苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物作為植物中蛋白水解活性的調(diào)節(jié)劑的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物作為植物中蛋白水解活性的調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物改變植物中酶活性的用途。
背景技術(shù)：
胡椒基丁醚是一種苯并間二氧雜環(huán)戊烯聚氧乙烯，已知其有時(shí)可作為殺蟲(chóng)劑例如除蟲(chóng)菊酯、擬除蟲(chóng)菊酯和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的增效劑。
胡椒基丁醚對(duì)人和動(dòng)物的毒性較低且其具有對(duì)廣譜殺蟲(chóng)劑的顯著作用，因此得以在農(nóng)業(yè)中迅速推廣使用。
盡管一次又一次針對(duì)在其所增效的殺蟲(chóng)劑分子的滅活和分解代謝中涉及的某些特定酶的直接或間接調(diào)節(jié)作用，該增效作用的核心機(jī)制尚未闡明，例如存在于昆蟲(chóng)勻漿中的非特異性酯酶(胡椒基丁醚“Theinsecticide Synergist”，1998，Academic Press，p.215)，更近期地對(duì)微粒體氧化酶(Alzogaray R.A.Arch.Insect Biochem.Physiol.，2001，46119-126)，或?qū)?xì)胞色素P450單加氧酶(Kotze等，Int.J.Parasitol，1997，2733-40)。然而，迄今為止尚未報(bào)道PBO對(duì)植物源性酶的作用，更沒(méi)有具體關(guān)于對(duì)蛋白水解酶或肽酶類(lèi)酶作用的報(bào)道。
蛋白酶和其生理抑制劑作為在動(dòng)物界和植物界中的細(xì)胞進(jìn)程調(diào)節(jié)中關(guān)鍵酶的重要性已為公眾所知并得到廣泛的認(rèn)可。
例如，植物中蛋白水解酶和天然抑制劑間的平衡是休眠種子發(fā)芽過(guò)程的精確時(shí)序調(diào)節(jié)的核心。
已知在進(jìn)化過(guò)程中，植物選擇合成蛋白水解酶的天然抑制劑(除其它因素外)作為抵御寄生蟲(chóng)的保護(hù)機(jī)制。例如Harsulkar A.M.等(PlantPhysiol.，1999，121497-506)已經(jīng)證實(shí)了基于該類(lèi)途徑的干預(yù)的有效性。EP 502730和EP 339009中描述了基于使用轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白酶抑制劑的方法首先抑制劑的表達(dá)足以確立抵御線蟲(chóng)的保護(hù)作用，其次，天然蛋白酶抑制劑的轉(zhuǎn)基因表達(dá)加強(qiáng)編碼Bt毒素(蘇蕓金桿菌毒素)的最初基因的產(chǎn)物的殺蟲(chóng)劑作用。S.Macintosh等(J.Agric.FoodChem.1990，381145-1152)描述了相同的方法。
因此，很明顯具有植物源性蛋白水解酶的可調(diào)節(jié)的活性的產(chǎn)品的實(shí)用性對(duì)于廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域具有高度的工業(yè)價(jià)值。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是式I的苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物，優(yōu)選胡椒基丁醚(PBO)作為植物中蛋白水解酶活性或含量調(diào)節(jié)劑的用途。能夠水解肽鍵的蛋白水解酶優(yōu)選自羧肽酶、氨肽酶、二肽酶、內(nèi)肽酶。
用苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物處理植物，優(yōu)選用具有殺昆蟲(chóng)功能的蛋白，優(yōu)選屬于蘇蕓金桿菌毒素(Bt-毒素)類(lèi)，屬于Cry族的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的植物。
所述轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選為棉花、玉米、番茄、馬鈴薯和大豆，或更優(yōu)選為棉花。
本發(fā)明的另一方面涉及含有苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物的組合物作為活性成份與適用的乳化劑和可選地與選自苯并三唑、二苯甲酮和空間位阻胺的光保護(hù)化合物聯(lián)合作為植物中蛋白水解酶活性或含量調(diào)節(jié)劑的用途。
