本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，尤其涉及一種柯薩奇病毒a16基因亞型的快速檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
1、
2、基于vp?1基因編碼區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，cv-a16存在3種基因型（a、b和d基因型）。基因型a由1951年在南非分離的原型株g-10組成，基因型b分為兩個(gè)亞基因型（b1和b2型），它們之間有12%的遺傳差異。基因型d是cv-a16的一個(gè)新基因型，與b1、b2亞基因組和基因型a相比，分別有16.7%、16.2%和31.2%的遺傳差異。基因型b1又可分為b1?a、b1?b和b1?c三個(gè)基因亞型。在我國(guó)，cv-a16流行的基因型基本為b1a和b1b型；近兩年b1?c型由零散傳播逐步上升，2024年開始，cv-a16呈現(xiàn)b1a、b1b和b1c三種亞基因型共同循環(huán)傳播。由于各亞基因型間的抗原性差異，不同cv-a16亞基因型在傳播能力、毒力?/?致病性、抗原性與免疫逃逸上存在顯著差異，直接影響該病毒的流行特征與疾病嚴(yán)重程度，為進(jìn)一步控制cv-a16的流行，需要對(duì)cv-a16的亞基因型進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并對(duì)研制具有交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答的腸道病毒多價(jià)疫苗提供科學(xué)依據(jù)，以改善腸道病毒的診斷，監(jiān)測(cè)腸道病毒數(shù)據(jù)并防止腸道病毒傳播。
3、現(xiàn)有技術(shù)中，cv-a16基因型的確定需要測(cè)定vp1基因全長(zhǎng)序列，基于vp?1基因編碼區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。雖然該方法是腸道病毒基因型檢測(cè)的?“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，基于測(cè)序的檢測(cè)方法靈敏度低，不適合用于大量標(biāo)本的快速篩選。為了高效快速地區(qū)分cv-a16三種常見亞基因型，評(píng)估其傳播能力及致病性，本發(fā)明采用taqman探針法技術(shù)開發(fā)了一種用于鑒別cv-a16?三種亞基因型（b1a、b1b和b1c）的分型檢測(cè)試劑盒，目的是獲得一種比測(cè)序法鑒別基因型操作更簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，靈敏度更高的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、耗時(shí)短且靈敏度高的cv-a16基因型分型檢測(cè)試劑盒，通過提供一系列引物探針組合，用于特異性檢測(cè)柯薩奇a16病毒vp1基因突變，可以同時(shí)識(shí)別柯薩奇a16病毒不同基因亞型（b1a、b1b或b1c），防止?jié)撛诘膹V泛感染和疾病負(fù)擔(dān)。
2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：提供一種呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括如下3組引物探針組合中的至少一組：所述第一組引物探針組合用于檢測(cè)cv-a16亞基因型b1a和亞基因型b1b,?上、下游引物如seo?id?no:1和seo?idno:2所示，其探針如seo?id?no:3所示；所述第二組引物探針組合用于檢測(cè)cv-a16亞基因型b1b，上、下游引物如seo?id?no:4和seo?id?no:5所示，其探針如seo?id?no:?6所示；所述第三組引物探針組合用于檢測(cè)cv-a16亞基因型b1c，上、下游引物如seo?id?no:7和seo?idno:8所示，其探針如seo?id?no:9所示；
3、優(yōu)選的，這3組引物及探針組合中，各引物在反應(yīng)體系中的濃度相同，各探針在反應(yīng)體系中的濃度也相同。
4、優(yōu)選的，所述探針序列seo?id?no:3，探針序列seo?id?no:6和探針序列seo?idno:9的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
5、優(yōu)選的，所述序列seo?id?no:3的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)為cy5，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為nfq-mgb；所述序列seo?id?no:6的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)為fam，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為nfq-mgb；所述序列seo?id?no:9的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)為fam，5’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為nfq-mgb。
6、優(yōu)選的，3組引物及探針組合中，各引物在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1-1.0?μm，各探針在反應(yīng)體系中的終濃度為?50-250?nm。
7、優(yōu)選的，所述試劑盒中還包含逆轉(zhuǎn)錄酶、rna酶抑制劑、taq?dna聚合酶、dntp/dutp混合物。
8、優(yōu)選的，所述試劑盒中還包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。
9、本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明所提供的試劑盒首次采用taqman?探針法，以柯薩奇病毒a16的vp1基因?yàn)榘行蛄校鶕?jù)本實(shí)驗(yàn)室積累的柯薩奇a16?vp1基因序列與genbank?數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的序列進(jìn)行blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)cva16?b1a、b1b和b1c基因亞型專屬突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)cva16?b1a基因型和b1b基因型專屬突變位點(diǎn)g546a的突變型引物，針對(duì)cva16?b1b基因型專屬突變位點(diǎn)a265c和g267t位點(diǎn)的突變型引物，針對(duì)cva16?b1c基因型專屬突變位點(diǎn)t126c的突變型引物，探針采用不同熒光進(jìn)行標(biāo)記，采用qrt-pcr實(shí)現(xiàn)對(duì)cva16?不同基因型的檢測(cè)。即針對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因亞型判定。
10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：
11、（1）特異性強(qiáng)：通過特異性實(shí)驗(yàn)及大量樣本的驗(yàn)證顯示：本方法特異性強(qiáng)與傳統(tǒng)的測(cè)序法基于vp?1基因編碼區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析結(jié)果一致。
12、（2）靈敏度高：本發(fā)明所述試劑盒靈敏度高，靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的測(cè)序法基于vp?1序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析的方法。最低檢測(cè)線低于50拷貝/反應(yīng)。
13、（3）成本低，通量高，快速省時(shí)，操作簡(jiǎn)單：運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室常用的qpcr儀等即可完成，減少操作步驟。比測(cè)序法耗時(shí)短，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果比對(duì)一致性高達(dá)100%；并且有效降低成本，與測(cè)序法比，可一次性分析更多樣本。
1.一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下3組引物探針組合中的至少一組：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，3組引物及探針組合中，各引物在反應(yīng)體系中的濃度相同，各探針在反應(yīng)體系中的濃度也相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述探針序列seo?id?no:3，探針序列seo?id?no:6和探針序列seo?id?no:9的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述探針序列seo?id?no:3，探針序列seo?id?no:6和探針序列seo?id?no:9兩端分別帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；熒光基團(tuán)選自?fam、hex、vic、tet、tamra、rox、cy3.5、cy5中的任意一種或幾種；淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、?bhq3、dabcyl、mgb中的任意一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述序列seo?id?no:3的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)為cy5，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為nfq-mgb；所述序列seo?idno:6的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)為fam，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為nfq-mgb；所述序列seo?id?no:9的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)為fam，5’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為nfq-mgb。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，3組引物及探針組合中，各引物在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1-1.0μm，各探針在反應(yīng)體系中的終濃度為50-250?nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含逆轉(zhuǎn)錄酶、rna酶抑制劑、taq?dna聚合酶、dntp/dutp?混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3一種柯薩奇病毒a16基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含各基因亞型的陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。