本申請涉及生物醫學領域，更具體地說，它涉及一種微血管段提取方法及其用途。
背景技術：
1、神經血管單元是保障血管與腦組織間進行營養和信息通訊的重要結構，起到調節血腦屏障的功能，參與急性腦梗死、動脈狹窄性慢性腦缺血、腦小血管病等疾病的病理生理過程。而神經元血管單元由腦微血管內皮細胞、周細胞、小膠質細胞、神經元和細胞外基質等組成，探索上述細胞的病理生理變化及細胞間的信號交流是改善急性腦損傷患者預后的重要方法。
2、鑒于此，目前較多研究報道采用機械研磨-梯度離心、熒光流式分選、顯微解剖等方式將腦血管細胞與皮質組織解離，富集腦血管細胞進行后續分析；然而，現有技術仍然存在如下技術問題：(1)機械分離容易造成血管細胞損傷，影響后續需要收集活細胞的實驗；網篩過濾造成大量血管丟失，均易降低細胞分離得率；(2)熒光流式分選需要攜帶特定標記基因熒光的基因編輯鼠，操作繁瑣，限制了在其他無熒光標記的種屬上的使用，且應用標記基因進行富集的方法易導致選擇偏倚；(3)顯微解剖法對實驗者技術要求極高，且所得血管的直徑有極限，不能得到直徑在40um以下的微血管（如毛細血管、微動脈和微靜脈）；(4)在目前報道的腦微血管基因表達譜的研究中，大多聚焦于分選出的某一細胞群（如內皮細胞），鮮有能夠獲得完整微血管段并完整分析所有血管結構細胞及血管附著細胞的方法，限制了對于腦微血管不同細胞類型信號交流改變的研究。
3、綜上，在成年嚙齒動物腦組織中分離出完整的微血管段并保留細胞活性一直是神經生物學的難題。研發一種從成年大鼠腦組織中分離完整微血管段并保留上所有類型細胞及附著免疫細胞的方法，不僅有效彌補現有技術的不足，且對后續進行單細胞測序等實驗、繪制腦微血管所有細胞類型的基因表達圖譜具有重要意義。
技術實現思路
1、本申請的發明目的在于開發一種較溫和的分離成年大鼠腦微血管段的方法，較現有機械研磨法更溫和，能夠保留微血管段上附著的免疫細胞，得到所有管徑水平的腦微血管，對所有腦微血管結構及附著細胞不存在選擇偏倚，并確保所得腦微血管段中的活細胞率，從而能夠適配后續需要活的腦微血管細胞的研究。
2、為了實現上述發明目的，本申請采用以下的技術方案：
3、第一方面，本申請提供一種微血管段提取方法，包括以下步驟：
4、步驟1，消化大鼠腦組織：
5、1-1，解剖分離大鼠皮層：取新鮮腦組織，去除軟腦膜及相關大動脈，解剖出大腦皮層并剪成小塊；
6、1-2，將剪碎的腦組織置于含有1%膠原酶的dmem培養基中，在37°c條件下振蕩消化，消化過程中進行多次吹打操作，吹打完成后，繼續消化至無可見組織小塊；
7、步驟2，分離腦微血管段：
8、2-1，加入dmem培養基終止消化，離心棄上清；
9、2-2，向沉淀中加入含25%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，輕柔吹打顛倒混勻，離心，收集最下層的微血管段沉淀，清洗，得到腦微血管段。
10、進一步地，步驟1-2中，多次吹打操作包括：
11、第一次吹打：使用剪口的1ml移液器吸頭；
12、第二次吹打：使用標準巴氏吸管；
13、第三次吹打：使用標準1ml吸頭。
14、進一步地，每次吹打操作間隔20min。
15、進一步地，所述第三次吹打完成后，繼續消化15min。
16、進一步地，步驟1-2中，將剪碎的腦組織置于10倍體積的含有1%膠原酶的dmem培養基中消化解離。
17、進一步地，步驟2-1中，離心條件為：4°c，1000g，離心5min。
18、進一步地，步驟2-2中，離心條件為：4°c，2000g，離心15min。
19、進一步地，步驟2-2中，清洗過程為：加入pbs輕柔吹打混勻，4°c，800g離心5min，棄上清，重復清洗至獲得純凈的血管段組織。
20、第二方面，本申請提供所述的微血管段提取方法在轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、表觀基因組學和單細胞分析中的用途。
21、綜上所述，本申請具有以下有益效果：
22、本申請建立的分離方式首先從腦組織中將微血管段的完整結構解離，再進一步將完整微血管段解離成為單細胞并銜接后續測序流程，能夠無偏倚地保留微血管段及其上附著的所有細胞類型，避免了既往采用流式分選法時某種標志物所帶來的細胞選擇性，有助于發現新的特殊的微血管相關細胞類型。
23、本申請解離微血管段的過程溫和，相較以往以研磨為基礎的腦血管分離方式能夠更好地保留微血管段的細胞活力，滿足單細胞測序對于細胞活率的要求。此外，此種解離方式對血管段上附著的免疫細胞有良好的保留，有助于進一步研究微血管相關免疫細胞的特殊亞群。
24、本申請在酶解離腦組織的過程中加入了分次消化及吹打的步驟，并測試了延長消化時間對組織活力的影響。經驗證，此種方法破解了以往酶解離因過于溫和只能應用于幼年鼠腦組織的難點，成功適配了成年及老年鼠腦組織的研究，為成年大鼠腦微血管的研究提出了新的提取方法。
1.一種微血管段提取方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的微血管段提取方法，其特征在于，步驟1-2中，多次吹打操作包括：
3.根據權利要求2所述的微血管段提取方法，其特征在于，每次吹打操作間隔20min。
4.根據權利要求2所述的微血管段提取方法，其特征在于，所述第三次吹打完成后，繼續消化15min。
5.根據權利要求1所述的微血管段提取方法，其特征在于，步驟1-2中，將剪碎的腦組織置于10倍體積的含有1%膠原酶的dmem培養基中消化解離。
6.根據權利要求1所述的微血管段提取方法，其特征在于，步驟2-1中，離心條件為：4°c，1000g，離心5min。
7.根據權利要求1所述的微血管段提取方法，其特征在于，步驟2-2中，離心條件為：4°c，2000g，離心15min。
8.根據權利要求1所述的微血管段提取方法，其特征在于，步驟2-2中，清洗過程為：加入pbs輕柔吹打混勻，4°c，800g離心5min，棄上清，重復清洗至獲得純凈的血管段組織。
9.權利要求1-8任一項所述的微血管段提取方法在轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、表觀基因組學和單細胞分析中的用途。