本發(fā)明涉及酶工程、基因工程與生物催化，具體地涉及一種葡萄糖淀粉酶突變體，編碼該突變體的核酸分子、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、葡萄糖作為連接植物生物資源與生物制造產(chǎn)業(yè)鏈的核心平臺化合物，廣泛應(yīng)用于燃料乙醇、生物基化學(xué)品、食品加工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，其工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)主要依賴淀粉酶法水解工藝。淀粉的酶法水解分為兩個(gè)核心步驟：第一步是液化階段。通過α-淀粉酶在95-105℃、ph6-6.5條件下將淀粉切割為糊精，降低體系黏度；第二步是糖化階段，通過葡萄糖淀粉酶（ec?3.2.1.3）從糊精非還原末端依次水解α-1,4和α-1,6糖苷鍵，最終生成葡萄糖。
2、葡萄糖淀粉酶，俗稱糖化酶，是淀粉深加工產(chǎn)業(yè)鏈的核心工業(yè)用酶，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于淀粉制糖、燃料乙醇生產(chǎn)、食品加工、紡織印染、造紙等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，是全球產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的工業(yè)酶制劑之一。
3、上述工藝中，葡萄糖淀粉酶的催化性能直接決定了淀粉糖化效率、葡萄糖產(chǎn)率與產(chǎn)品純度。然而，天然的葡萄糖淀粉酶存在顯著的工業(yè)應(yīng)用瓶頸：其一是熱穩(wěn)定性不足，天然葡萄糖淀粉酶在65℃以上溫度環(huán)境中會(huì)快速失活，也液化階段的高溫工藝窗口不兼容，糖化前需進(jìn)行能耗巨大的降溫步驟，增加了生產(chǎn)成本與污染風(fēng)險(xiǎn)；其二是ph適應(yīng)范圍窄，天然葡萄糖淀粉酶的最適ph多為4-5.5，在中性及堿性環(huán)境中酶活會(huì)急劇下降，無法適配液化階段的弱堿性體系，需反復(fù)調(diào)節(jié)體系ph，不僅增加工藝復(fù)雜度，還會(huì)產(chǎn)生大量復(fù)鹽，影響產(chǎn)品品質(zhì)。此外，國內(nèi)高性能葡萄糖淀粉酶制劑仍大量依賴進(jìn)口，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核心基因與生產(chǎn)菌株儲備不足，嚴(yán)重制約了我國淀粉深加工產(chǎn)業(yè)的自主可控發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的天然葡萄糖淀粉酶熱穩(wěn)定性差、耐堿性不足、無法適配工業(yè)高溫堿性工藝等的缺陷，提供一種葡萄糖淀粉酶突變體，編碼該突變體的核酸分子、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞，以及該突變體的制備方法與應(yīng)用，該葡萄糖淀粉酶突變體兼具顯著提升的耐熱性與耐堿性，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖淀粉酶在高溫、堿性環(huán)境下的高效催化，降低了淀粉深加工工藝的能耗與成本。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種葡萄糖淀粉酶突變體，所述突變體由氨基酸序列如seq?id?no:1所示的野生型葡萄糖淀粉酶發(fā)生突變得到，所述突變的位點(diǎn)包括：
3、（a）與耐熱性有關(guān)的突變位點(diǎn)中的任意一個(gè)：s33t、s39t、d55n、y57n、r249l、y319l、y320h、s365a、a372s、、s383a、t413r、t482g、t513e、t526s、a553s或k555a；和/或
4、（b）與耐堿性有關(guān)的突變位點(diǎn)中的任意一個(gè)：q93e、s100n、m232g、s234g、a243g、a304g、q305n、i340n、y341f、a357k、i382e、i418n、s419a、a429g或r436n。
5、優(yōu)選地，所述突變的位點(diǎn)包括y341f、t526s/q305n、t513e/q305n、或t513e/y341f。
6、本發(fā)明第二方面提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼如前所述的葡萄糖淀粉酶突變體。
7、本發(fā)明第三方面提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含如前所述的核酸分子。
8、本發(fā)明第四方面提供一種重組宿主細(xì)胞，所述重組宿主細(xì)胞包含如前所述的核酸分子或如前所述的重組表達(dá)載體。
9、本發(fā)明第五方面提供如前所述的葡萄糖淀粉酶突變體、核酸分子、重組表達(dá)載體或重組宿主細(xì)胞在淀粉基生物質(zhì)催化轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
10、優(yōu)選地，如前所述的葡萄糖淀粉酶突變體進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化的條件包括：溫度為55-85℃，更優(yōu)選為58-75℃；ph為7-10，更優(yōu)選為7.5-9。
11、通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明取得了如下所述的技術(shù)效果。
12、（1）本發(fā)明通過對野生型葡萄糖淀粉酶進(jìn)行突變設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖淀粉酶耐熱性與耐堿性的提升，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明篩選獲得的耐熱性單位點(diǎn)突變體和耐堿性單位點(diǎn)突變體的殘留酶活均較野生型有所提高，其中耐熱性殘留酶活最高提高了2.6倍，耐堿性殘留活性最高提高了2.5倍；同時(shí)，在優(yōu)選條件下獲得的雙位點(diǎn)組合突變體與野生型相比，在高溫下的殘留酶活最高提高2.244倍，在堿性下的殘留酶活最高提高3.235倍，且其半衰期也為野生型的2倍以上，實(shí)現(xiàn)了耐熱性和耐堿性的雙重提升，表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，同時(shí)也突破了現(xiàn)有技術(shù)中單一性能提升的局限，適配工業(yè)高溫堿性的工藝需求。
13、（2）本發(fā)明提供的葡萄糖淀粉酶突變體可在高溫堿性條件下高效催化淀粉水解，無需在液化后進(jìn)行降溫、調(diào)酸操作，大幅降低了冷卻能耗與酸堿輔料消耗，縮短了生產(chǎn)周期，為淀粉糖的制造進(jìn)一步降低了成本。
14、（3）本發(fā)明的應(yīng)用范圍極廣，覆蓋淀粉基生物質(zhì)催化轉(zhuǎn)化的多個(gè)工業(yè)場景，且應(yīng)用條件與工業(yè)實(shí)際工藝高度匹配，可直接替代現(xiàn)有進(jìn)口酶制劑，打破國外企業(yè)在高性能糖化酶制劑領(lǐng)域的技術(shù)壟斷，為我國淀粉深加工、生物燃料等產(chǎn)業(yè)提供核心酶制劑支撐，具有顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與產(chǎn)業(yè)意義。
1.一種葡萄糖淀粉酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列由seq?id?no:1所示的野生型葡萄糖淀粉酶發(fā)生突變得到，所述突變的位點(diǎn)包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變的位點(diǎn)包括y341f、t526s/q305n、t513e/q305n或t513e/y341f。
3.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1或2所述的葡萄糖淀粉酶突變體。
4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求3所述的核酸分子。
5.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述重組宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求3所述的核酸分子或權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述重組宿主細(xì)胞的宿主細(xì)胞為畢赤酵母、大腸桿菌、黑曲霉或米曲霉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述重組宿主細(xì)胞的宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述重組宿主細(xì)胞的宿主細(xì)胞為畢赤酵母gs115、x33、km71h或smd1168中的任意一種，優(yōu)選為畢赤酵母gs115。
9.權(quán)利要求1或2所述的葡萄糖淀粉酶突變體、權(quán)利要求3所述的核酸分子、權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求5-8中任意一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞在淀粉基生物質(zhì)催化轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶突變體進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化的條件包括：溫度為55-85℃，優(yōu)選為58-75℃；ph為7-10，優(yōu)選為7.5-9。