本發(fā)明另一方面涉及調(diào)節(jié)植物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物，更優(yōu)選棉花、玉米、番茄、大豆、馬鈴薯中蛋白水解活性的方法，基本上包括用苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物和含有所述化合物的組合物，以終濃度包含50～500克/公頃的PBO并在生長(zhǎng)周期末施用的方式處理所述植物。


圖1.顯示了用Dixon圖確定濃度漸增的PBO對(duì)木瓜蛋白酶活性的抑制。
從獲自分別以1.5×10-4M(實(shí)心圓-●-)和6×10-5M(空心圓-○-)使用的兩種不同底物濃度(CBZL賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯)的Dixon圖中，可以計(jì)算出PBO對(duì)木瓜蛋白酶的抑制常數(shù)(Ki)，等于2.6×10-3M。此外，從圖中可以計(jì)算出IC50等于2×10-3M。
橫坐標(biāo)PBO濃度(M)；縱坐標(biāo)1/V(ΔAbs/分鐘)。ISO-AOT50mM反膠束法(Reverse micelles assay)(AOT雙倍噴霧(doubleaerosol)(2-乙基己基磺基琥珀酸鈉于異辛烷(ISO)中)；Wo(H2O/AOT)＝23圖2.顯示了用Dixon圖確定濃度漸增的PBO對(duì)無(wú)花果蛋白酶活性的抑制。
從獲自分別以1.5×10-4M(實(shí)心園-●-)和6×10-5M(空心園-○-)使用的兩種不同底物濃度(CBZL賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯)的Dixon圖中，可以計(jì)算出PBO對(duì)無(wú)花果蛋白酶的抑制常數(shù)(Ki)，等于0.45×10-3M。此外，從圖中可以計(jì)算出IC50等于0.8×10-3M。
橫坐標(biāo)PBO濃度(M)，縱坐標(biāo)1/V(ΔAbs/分鐘)。ISO-AOT50mM反膠束法(AOT雙噴霧(twin aerosol)(磺基琥珀酸鈉2-乙基己基酯于異辛烷(ISO)中)；Wo(H2O/AOT)＝25圖3.顯示了用Dixon圖確定濃度漸增的PBO對(duì)波蘿蛋白酶活性的抑制。
從獲自分別以1.5×10-4M(實(shí)心園-●-)和6×10-5M(空心園-○-)使用的兩種不同底物濃度(CBZL賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯)的Dixon圖中，可以計(jì)算出PBO對(duì)波蘿蛋白酶的抑制常數(shù)(Ki)，等于0.1×10-3M。此外，從圖中可以計(jì)算出IC50等于0.4×10-3M。
橫坐標(biāo)PBO濃度(M)，縱坐標(biāo)1/V(ΔAbs/分鐘)。ISO-AOT50mM反膠束法(AOT雙噴霧(磺基琥珀酸鈉2-乙基己基酯于異辛烷(ISO)中)；Wo(H2O/AOT)＝28圖4.發(fā)芽4日后棉花芽中的羧肽酶活性。
通過(guò)在用TCA沉淀蛋白并離心分離后于石英比色杯中確定280nm吸光度測(cè)定將丙酮粉末在pH6.5水性緩沖液中混懸后30′，60′，90′和120′時(shí)棉花芽中蛋白水解活性程度。
每組分析按一式兩份實(shí)施。采用每組分析的平均值比較處理的和未處理的樣品中的羧肽酶活性值。
處理的樣品深灰未處理的樣品淺灰圖5.發(fā)芽4日后棉花芽中的內(nèi)肽酶活性。
通過(guò)在用TCA沉淀蛋白并離心分離后于石英比色杯中確定280nm吸光度測(cè)定將丙酮粉末在pH7.7水性緩沖液中溶解后15′，30′，60′，90′和120′時(shí)棉花芽中水解活性程度。
每組分析按一式兩份實(shí)施。采用每組分析的平均值比較處理的(深灰色)和未處理的(淺灰色)樣品中的羧肽酶活性值。橫坐標(biāo)時(shí)間(分鐘)；縱坐標(biāo)Abs 280nm。
圖6.經(jīng)PBO處理的對(duì)比未經(jīng)PBO處理的棉花植物中的Bt含量。
采用免疫酶測(cè)定法確定植物發(fā)育不同階段的Bt水平。
a)檢測(cè)的Bt毒素值；縱坐標(biāo)以ppm表示的Bt；橫坐標(biāo)植物培育天數(shù)和不同植物組織。黑色未處理的棉花；灰色PBO處理的棉花。還顯示了標(biāo)準(zhǔn)差。
b)在生長(zhǎng)期間，PBO處理的對(duì)比未處理的植物中Bt含量的差異百分?jǐn)?shù)。縱坐標(biāo)PBO處理的植物中的Bt含量百分?jǐn)?shù)(ppm)減去未處理植物中的含量；橫坐標(biāo)植物培育天數(shù)和不同植物組織(子葉或葉)。
圖7.通過(guò)輻射擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(Radial Diffusion Assay)比較不同的生長(zhǎng)階段的PBO處理的和未處理的棉花植物的內(nèi)肽酶活性。
