本發(fā)明涉及植物基因工程，具體涉及一種茶樹愈傷組織的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
1、茶樹（ camellia?sinensis(l.)?o.?kuntze）為山茶科山茶屬多年生木本植物，具有悠久的栽培歷史，主要分布在我國(guó)西南、華南和華東地區(qū)。茶葉中含有對(duì)人體有益的茶多酚、咖啡堿、茶氨酸等物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化、提神醒腦等功能，深受消費(fèi)者喜愛。
2、茶樹具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、自交不親和、花期短等特點(diǎn)，致使常規(guī)育種進(jìn)程受限，茶樹育種工作難以得到突破性的進(jìn)展。相比傳統(tǒng)育種，分子育種技術(shù)可以解決茶樹培育時(shí)間長(zhǎng)、工作量大等問題，而遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)茶樹分子育種的重要手段。
3、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是將目的基因（dna片段）分離，通過(guò)直接導(dǎo)入或生物介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并得到表達(dá)的一種方法，常見的有農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法和基因槍轟擊轉(zhuǎn)化法。目前，茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建研究已取得一定進(jìn)展，但仍然存在遺傳轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差以及離體再生困難等問題，主要原因是茶樹自身的次生代謝產(chǎn)物對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響。
4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是茶樹在常用的一種轉(zhuǎn)化方法，常用根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化工作可分為植物表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化體系的建立、目的基因的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的篩選與獲得、轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)與轉(zhuǎn)基因植株的獲得。根癌農(nóng)桿菌常用浸泡法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以茶籽實(shí)生苗莖段為轉(zhuǎn)化材料作為例子，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化操作程序如下：無(wú)菌苗的獲得→外植體的收集與農(nóng)桿菌侵染液的準(zhǔn)備→農(nóng)桿菌侵染外植體→外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)→恢復(fù)培養(yǎng)→篩選培養(yǎng)→生根與移栽。除了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹轉(zhuǎn)基因外，也有人用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染茶樹，誘導(dǎo)毛狀根。奚彪等用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染無(wú)菌茶苗的葉片，并最終誘導(dǎo)出毛狀根。
5、目前，茶樹葉片、莖段、子葉、體細(xì)胞胚和愈傷組織常用來(lái)作為外植體材料進(jìn)行侵染。其中，體細(xì)胞胚和愈傷組織是茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中使用頻率較高的外植體，其轉(zhuǎn)化和再生效果也優(yōu)于其他外植體。在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中胚性細(xì)胞能與農(nóng)桿菌和抗生素緊密接觸，既提高了轉(zhuǎn)化效率和篩選效率，也減少了不定芽再生途徑所誘導(dǎo)出的嵌合體的出現(xiàn)，因此被認(rèn)為是理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體。
6、公布號(hào)為cn114208669a的中國(guó)專利申請(qǐng)文獻(xiàn)，公開了一種以茶樹莖段為外植體建立高效再生體系的方法，通過(guò)無(wú)菌體系的建立、誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織誘導(dǎo)分化芽、芽生長(zhǎng)發(fā)育、壯芽、生根、煉苗及移栽等步驟，解決了目前莖段無(wú)性系再生方法多為腋芽增殖、重復(fù)效果差以及無(wú)法滿足遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)高頻再生體系的需求等問題，理論上還可
7、進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。該專利建立了茶樹莖段組織培養(yǎng)與植株高效再生體系，為茶樹良種繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于如何解決現(xiàn)有茶樹遺傳轉(zhuǎn)化所存在的轉(zhuǎn)化效率低等問題、并為茶樹高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系打下一定基礎(chǔ)。
2、本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)解決上述技術(shù)問題的：
3、本發(fā)明提出一種茶樹愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化構(gòu)建方法，包括以下步驟：
4、（1）愈傷組織懸浮培養(yǎng)
