本發明屬于基因工程，具體涉及一種核糖體蛋白n'突變體及其應用。
背景技術：
1、人乳寡糖(human?milk?oligosaccharides，hmos)是母乳中的一類重要的生物活性成分，hmos具有多種生理功能，包括建立平衡的嬰兒腸道微生物群、增強胃腸道屏障、預防感染以及對免疫系統的潛在支持。根據其結構不同，分為巖藻糖基化的中性母乳寡糖、唾液酸化的母乳寡糖和非巖藻糖基化的中性母乳寡糖。目前發現的hmos超過200種，包括3'-唾液酸基乳糖(3'-sialyllactose，3'-sl)、6'-唾液酸基乳糖(6'-sialyllactose，6'-sl)、乳酰- n-三糖ii(lacto- n-triose，lnt?ii)、乳酰- n-新四糖(lacto- n-neotetraose，lnnt)和乳酰- n-四糖(lacto- n-tetraose，lnt)等。目前，hmos的生產方法包括化學合成法、酶催化法及微生物發酵法等，其中微生物發酵法在發酵過程中具有操作簡便、生產方式環境友好、成本低等優勢，更適合規模化工業生產。
2、在大腸桿菌中，合成lnnt時，以葡萄糖或甘油作為碳源，以乳糖作為底物。葡萄糖-6-磷酸（glc-6-p）在 pgi編碼的葡萄糖-6-磷酸異構酶的催化下轉化為果糖-6-磷酸（f6p），f6p依次在 glms編碼的谷氨酰胺-6-磷酸果糖氨基轉移酶、 glmm編碼的磷酸葡萄糖胺變位酶、 glmu編碼的 n-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷轉移酶/乙酰轉移酶的催化下轉化為尿苷二磷酸- n-乙酰基葡萄糖胺（udp-glcnac）；在另一前體尿苷二磷酸-半乳糖（udp-gal）的合成途徑中，glc-6-p在 pgm編碼的葡萄糖磷酸變位酶和 gale編碼的udp-半乳糖-4-表異構酶的催化下轉化為udp-gal，在 lgta編碼的β-1,3- n-乙酰氨基葡萄糖氨基轉移酶的催化下，乳糖與udp-glcnac生成中間產物lnt?ii，隨后，lnt?ii在 lgtb編碼的β-1,4-半乳糖基轉移酶的催化下，與udp-gal結合生成lnnt，在 wbgo編碼的β-1,3-半乳糖基轉移酶的催化下生成lnt。在唾液酸化的人乳寡糖合成過程中，大腸桿菌以udp-glcnac合成途徑為基礎，在udp- n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向異構酶（neuc）、 n-乙酰神經氨酸合酶（neub）和 n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶（neua）的催化作用下合成胞苷單磷酸- n-乙酰神經氨酸cmp-neu5ac。cmp-neu5ac在α2,3-唾液酸轉移酶α2,3-siat和α2,6-唾液酸轉移酶α2,6-siat的催化作用下與乳糖結合，分別合成3'-sl和6'-sl。
3、pria（核糖體蛋白n'）是一種多功能蛋白；它具有單鏈dna依賴性atp酶活性，是一種3'→5'dna轉位酶，作為招募其他蛋白形成dna復制重啟引發體的支架，并作為解旋酶在重啟停滯復制叉過程中打開雙鏈dna。由于pria的功能與其他代謝通路之間的相互作用有限，尚未對其進行系統性研究（mam,?camille?h,skm?,?et?al.?identification?ofgenetic?interactions?with priblinks?the?pria/prib?dna?replication?restartpathway?to?double-strand?dna?break?repair?in escherichia?coli.[j].g3(bethesda,?md.),2022,12(12)）。
4、本研究在人乳寡糖生產菌株中引入 pria基因的突變，期望可以進一步提高人乳寡糖的產量。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本發明利用基因編輯技術，對大腸桿菌 pria基因進行編輯，并通過此基因編輯，獲得了一種可提高人乳寡糖產量的生產菌株。
2、本發明提供的技術方案之一，是一種核糖體蛋白n'突變體，所述突變體是在seqid?no.1所示的野生型核糖體蛋白n'的基礎上，將190位tyr突變為asp，所述核糖體蛋白n'突變體氨基酸序列如seq?id?no.3所示；
3、本發明還提供上述核糖體蛋白n'突變體的編碼基因；
4、進一步地，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
5、本發明提供的技術方案之二，是技術方案之一所述核糖體蛋白n'突變體的應用，特別是在生產人乳寡糖中的應用；
6、進一步地，將人乳寡糖生產菌株中表達的核糖體蛋白n'突變為seq?id?no.3所示的突變體時，可以提高人乳寡糖的產量；
7、更進一步地，所述人乳寡糖包括但不限于：乳酰- n-三糖（lacto-triose，lnt?ii）、乳酰- n-新四糖（lacto- n-neotetraose，lnnt）、乳酰- n-四糖（lacto- n-tetraose，lnt）、3'-唾液酸基乳糖（3'-sialyllactose，3'-sl）以及6'-唾液酸基乳糖（6'-sialyllactose，6'-sl）。
8、本發明提供的技術方案之三，是一種生產人乳寡糖的工程菌，所述工程菌是以人乳寡糖生產菌株為出發菌株，將編碼核糖體蛋白n'的基因突變為seq?id?no.3所示突變體的編碼基因獲得的；
9、進一步地，所述出發菌以大腸桿菌k12?mg1655為宿主，敲除宿主乳糖操縱子序列中的 lacz，并過表達 lacy；在此基礎上，所述菌株中還包含人乳寡糖生產途徑；
10、進一步地，所述人乳寡糖包括但不限于：乳酰- n-三糖（lacto- n-triose，lnt?ii）、乳酰- n-新四糖（lacto- n-neotetraose，lnnt）、乳酰- n-四糖（lacto- n-tetraose，lnt）、3'-唾液酸基乳糖（3'-sialyllactose，3'-sl）以及6'-唾液酸基乳糖（6'-sialyllactose，6'-sl）；
11、更進一步地，所述人乳寡糖生產途徑為以下質粒中的任意一種：
12、ptrc99a-ptrc- lgta、ptrc99a-ptrc- lgtb- lgta、ptrc99a-ptrc- wbgo- lgta、ptrc99a-pj23119- neub-neuc-ptrc- neua-ist和ptrc99a-pj23119- neub-neuc-ptrc- neua-st6。
13、本發明提供的技術方案之四，是技術方案之三所述工程菌的應用，特別是在人乳寡糖生產中的應用。
14、有益效果
15、本發明通過基因編輯技術獲得一種pria突變體y190d，當生產菌株表達的核糖體蛋白n'發生y190d突變后，lnt?ii產量提升28.6%、lnnt產量提升50%、lnt產量提升92.3%、3'-sl產量提升13.8%、6'-sl產量提升20%。可見，pria第190位氨基酸由酪氨酸變為天冬氨酸后，提高了其在發酵后期環境中菌株的生長、生產能力，將其應用于生產人乳寡糖的大腸桿菌中，最終使人乳寡糖產量得到大幅度提高。