將由植物提取物產(chǎn)生的亮區(qū)(clear zone)半徑與獲自胰蛋白酶連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。將胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液用于繪制每一樣品板的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此以胰蛋白酶等效物單位表示內(nèi)肽酶活性。對(duì)每一提取物，采用Biuret法測(cè)定可溶蛋白的量(mg)，然后以特異性活性即單位/可溶蛋白mg表示酶活性。橫坐標(biāo)時(shí)間(天)；縱坐標(biāo)胰蛋白酶單位/可溶蛋白mg。
圖8.通過(guò)采用DL-BAPA作為底物的光度測(cè)定法比較PBO處理的和未處理的棉花植物間的肽酶活性(U/可溶蛋白mg)。
DL-BAPA水解后于410nm實(shí)施光度測(cè)定。以能夠于pH8.2和30℃以410nm/分鐘產(chǎn)生一單位吸光度變量的酶量定義一個(gè)肽酶單位(U)。
對(duì)每一提取物，采用Biuret法測(cè)定可溶蛋白的量(mg)，然后以特異性活性即單位/可溶蛋白mg表示酶活性。
每一分析均按一式兩份或一式三份實(shí)施，還顯示了每個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)差。橫坐標(biāo)時(shí)間(天)；縱坐標(biāo)胰蛋白酶單位/可溶蛋白mg。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及如下通式I所含的苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物的用途 其中R1、R2和R3是相同或不同地選自氫、C2-C8烷基；CH2OR4，其中R4選自氫、-(CH2CH2O)n-R5，其中n為1～4的整數(shù)且R5選自氫、C1-C8烷基、無(wú)取代基的或由C1-C4烷基、鹵素、氰基基團(tuán)(CN)、-SO3H基團(tuán)、羧基烷基團(tuán)-COOR6(其中R6為氫或C1-C8烷基)或-N(R7)-R8基團(tuán)取代的芳基，其中R7和R8相同或不同地為氫或C1-C4烷基或與其結(jié)合的氮原子一起代表哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基基團(tuán)；另外R5選自無(wú)取代基的或在芳環(huán)上由選自C1-C4烷基、鹵素、氰基基團(tuán)、-SO3H基團(tuán)、羧基烷基團(tuán)-COOR9的取代基取代的C7-C9芳烷基，其中R9定義同R6且R1、R2和R3不同時(shí)為氫，所述使用基于如下驚人的發(fā)現(xiàn)，前述定義的化合物具有調(diào)節(jié)植物蛋白水解酶活性或含量的能力。
優(yōu)選地，在上述化合物中，R1、R2和R3取代基相同或不同地選自氫、C2-C4烷基、CH2OR4，其中R4選自氫、-(CH2CH2O)n-R5，其中n為1～2的整數(shù)且R5選自氫、C1-C4烷基、芐基、無(wú)取代基的或由C1-C3烷基取代的芳基，且R1、R2和R3不同時(shí)為氫。
更優(yōu)選地，在式I的所述化合物中，R1、R2和R3取代基相同或不同地選自氫、丙基、CH2OR4，其中R4為-(CH2CH2O)2-R5，R5選自C2-C4烷基、苯基、甲苯基，且R1、R2和R3不同時(shí)為氫。更優(yōu)選與式(II)的胡椒基丁醚(PBO)或5-[[2-(2-丁氧基乙氧基)乙氧基]甲基]-6-丙基-1，3-苯并間二氧雜環(huán)戊烯相應(yīng)的化合物 我們將在下文中為簡(jiǎn)稱(chēng)提供參考，僅對(duì)于已知縮寫(xiě)為PBO的胡椒基丁醚化合物或術(shù)語(yǔ)“苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物”，應(yīng)該認(rèn)為在本申請(qǐng)中使用該縮寫(xiě)詞和該術(shù)語(yǔ)意指通式I的全部化合物，包括優(yōu)選的取代基。
出于本發(fā)明目的，術(shù)語(yǔ)蛋白酶、蛋白水解酶或肽酶以等效形式使用且意指肽水解酶(在本說(shuō)明書(shū)中將其簡(jiǎn)稱(chēng)為蛋白水解酶或蛋白酶)，即指具有對(duì)肽或不依賴(lài)其位置的酰胺鍵(故其或者位于多肽鏈內(nèi)，或者位于N-或C-末端終點(diǎn))水解活性的酶。
因此根據(jù)該定義，內(nèi)肽酶類(lèi)酶和外肽酶，如水解肽鍵從N-或C-端連續(xù)釋放單個(gè)氨基酸的氨肽酶或羧肽酶均包含于蛋白水解酶的定義中。
活性能被PBO調(diào)節(jié)的蛋白水解酶，優(yōu)選羧肽酶、氨肽酶、二肽酶、內(nèi)肽酶，其中內(nèi)肽酶優(yōu)選絲氨酸蛋白酶，胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶，金屬-內(nèi)肽酶；胱氨酸蛋白酶優(yōu)選波蘿蛋白酶、鈣蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶。
