本發明涉及生物檢測，具體的說，涉及一種丙型肝炎病毒核心抗原檢測試紙條及試劑盒。
背景技術：
1、丙型肝炎病毒（hcv）急性感染后丙型肝炎病毒rna早于抗丙型肝炎病毒抗體出現于血液中。丙型肝炎病毒rna最早可于暴露后2周檢出，丙型肝炎病毒核心抗原可在丙型肝炎病毒rna出現后1-2天檢出，而抗丙型肝炎病毒直到8-12周才能檢出，也就是說，在丙型肝炎病毒感染發生后，有約8-12周的時間，僅能檢出丙型肝炎病毒rna，而抗丙型肝炎病毒抗體為陰性，即抗丙型肝炎病毒抗體檢測的“窗口期”。如果僅僅檢測抗-hcv抗體就會漏檢，不能實現丙型肝炎的早期診斷，同時給臨床輸血帶來潛在威脅。丙型肝炎病毒核心抗原作為hcv感染者體內出現的早期感染的標志，幾乎與丙型肝炎病毒rna同時出現。
2、對于慢性丙型肝炎，臨床多經使用抗hcv抗體進行初篩，但其具有“窗口期”長等不足，此外，各廠家試劑間的特異性、敏感性存在一定差異，直接影響檢查結果，且抗體產生后長期存在，即使結果呈陽性，亦無法準確區分患者是既往感染或現癥感染。
3、hcv核心抗原的檢測方法有核酸檢測法、免疫檢測法等。目前國外已經發展到了抗原抗體聯合檢測，即在檢測抗hcv抗體的同時對hcv核心抗原（core?antigen）進行檢測。能夠在病毒抗體產生之前檢測出core抗原陽性的感染者。國內產品還處于起步階段，因此研發高質量的hcv核心抗原檢測試劑具有重要的臨床意義和經濟價值。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供一種丙型肝炎病毒核心抗原檢測試紙條及試劑盒，在標記過程中巰基類還原試劑（β-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、異硫氰酸胍等）的加入，將蛋白質中二硫鍵還原，阻止蛋白質中的半胱氨酸之間形成蛋白質分子間二硫鍵，防止反應中非特異性的發生，進而提升試劑特異性，非特異性反應減少，有效反應度增強，靈敏度提高。
2、引入生物素放大系統，結合位點增多，在試劑上體現在陽性顯色度加深，提高靈敏度，且生物阻斷劑單獨處理阻斷劑墊進行使用，與樣本充分反應，同時可調節樣本流速，增加反應時間，提高試劑靈敏度的基礎上，增加阻斷劑與樣本的反應時間，降低假陽率。
3、本發明制備的檢測試紙條、試劑盒操作方便、簡單、可有效進行hcv感染者早期的輔助診斷。
4、為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：一種丙型肝炎病毒核心抗原檢測試紙條，包括底板，底板上從左到右依次設有吸水層、硝酸纖維素反應膜、金標抗體反應層、生物素化抗體反應層、阻斷劑反應層、樣品墊層，金標抗體反應層為固相化的丙型肝炎病毒單克隆核心抗體-膠體金復合物層，制備方法如下：
5、1）采用檸檬酸三鈉還原法制備80nm膠體金溶液；
6、2）取制備好的膠體金溶液100ml，調節ph5.0-6.0，在膠體金溶液中緩慢加入0.5mg丙型肝炎病毒單克隆核心抗體；
7、3）加入10%?bsa封閉劑；
8、4）充分反應后，以5000-8000rpm離心30分鐘，棄上清，然后加入1ml金復溶液靜置30-40min，制得丙型肝炎病毒單克隆核心抗體-膠體金復合物；
9、5）將丙型肝炎病毒單克隆核心抗體-膠體金復合物中加入10-20μl?8mmol/ml二硫蘇糖醇，反應10-30min，按1:5用金復溶液進行稀釋，按45-60μl?/cm2均勻涂布于玻璃纖維上，50℃烘干過夜備用。
10、作為一種優化方案，所述8mmol/ml二硫蘇糖醇的制備方法為：稱取12.3g二硫蘇糖醇加入到10ml?pbs中，配置成8mmol/ml二硫蘇糖醇溶液。
11、作為一種優化方案，所述金復溶液配置方法為：100mmol/l的tris緩沖液中加入質量百分比為0.7%的酪蛋白、質量百分比為0.3%的tween-20、質量百分比為2%的蔗糖、質量百分比為3%的海藻糖、質量百分比為1%的peg20000。
12、作為一種優化方案，所述生物素化抗體反應層的制備方法如下：取生物素化抗體溶液1ml，加入10μl?8mmol/ml二硫蘇糖醇，反應20-30min，用50-100mmol/l?tris緩沖液按1.2-1.5%使用濃度進行稀釋，加入質量百分比為2-4%的海藻糖，稀釋后的生物素化抗體溶液均勻涂布于玻璃纖維墊上，50℃過夜烘干。
