本發明屬于生物工程，具體涉及一種基于祖先序列重建的黃原膠裂解祖先酶及其突變體與應用。
背景技術：
1、黃原膠是革蘭氏陰性菌油菜黃單胞菌產生的一種胞外多糖。其以β-1,4-d-吡喃葡萄糖葡聚糖為主鏈，每條主鏈上連接著依次由甘露糖、葡萄糖醛酸和末端甘露糖殘基構成的側鏈，且通過α-1,3糖苷鍵與主鏈上交替出現的葡萄糖殘基相連。黃原膠具有特殊的假塑性流變特性，并且其在鹽、酸、堿及酶環境中均具備極強的穩定性，因此在食品、制藥、化妝品和石油工業中被廣泛應用。
2、黃原膠寡糖是一種在結構上與天然黃原膠相似，但分子量顯著降低的多糖類聚合物。與高分子量形式相比，其具有增強的溶解性、較高的抗氧化活性及良好的抑菌作用等，因此在食品、制藥及石油工業等多個領域展現出更廣泛的應用潛力。
3、當前可以通過物理、化學和酶法這三種方法，來對黃原膠進行降解。物理法降解因其降解過程中易引發分子支化與交聯等副反應，故通常作為輔助手段與其他降解方法聯合使用；化學降解法因其降解過程難以精確控制和消耗大量化學試劑，可能導致最終產物存在安全隱患；酶法降解因其具有反應特異性強、對環境影響小的優勢逐漸受到研究者的關注。目前已報道的黃原膠降解酶最適溫度通常在30?~?40℃，熱穩定性較差。在三次采油化學驅中需要注入黃原膠等高聚物，結束后降解黃原膠避免其在油層中長期過度滯留導致滲透率下降或油層堵塞，需要耐溫性好的降解酶以滿足工業適用性。
4、祖先序列重建是一種新興的、極具潛力的計算策略，它基于系統發育分析，獲取現有酶的推斷祖先序列。所設計的祖先酶往往表現出更高的熱穩定性或/和更寬的底物范圍。gu等人通過祖先序列重建成功挖掘到了熱穩定性顯著提高的祖先腈水解酶。此外，zhu等人通過祖先序列重建揭示了亞胺還原酶立體選擇性的進化機制。因此通過祖先序列重建技術獲得祖先酶的方法來提高黃原膠裂解酶的熱穩定性以及活性具有重要的研究價值。
技術實現思路
1、本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種黃原膠裂解祖先酶ancxly196。
2、本發明還要解決的技術問題是提供所述黃原膠裂解祖先酶ancxly196的突變體ancxly196-x7。
3、本發明還要解決的技術問題是提供編碼所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的核酸分子。
4、本發明還要解決的技術問題是提供含有編碼所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的核酸分子的表達盒或重組表達載體。
5、本發明還要解決的技術問題是提供含有所述的表達盒或重組表達載體的重組菌。
6、本發明最后要解決的技術問題是提供所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7在制備黃原膠寡糖中的應用。
7、為了解決上述技術問題，本發明提供的技術方案如下：
8、本發明第一方面提供了一種黃原膠裂解祖先酶ancxly196，其氨基酸序列如seqid?no.2所示。
9、將來自芽孢桿菌（ bacillussp.gl1）的黃原膠裂解酶xanthan?lyase（xly）的如seqid?no.1所示的氨基酸序列錄入uniprot（https://www.uniprot.org）和ncbi（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）網站中，篩選獲得同源序列，用iq-tree軟件確定氨基酸替換模型并構建系統發育樹，基于pamlx軟件包進行祖先序列重建，克隆表達系統發育樹中節點196所對應的蛋白序列，該節點代表了目標黃原膠裂解酶類群的最近共同祖先。經過酶的表達和酶學性質表征，證實黃原膠裂解祖先酶ancxly196是一種熱穩定性提高的黃原膠裂解酶，其核苷酸序列全長2715堿基，編碼905個氨基酸，其核苷酸序列如seq?id?no.3所示，編碼的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。所述黃原膠裂解祖先酶ancxly196與來自芽孢桿菌( bacillus?sp.gl1)的黃原膠裂解酶（xanthan?lyase）有69.25％的序列相似性。
10、本發明第二方面提供了黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7，其氨基酸序列與seq?id?no.2具有至少99%的序列同一性。
11、優選地，所述黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7，其氨基酸序列與seq?idno.2具有99.2%的序列同一性。
12、最優選地，所述黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7為，將seq?id?no.2的第73位的谷氨酸突變為精氨酸、第120位的絲氨酸突變為亮氨酸、第135位的天冬氨酸突變為賴氨酸、第230位的酪氨酸突變為谷氨酰胺、第236位的谷氨酰胺突變為天冬氨酸、第399位的天冬氨酸突變為脯氨酸以及第589位的纈氨酸突變為丙氨酸獲得；所述黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