與昆蟲(chóng)和病原微生物的蛋白酶相比，植物中蛋白水解活性的調(diào)節(jié)(例如通過(guò)活化特異性抑制劑)具有主要的抵御作用。在由機(jī)械或生物方式產(chǎn)生損傷的情況下，由于植物的防御策略而新合成蛋白酶抑制劑。
抑制劑對(duì)內(nèi)源蛋白酶的調(diào)節(jié)潛能在種子中可能是適度的并在發(fā)芽期間趨于消失；重要作用要?dú)w功于抑制劑在種子成熟期間防止蛋白在累積階段的降解。因此根據(jù)其它目的，本發(fā)明包括PBO對(duì)種子蛋白水解調(diào)節(jié)活性的其它實(shí)施方案；根據(jù)其它實(shí)施方案，PBO還可用于確定在創(chuàng)傷或損傷的情況下能調(diào)節(jié)一般組織生長(zhǎng)的植物防御途徑的活性。
本說(shuō)明書(shū)所描述的針對(duì)植物細(xì)胞蛋白水解活性的新活性的其它優(yōu)勢(shì)在于調(diào)節(jié)生成、成熟或降解，或換句話說(shuō)內(nèi)源性蛋白樣物質(zhì)的翻轉(zhuǎn)(turn-over)，所述蛋白樣物質(zhì)例如是那些具有天然殺蟲(chóng)劑或殺真菌劑功能或具有組織修復(fù)功能的物質(zhì)。該機(jī)制可有助于加強(qiáng)植物細(xì)胞對(duì)可能的寄生侵襲或?qū)ν庠磯毫Φ奶烊环磻?yīng)。
Leah等(J.Biol.Chem.，1991，2661564-1573)公開(kāi)了具有殺真菌活性的物質(zhì)的實(shí)例以及此處未充分描述的核糖體滅活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins(RIP))，該蛋白具有僅針對(duì)遠(yuǎn)相關(guān)性核糖體(如真菌)的特異性，而不針對(duì)植物核糖體，或殼多糖酶和(1-3)-β-葡聚糖酶，其能阻礙真菌細(xì)胞壁的合成。由植物產(chǎn)生的，具有無(wú)活性蛋白前體形式且其成熟型具有抵抗細(xì)菌和真菌功能的其它物質(zhì)為硫堇，其已被描述于例如Bohlmann H.Critical Reviews inPlant Sciences，1994，131-16中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)已知方法將根據(jù)此處所描述的新用途的PBO處理通過(guò)集中在植物暴露于空氣中的區(qū)域，特別是在葉片上而實(shí)施于所有植物類(lèi)型。還可以對(duì)種子進(jìn)行所述處理。在其優(yōu)選實(shí)施方案中，所述處理優(yōu)選實(shí)施于選自棉花、玉米、番茄、馬鈴薯和大豆的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)該優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物在插入了編碼蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物中作為具有蛋白水解活性調(diào)節(jié)劑的用途。
在用PBO處理后，植物蛋白水解活性發(fā)生變化，該變化具有依賴(lài)于被認(rèn)為能夠增加或甚至減少蛋白的有效性或蛋白的活性形式的系統(tǒng)而不同的效果。已知，穩(wěn)態(tài)水平是蛋白降解和生成比率的結(jié)果。然而，蛋白水解作用已知還是蛋白活化的機(jī)制。結(jié)果，所述新用途能夠增加植物對(duì)寄生蟲(chóng)感染或外部侵襲的天然或人工抵抗力。因此，本發(fā)明另一且優(yōu)選的實(shí)施方案是通過(guò)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中蛋白水解活性來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白的水平。特別優(yōu)選用一種蘇蕓金桿菌毒素轉(zhuǎn)基因的植物。
特別地，在用蘇蕓金桿菌Bt毒素基因轉(zhuǎn)基因植物的情況下，控制蛋白水解作用機(jī)制的可能性對(duì)控制轉(zhuǎn)基因毒素的活性或調(diào)節(jié)其生成都是非常重要的。
然而，應(yīng)當(dāng)注意的是本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方案不限于對(duì)轉(zhuǎn)基因蛋白的單一的生成或活化機(jī)制，而可以延伸至通過(guò)對(duì)蛋白水解酶直接或間接作用(如通過(guò)蛋白酶抑制劑)而由PBO活化的所有機(jī)制。可通過(guò)直接或間接測(cè)定法監(jiān)測(cè)蛋白水解酶水平的增加。