13、作為一種優化方案，所述生物素化抗體溶液的制備方法如下：
14、1）將待生物素化的蛋白質用100mmol/l?ph?8.0碳酸氫鈉緩沖液稀釋到1mg/ml，得生物素化標記的蛋白質溶液2.0ml；
15、2）用1ml?dmso溶解nhsb?1mg，即終濃度為1mg/ml；
16、3）向生物素化標記的2.0ml蛋白質溶液中加入200μl?nhsb溶液進行交聯反應；
17、4）在室溫下持續攪拌，保溫2-4小時；
18、5）加入8μl1mol/l?nh4cl，即每25μg?nhsb加1μl1mol/l?nh4cl，在室溫下攪拌10分鐘；
19、6）在4℃，對5）所得液體在pbs中充分透析，以除去游離的生物素；
20、7）將透析后液體上1ml的分子篩柱，以pbs緩慢洗脫，收集1ml/管，蛋白質在1-3?ml之間洗下；
21、8）在7）所得液體中加入終濃度為0.5g/l疊氮鈉及1.0g/l?bsa，得生物素化抗體溶液。
22、作為一種優化方案，所述阻斷劑反應層的制備方法為：取hbr-x、hbr-5、hbr-7阻斷劑，使用50-100mmol/l?tris緩沖液分別稀釋混合，終濃度均為0.7mg/ml，加入質量百分比為1-2%的海藻糖，稀釋后的阻斷劑溶液均勻涂布于玻璃纖維上，50℃過夜烘干。
23、作為一種優化方案，所述樣品墊層的制備方法如下：樣品墊處理液涂布于玻璃纖維上，干燥得樣品墊層，樣品墊處理液是由100mm?ph9.2的硼酸緩沖液、質量百分比為0.3%的大分子聚合物peg20000、質量百分比為0.3-0.5%的s17、質量百分比為0.2-0.6%的曲拉通x-100、質量百分比為0.1-0.4%的蔗糖、質量百分比為0.2%的bsa配置而成。
24、作為一種優化方案，所述硝酸纖維素反應膜上設有檢測t線和質控c線，檢測t線以鏈霉親和素包被，濃度為2.0mg/ml，質控c線以羊抗雞igg抗體包被，濃度為2.0mg/ml，均用100mmol/l的tris緩沖液進行稀釋，并加入質量百分比為2%的蔗糖、質量百分比為0.5%的edta，依次包被于硝酸纖維素反應膜上，并于37℃密閉環境中干燥6h。
25、作為一種優化方案，?所述吸水層的一端搭接在硝酸纖維素反應膜的一端上，金標抗體反應層的一端搭接在硝酸纖維素反應膜的另一端上，生物素化抗體反應層的一端搭接在金標抗體反應層的另一端上，阻斷劑反應層的一端搭接在生物素化抗體反應層的另一端上，樣品墊層的一端搭接在阻斷劑反應層的另一端上。
26、作為一種優化方案，一種丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒，包括所述的試紙條和樣本稀釋液，樣本稀釋液由100mm?ph7.0-7.5的pb緩沖液、質量百分比為0.3%bsa、質量百分比為0.1%吐溫80以及防腐劑配制而成。
27、本發明采取以上技術方案，具有以下優點：
28、1、傳統的膠體金標記方法中，在膠體金溶液中加入丙型肝炎病毒單克隆核心抗體，反應后離心，棄上清，復融，即可完成。本發明在復融前，加入二硫蘇糖醇，在保證膠體金穩定的基礎上，其可將丙型肝炎病毒單克隆核心抗體蛋白質二硫鍵還原，阻止蛋白質中的半胱氨酸之間形成蛋白質分子間二硫鍵，防止反應中蛋白聚沉，以及膠體金的聚集，發生非特異性。且與其他蛋白之間無干擾，在試劑上表現為無非特異性假陽出現，提升試劑特異性；與此同時，有效結合位點增多，在試劑上體現在陽性顯色度加深，靈敏度提高。
29、2、傳統的膠體金試劑中，硝酸纖維素反應膜檢測線位置包被丙型肝炎病毒單克隆核心抗體，與膠體金標記的丙型肝炎病毒單克隆核心抗體構成雙抗體夾芯法檢測丙型肝炎病毒核心抗原。本發明在硝酸纖維素反應膜檢測線位置包被了鏈霉親和素，同時增加了生物素化丙型肝炎病毒單克隆核心抗體墊，在雙抗體夾芯法基礎上，引入生物素放大系統，結合位點增多，在試劑上體現在陽性顯色度加深，提高靈敏度。
30、3、傳統的膠體金試劑中生物阻斷劑主要添加到樣品墊中。本發明生物阻斷劑單獨處理阻斷劑墊進行使用，在與樣本充分反應的基礎上，可調節樣本流速，增加反應時間，提高試劑靈敏度的基礎上，增加阻斷劑與樣本的反應時間，降低假陽率。
31、本發明提高了試劑的靈敏度，并解決了非特異性反應引起的試劑假陽性提升了產品的特異性，使用方便，操作簡單，儲存方便，有效期長。
32、下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步說明。