13、基于黃原膠裂解祖先酶ancxly196，進一步通過分子對接、分子動力學模擬與能量殘基分解等計算設計方法，對關鍵位點進行理性改造，最終獲得一株高性能組合突變體ancxly196-x7，其突變位點為e73r、s120l、d135k、y230q、q236d、n399p和v589a，氨基酸序列如seq?id?no.4所示，核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
14、所述黃原膠裂解祖先酶及其突變體的最適催化溫度從野生型黃原膠裂解酶的40℃提升至45℃；黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7相比于黃原膠裂解祖先酶ancxly196具有更好的熱穩定性，在45?~?55℃處理12?~?24?h后酶活性保留50?~?80%，而所述黃原膠裂解祖先酶ancxly196在相同條件下酶活保留0%。
15、本發明第三方面提供了編碼所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的核酸分子。
16、在一些實施例中，編碼所述黃原膠裂解祖先酶ancxly196的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；編碼所述黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
17、本發明第四方面提供了含有編碼所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的核酸分子的表達盒或重組表達載體。
18、在一些實施例中，所述重組表達載體的出發載體為pet系列載體、pht系列載體、pbe系列載體和ppic系列載體中的任意一種，優選為pet-22b。
19、本發明第五方面提供了含有所述的表達盒或重組表達載體的重組菌。
20、在一些實施例中，所述重組菌的出發菌為大腸桿菌、芽孢桿菌和畢赤酵母中的任一種，優選為大腸桿菌 e.colibl21(de3)。
21、本發明第六方面提供了所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7在制備黃原膠寡糖和/或降解黃原膠中的應用。
22、在一些實施例中，將所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7應用于制備黃原膠寡糖和/或降解黃原膠的方法包括如下步驟：以黃原膠為底物，利用所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7催化所述黃原膠降解，即生成所述黃原膠寡糖。
23、在一些實施例中，利用所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7催化所述黃原膠降解時，催化的反應條件為：溫度為30?~?50℃，ph值為4?~?9。
24、在一些實施例中，利用所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7催化所述黃原膠降解時，催化的反應條件為：溫度為40?~?50℃，ph值為5?~?8。
25、在一些實施例中，生產所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的方法包括如下步驟：
26、（1）將所述黃原膠裂解祖先酶ancxly196或黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的編碼基因與質粒pet-22b連接，得重組表達載體，將其導入大腸桿菌bl21(de3)中，得重組菌株。
27、（2）培養步驟（1）所述重組菌株，誘導所述黃原膠裂解祖先酶ancxly196或黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的編碼基因表達。
28、（3）收集步驟（2）培養結束后所得菌體，超聲破碎，固液分離，收集上清液，得黃原膠裂解祖先酶ancxly196或黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的粗酶液。
29、在一些實施例中，生產所述的黃原膠裂解祖先酶ancxly196或所述的黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的方法還包括分離純化步驟，所述的分離純化步驟包括如下步驟：
30、（ⅰ）將所述黃原膠裂解祖先酶ancxly196或黃原膠裂解祖先酶突變體ancxly196-x7的粗酶液以0.5?~?5?ml/min的流速上樣至經結合緩沖液平衡的鎳離子親和層析柱，收集穿透液重復上樣一次。
31、（ⅱ）采用含50?mm和100?mm咪唑的洗滌緩沖液各洗滌5?~?15個柱體積以去除雜蛋白。
32、（ⅲ）用含150?~?500?mm咪唑的洗脫緩沖液洗脫并收集目標蛋白峰，最后將洗脫液用超濾離心管進行脫鹽和濃縮處理，獲得純化的黃原膠裂解酶或其突變體。
33、有益效果：
34、本發明采用祖先序列重建技術，基于系統發育分析推斷的進化關系，通過計算設計獲得了黃原膠裂解祖先酶，相較于野生型黃原膠裂解酶，其酶活與熱穩定性均顯著提升。其中，祖先酶ancxly196的最適反應溫度較野生型酶提高5℃，達到45℃，且在45℃下保溫2h后酶活性未見明顯下降，而野生型酶在相同條件下幾乎完全失活。在此基礎上，本發明通過理性設計獲得黃原膠裂解祖先酶的突變體ancxly196-x7，相同條件下，其黃原膠降解活性達到祖先酶的2.5倍，且熱穩定性進一步提升：在45?~?55℃處理12?~?24?h后酶活性保留50?~?80%，而所述祖先酶在相同條件下酶活保留0%。