在間接測(cè)定法中，可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測(cè)蛋白酶對(duì)各種內(nèi)源或外源底物的活性。
在轉(zhuǎn)基因植物的情況下，轉(zhuǎn)基因編碼一種蘇蕓金桿菌的Cry蛋白而更優(yōu)選編碼選自CryI，Cry II，Cry III，Cry IV，更特別為CryIA(a)，(b)或(c)的蛋白。
根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，植物為棉花且轉(zhuǎn)基因編碼蘇蕓金桿菌CryI毒素。
本發(fā)明人還觀察到在Bt Cry I蛋白轉(zhuǎn)基因的棉花中，PBO處理后轉(zhuǎn)基因毒素的量高于未處理的轉(zhuǎn)基因植物，該發(fā)現(xiàn)與在至少100天期間內(nèi)PBO-處理的植物對(duì)比未處理的植物前者蛋白水解活性的丟失相關(guān)。
因此式I的苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物作為蛋白水解調(diào)節(jié)劑的用途特別有益于在優(yōu)選自棉花、玉米、番茄、馬鈴薯或大豆的轉(zhuǎn)基因植物(優(yōu)選當(dāng)其用Bt-毒素轉(zhuǎn)基因時(shí)，更優(yōu)選用Cry I毒素轉(zhuǎn)基因時(shí))中抑制蛋白水解機(jī)制而直接或間接改變植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因Bt毒素的表達(dá)(即滅活或減少)。特別優(yōu)選用PBO處理以一種蘇蕓金桿菌毒素轉(zhuǎn)基因的棉花。
按本領(lǐng)域已知方法，例如采用Bt毒素特異性抗體實(shí)施的免疫酶測(cè)定法檢測(cè)植物中的Bt毒素水平。
可選地，通過(guò)直接檢測(cè)田間或?qū)嶒?yàn)室中寄生昆蟲(chóng)死亡率的缺少可以估計(jì)低于可用極限的Bt毒素量。
根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)植物中蛋白水解活性，優(yōu)選至少部分抑制植物的蛋白水解活性的方法，包括基本上用PBO或其衍生物或用含有PBO做為活性成分的組合物，以包括50～800克/公頃，更優(yōu)選100～400克/公頃，特別優(yōu)選200～350克/公頃的活性成分濃度處理植物。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選在每個(gè)生長(zhǎng)周期重復(fù)三次處理，更優(yōu)選在生長(zhǎng)周期結(jié)束時(shí)實(shí)施處理。
該優(yōu)選方面在植物為轉(zhuǎn)基因性且更特別當(dāng)所述棉花、玉米、番茄、馬鈴薯和大豆用蘇蕓金桿菌Cry毒素轉(zhuǎn)基因時(shí)為特別適當(dāng)?shù)摹Ｊ聦?shí)上在處理后數(shù)小時(shí)至數(shù)天，在植物生長(zhǎng)周期的不同階段可觀察到PBO的調(diào)節(jié)劑活性。
PBO對(duì)植物中蛋白酶活性的調(diào)節(jié)優(yōu)選為通過(guò)PBO對(duì)酶的直接抑制，或通過(guò)間接作用如，通過(guò)蛋白酶-抑制劑的活化或特異性蛋白酶抑制劑的新合成的負(fù)向調(diào)節(jié)。
采用含有適宜賦形劑或乳化劑的組合物可以方便地實(shí)施PBO處理。因此，根據(jù)另一目的，本發(fā)明涉及含有式I的苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物的組合物作為活性成分，或其優(yōu)選實(shí)施方案，如PBO，聯(lián)合適用的乳化劑或賦形劑和可選的光保護(hù)劑化合物，作為植物中蛋白水解酶活性或含量調(diào)節(jié)劑的用途。所使用的乳化劑選自烷基芳基磺酸鈣鹽、脂肪酸聚乙二醇酯、烷基芳基聚乙二醇醚、脂肪醇聚乙二醇醚、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷縮合物、烷基聚醚、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯。所述乳化劑特別優(yōu)選自烷基芳基聚乙二醇醚和烷基芳基磺酸鈣鹽。
所述乳化劑以2％(w/w)的最低濃度存在。
含有乳化劑或賦形劑組合物中的PBO濃度包括1～98％(w/w)，優(yōu)選20～95％，更優(yōu)選50～90％。
為了此處目的，將活性成份聯(lián)合適宜的賦形劑或乳化劑的混合物命名為“濃縮物”。在濃縮物中，可選地加入抵抗光氧化的保護(hù)劑(光保護(hù)劑)，所述保護(hù)劑選自包含苯并三唑、二苯甲酮和空間位阻胺的化合物類(lèi)，其濃度包含以濃縮物的重量比0.1％～10％，優(yōu)選0.5％～8％，更優(yōu)選1％～5％。