5、選擇生長(zhǎng)旺盛、白色疏松的愈傷組織，置于液體懸浮培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)；
6、（2）農(nóng)桿菌活化
7、挑取農(nóng)桿菌菌株單菌落，在含卡那霉素（kanamycin）的lb固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，暗培養(yǎng)，獲得活力旺盛的農(nóng)桿菌菌落；
8、（3）農(nóng)桿菌侵染液制備
9、將（2）所得農(nóng)桿菌接種于未加抗生素的mt液體培養(yǎng)基中，然后加入乙酰丁香酮（acetosyringone，as），懸浮培養(yǎng)；
10、（4）農(nóng)桿菌侵染
11、將（1）所得茶樹愈傷組織放入（3）所得農(nóng)桿菌侵染液中，抽真空，隨后置于搖床常溫下浸染；侵染完后將愈傷組織接種至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)；
12、（5）gus染色
13、取出共培養(yǎng)后的愈傷組織，清洗，隨后浸泡于gus染色液中，真空抽濾后，水浴加熱，根據(jù)染色情況判斷轉(zhuǎn)化成功與否。
14、優(yōu)選的，步驟（1）中，所述愈傷組織為‘龍井43’胚性愈傷組織。
15、優(yōu)選的，步驟（1）中，所述懸浮培養(yǎng)的條件為：黑暗條件下、23~25℃、150~250?rpm；進(jìn)一步優(yōu)選為24℃、200?rpm。
16、優(yōu)選的，步驟（1）中，所述液體懸浮培養(yǎng)基的具體成分可為下述任一配方：
17、配方一：mt?+?（0.5~2）mg/l?2,4-d?+（0.05~2）mg/l6-ba+?（2~2.5）g/l?kcl?+?（38~42）g/l?蔗糖；
18、配方二：mt?+?（0.5~2）mg/l?2,?4-d?+（0.05~2）mg/l?kt?+（2~2.5）g/l?kcl?+（38~42）g/l?蔗糖；
19、配方三：mt?+?（1.5~2.5）mg/l?2,?4-d?+（2~2.5）g/l?kcl?+（38~42）g/l蔗糖；
20、配方四：mt?+?（2~2.5）g/l?kcl?+（38~42）g/l?蔗糖。
21、進(jìn)一步優(yōu)選為：mt?+?2?mg/l?2,4-d?+?0.2?mg/l?6-ba?+?2.2?g/l?kcl?+?40?g/l蔗糖。
22、優(yōu)選的，步驟（2）中，所述卡那霉素（kanamycin）的濃度為45~60?mg/l，進(jìn)一步優(yōu)選為50?mg/l。
23、優(yōu)選的，步驟（2）中，所述暗培養(yǎng)的條件為：24~26℃，1~3d；進(jìn)一步優(yōu)選為25℃，2d。
24、優(yōu)選的，步驟（3）中，乙酰丁香酮的濃度為90~110?μm；進(jìn)一步優(yōu)選為100?μm。
25、優(yōu)選的，步驟（3）中，懸浮培養(yǎng)的條件為：24~26℃、150~200?rpm懸浮培養(yǎng)1-2?h；進(jìn)一步優(yōu)選為25℃、180?rpm懸浮培養(yǎng)1.5?h。培養(yǎng)至od600值在0.8~1.0的范圍。
26、優(yōu)選的，步驟（4）中，浸染的條件為80~120?rpm，15~25?min；進(jìn)一步優(yōu)選為100rpm，20?min。
27、優(yōu)選的，步驟（4）中，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分為：mt?+?90~110?μm?as?+?20~40?g/l蔗糖+2~5%植物凝膠；進(jìn)一步優(yōu)選為mt?+?100?μm?as?+?30?g/l蔗糖+3%植物凝膠。
28、優(yōu)選的，步驟（4）中，暗培養(yǎng)的溫度為：21~25℃；進(jìn)一步優(yōu)選為23℃。
29、優(yōu)選的，步驟（5）中，水浴加熱具體為：36~38℃干式恒溫金屬浴5~7?h；進(jìn)一步優(yōu)選為37℃，6?h。
30、本發(fā)明的有益效果在于：
31、1、本發(fā)明提出一種茶樹愈傷組織的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建方法，以‘龍井43’愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，表達(dá)載體選擇帶gus標(biāo)簽的pbi121，農(nóng)桿菌感受態(tài)選擇gv3101。探究懸浮培養(yǎng)時(shí)間、懸浮培養(yǎng)基種類、共培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)gus表達(dá)量的影響，篩選高效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化條件，為茶樹穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。而本發(fā)明通過(guò)摸索并優(yōu)化篩選條件，能夠獲得的帶gus藍(lán)斑的愈傷組織成功率100%。
32、2、本發(fā)明提出一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹愈傷組織瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體包括：將愈傷組織懸浮培養(yǎng)一定時(shí)間，隨后作為轉(zhuǎn)化的受體材料：利用攜帶 35s::gus載體的gv3101農(nóng)桿菌菌株侵染愈傷組織；將侵染后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌濾紙上風(fēng)干，隨后轉(zhuǎn)接至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；共培養(yǎng)后利用gus組織化學(xué)染色對(duì)愈傷組織進(jìn)行鑒定，分離獲得陽(yáng)性愈傷組織。本發(fā)明構(gòu)建了茶樹愈傷組織的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化體系，為茶樹穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。
33、當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品或方法并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。