l?玉米素，350?mg/l?cefotaxime，50?mg/l?kanamycin，6.5?g/l瓊脂，0.01~0.05‰的氧化石墨烯）上，在相同條件下培養4-5周，期間每十天更換一次培養基，直到產生約0.5厘米長的綠色抗性芽；將這些抗性芽片段移到伸長培養基中，所述的伸長培養基中為wpm固體培養基，含30?g/l蔗糖，0.5?mg/l?6-ba，350?mg/l頭孢噻肟，9mg/l卡那霉素，6.5?g/l瓊脂；同樣條件下培養10-20天，直至芽伸長至1.0-3.0厘米；
32、最后將不定芽剪下插入生根培養基（wpm固體培養基，含30?g/l蔗糖，0.05?mg/lnaa，350?mg/l?cefotaxime，30?mg/l?kanamycin，6.0?g/l瓊脂）中，持續培養20-30天，直至發育出完整的根系以及幼苗高度達到6-8厘米。
33、進一步的，步驟（8）具體包括如下步驟：
34、提取dna樣本，使用ptnac109-f和ptnac109-r引物進行pcr擴增，將pcr產物鏈接t載體，進行測序，將測序結果與野生型植株序列進行比對，檢測是否發生序列改變，檢測基因編輯事件是否發生。
35、本發明實施例具有如下有益效果：
36、通過crispr/cas9基因編輯技術精準敲除楊樹葉片衰老關鍵調控基因nac109，可顯著降低美國白蛾（hyphantriacunea）幼蟲的取食偏好與消化效率。nac109?敲除株系對美國白蛾的抗性較野生型顯著增強，蟲害造成的葉面積損失相比于野生型降低70%以上。此外，由于該策略不引入外源基因，僅通過內源基因功能缺失實現抗性提升，符合我國對基因編輯植物的監管導向，具有良好的生態安全性與推廣應用前景。本發明為楊樹抗蟲育種提供了新靶點和高效技術路徑，對保障人工林生態安全和木材生產具有重要價值。