在苯并三唑中，化合物選自2-(2′-羥基-5-叔辛基苯基)苯并三唑和2-(2′-羥基-3′，5′-二叔丁基苯基)5-氯苯并三唑。
在二苯甲酮中，化合物選自2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮，2-羥基-4-辛基氧基二苯甲酮，2′-二羥基-4，4′-二甲氧基二苯甲酮。
在空間位阻胺中，化合物選自癸二酸二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)酯；癸二酸二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)酯；α-[[6-[[4，6-二(二丁基氨基)-1，3，5-三嗪-2-基](2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)氨基]己基](2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)氨基]-Ω-[4，6-二(二丁基氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]-聚[[6-[丁基(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)氨基]-1，3，5-三嗪-2，4-二基][2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)亞胺基]-1，6-己醛二基[2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)亞胺基]；琥珀酸二甲酯與4-羥基-2，2，6，6-四甲基-1-哌啶乙醇的聚合物；N，N′二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)-1，6-己二胺與2，4，6三氯-1，3，5-三嗪和1，1，3，3-四甲基丁胺的聚合物；聚-甲基丙基-3-氧(4((2，2，6，6-四甲基)哌啶基硅氧烷；1，3，5-三嗪-2，4，6，-三胺，N，N[1，2-乙烷二基二[[[4，6-二[丁基(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-i1]亞胺基]-3，1-橋亞丙基二基]]-二[N′，N″-二丁基-N′，N″-二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)]或下述混合物琥珀酸二甲酯與4-羥基-2，2，6，6-四甲基-1-哌啶乙醇的聚合物和N，N′二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)-1，6-己二胺與2，4，6三氯-1，3，5-三嗪和1，1，3，3-四甲基丁胺的聚合物的混合物。
特別優(yōu)選為二苯甲酮，更優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和2-羥基-4-辛基氧基二苯甲酮，而在空間位阻胺中，優(yōu)選化合物為癸二酸二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)酯和癸二酸二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)酯。
可選地，含有光保護(hù)劑的濃縮物是可乳化的，因此其可以與水混合以便獲得將進(jìn)行噴霧優(yōu)選經(jīng)田間噴撒的適宜溶液，因此PBO的濃度包括50～800克/公頃，優(yōu)選100～400克/公頃，更優(yōu)選200～350克/公頃。田間每個(gè)施用周期可包括每個(gè)生長(zhǎng)周期施用1次至3次。
通過(guò)下述非限制性實(shí)施例更好地描述本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1胡椒基丁醚對(duì)半胱氨酸內(nèi)肽酶的體外抑制在分散于有機(jī)溶劑中的反膠束法中實(shí)施檢測(cè)，Walde等已描述了所述反膠束法(Eur.J.Biochem.，1988，173401-409)，并已報(bào)道于關(guān)于用天然和人工抑制劑對(duì)胰蛋白酶抑制的動(dòng)力學(xué)研究文獻(xiàn)中。所述檢測(cè)適于下述純化的植物酶木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶和波蘿蛋白酶(分別位于Sigma catalogue N°P4762、F4125、B5144)，其中存在底物CBZ(L賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯，Sigma catalogue N°C3637)，且分別以Wo(摩爾比率水/表面活性劑或H2O/AOT)＝23，25，28實(shí)施。
現(xiàn)有文獻(xiàn)中已經(jīng)記載了用于胰蛋白酶的反膠束上的酶檢測(cè)法，且所述酶檢測(cè)法適用于不同的酶。通過(guò)在石英分光光度池中充分混合1ml含有適當(dāng)體積的蛋白酶和不同緩沖溶液的50mM AOT-ISO而獲得這些值，其中所述緩沖液分別是用于木瓜蛋白酶的MES(2-[N-嗎啉代]乙基磺酸)、用于無(wú)花果蛋白酶的HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙基磺酸])和用于波蘿蛋白酶的乙酸鹽溶液。當(dāng)溶液完全透明且明顯均質(zhì)時(shí)，將其調(diào)整為恒溫30℃。在該溶液中加入適當(dāng)體積的底物CBZ(溶解于乙腈/H2O，80∶20(v/v)，濃度為15mM)，然后再攪拌(溶液恢復(fù)透明)，采用Cary 219分光光度計(jì)在340nm處檢測(cè)吸光度的變化(Δabs)。檢測(cè)條件概括如下木瓜蛋白酶AOT-ISO50mM(二磺基琥珀酸鈉2-乙基己基酯-異辛烷)-WO23-緩沖液含有2.5mM胱氨酸的50mM MES，pH6.2，-溫度30℃-底物1.5×104M和6×10-5M CBZ(L賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯，Sigma)-木瓜蛋白酶2mg/ml-PBO(存在時(shí))4.87×10-5M～5.9×10-3M無(wú)花果蛋白酶-AOT-ISO50mM(二磺基琥珀酸鈉2-乙基己基酯-異辛烷)-Wo25-緩沖液含有2.5mM L-胱氨酸的50mM HEPES，pH7.1，-溫度30℃-底物1.5×10-4M和6×10-5M CBZ(L賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯，Sigma)-無(wú)花果蛋白酶1.7mg/ml-PBO(存在時(shí))4.87×10-4M～5.9×10-3M波蘿蛋白酶-AOT-ISO50mM(二磺基琥珀酸鈉2-乙基己基酯-異辛烷)-Wo28-緩沖液包含1mM L-胱氨酸的10mM乙酸鹽，pH4.6，-溫度30℃-底物1.5×10-4M和6×10-5M CBZ(L賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯，Sigma)-波蘿蛋白酶2mg/ml-PBO(存在時(shí))4.87×10-4M～5.9×10-3M。
以Dixon圖(例如″Quantitative Problems in Biochemistry″，EA.Dawes，5thed.1972 Baltimore，The Williams和Wilkins Company所描述的)的形式在圖1，2和3中圖解說(shuō)明得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所述圖解說(shuō)明可用于計(jì)算PBO的Ki值(抑制常數(shù))，其分別對(duì)于木瓜蛋白酶為2.6×10-3M，對(duì)于無(wú)花果蛋白酶為4.5×10-4M和對(duì)于波蘿蛋白酶為1×10-4M，因此顯示了PBO對(duì)波蘿蛋白酶的抑制較高。獲自非飽和底物濃度下的檢測(cè)結(jié)果顯示了，在這些條件下，PBO抑制了所有測(cè)試的蛋白酶。從圖1-3的Dixon圖中特別可計(jì)算出PBO對(duì)木瓜蛋白酶系統(tǒng)的IC50等于2×10-3M，對(duì)無(wú)花果蛋白酶的IC50等于0.8×10-3M和對(duì)波蘿蛋白酶等于0.4×10-3M。
實(shí)施例2.PBO對(duì)波蘿蛋白酶的抑制。
按Heinrikson & Kezdy所述(1976，Methods in Enzymol.45，740頁(yè))實(shí)施所述檢測(cè)。此處簡(jiǎn)要概括了檢測(cè)條件在3ml含有KCl(0.1M)和L-胱氨酸(1mM)，pH4.6的10mM乙酸鹽緩沖液中50μg波蘿蛋白酶與變量的Na CBZ-L-賴(lài)氨酸-對(duì)-硝基苯基酯底物混合。通過(guò)H2O中存在1％PBO的溶液的兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中340nm吸光度/分鐘的變化來(lái)檢測(cè)反應(yīng)初速度的變化。
結(jié)果顯示于表1中。
表1.1％ PBO對(duì)波蘿蛋白酶活性的影響底物濃度對(duì)照 測(cè)試1測(cè)試2均值(％濃度)24μM 0.0199 0.0141 0.0130 0.0136(68％)48μM 0.0297 0.0243 0.0297 0.0270(68％)96μM 0.0623 0.0518 0.0461 0.0490(78％)數(shù)據(jù)顯示了1％ PBO具有對(duì)波蘿蛋白酶65-80％的抑制，其中底物濃度包括20-24μM和48-50μM。
采用漸增的PBO濃度和固定的底物濃度(240μM)重復(fù)所述實(shí)驗(yàn)。
表2中記載了數(shù)據(jù)。
表2.PBO的漸增量對(duì)波蘿蛋白酶活性的影響％ PBO試驗(yàn)1 試驗(yàn)2 試驗(yàn)3(W/W)初速度(對(duì)照的百分?jǐn)?shù))00.13820.12210.10510.3340.1306(95％)0.1197(98％)0.10290.50.1252(91％)- -0.667- 0.1079(88％)-10.1194(86％)0.1057(86％)-1.334- 0.1029(84％)-1.667- 0.0927(76％)-從表2中的數(shù)據(jù)，可觀察到濃度超過(guò)0.5％的PBO具有對(duì)蛋白水解酶波蘿蛋白酶的抑制。
該影響依賴(lài)于濃度。抑制程度與在先實(shí)施例中獲得的數(shù)據(jù)一致。
實(shí)施例3.PBO對(duì)棉花幼苗中羧肽酶和內(nèi)肽酶的影響。
在體外分析中為了評(píng)估PBO對(duì)棉花中內(nèi)源植物酶系統(tǒng)的作用，使用獲自經(jīng)處理的(PBO)和未處理的凍干種芽的丙酮粉末在不加任何特異性外源底物時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。基本思想是“冷凍”生理性蛋白水解酶活性然后通過(guò)將蛋白水解酶系統(tǒng)在適宜緩沖液中簡(jiǎn)單溶解來(lái)重建該過(guò)程(所述適宜緩沖液為0.1M磷酸緩沖液pH6.5和0.1M tris-HCl pH7.7)，采用根據(jù)Hile等(1972)；Funkhouser等(1980)所描述的方法來(lái)評(píng)估羧肽酶和內(nèi)肽酶活性。
材料和方法棉花種子(cv.Carmela)獲自“Semillas Battle”，Barcelona(E)。
發(fā)芽條件先用自來(lái)水漂洗種子，然后種子在蒸餾水中通風(fēng)下過(guò)夜吸水(Funkhouser，E.A.等，Z.Pflanzenphysiol.，1980，100，319-324)。
在該步驟后，將種子種植于固定的且滅菌的沙土中，然后用蒸餾水(未處理的種子)和等體積PBO飽和微懸浮液(1％w/v)(處理的種子)進(jìn)行澆灌。按Hile，J.N.和Dure，L.S.所述(J.Biol.Chem.，1972，2475034-5040)，用塑料膜覆蓋含有種子的塑料箱并置于發(fā)芽器中，置于黑暗中，30℃，4天。
凍干收集4天棉花芽并冷凍于液氮中凍干(Hile等1972)。在該步驟后，用研缽將材料研碎使其不含纖維物質(zhì)并沉積以獲得約0.5篩目的非常均質(zhì)的粗粉。
丙酮粉末的制備采用正己烷(1∶10 w/v)于室溫下將所述粉脫脂，然后用丙酮于-20℃下處理以除去色素和聚酚類(lèi)化合物，此時(shí)主要是棉酚。將得到的粉末于室溫下保存于干箱中。
羧肽酶測(cè)定將丙酮粉末(30mg)懸浮于緩沖液(4ml)中并在37℃下孵育30、60、90、120分鐘。加入1ml 12％三氯乙酸終止蛋白水解作用。此時(shí)，使用的緩沖液為0.1M磷酸緩沖液，pH6.5(Hile等1972)。對(duì)照為用相同方法制備但立即通過(guò)加入1ml三氯乙酸滅活的相同樣品的懸浮液。同時(shí)實(shí)施經(jīng)處理的和未處理的樣品的實(shí)驗(yàn)。
光度分析用三氯乙酸沉淀蛋白，然后過(guò)濾分離，使用Whatman濾紙n.4，然后進(jìn)行微濾(Orange Scientific Braine I’Alleud，Belgium(0.2μm))。最后，通過(guò)在石英比色杯中檢測(cè)280nm吸光度分析水解蛋白樣品澄清溶液。
每組分析均實(shí)施兩次。使用每組分析的均值比較處理的和未處理的樣品的羧肽酶活性值。
從圖.4中所示數(shù)據(jù)可推斷出與處理的樣品中羧肽酶相關(guān)的蛋白水解活性低于未處理的樣品。
表3中還記載了這些差異的百分?jǐn)?shù)。
表3.處理的和未處理的棉花芽發(fā)芽第4天時(shí)羧肽酶活性。

內(nèi)肽酶的檢測(cè)在緩沖液(4ml)中混懸丙酮粉末(30mg)，然后于37℃孵育15′、30、60、90、120分鐘。加入1ml 12％三氯乙酸終止蛋白水解作用。此時(shí)所使用的緩沖液為0.1M磷酸鹽pH7.7(Funkhouser等1980)。對(duì)照組是用相同方法制備但立即通過(guò)加入1ml三氯乙酸進(jìn)行滅活的相同樣品的懸液。同時(shí)實(shí)施處理的和未處理的樣品的實(shí)驗(yàn)。
光度分析用三氯乙酸沉淀蛋白，然后過(guò)濾分離，使用Whatman濾紙n.4，然后進(jìn)行微濾(Orange Scientific Braine I’Alleud，Belgium(0.2μm))。最后，通過(guò)在石英比色杯中檢測(cè)280nm吸光度分析水解蛋白樣品澄清溶液。
每組分析均實(shí)施三次。使用每組分析的均值比較處理的和未處理的樣品的羧肽酶活性值。如圖.5中所示，用PBO處理的棉花芽中內(nèi)肽酶活性低于未處理的樣品。在表4中還記載了這些差異的百分?jǐn)?shù)。
表4.PBO處理的和未處理的棉花芽發(fā)芽第4天時(shí)內(nèi)肽酶活性。

實(shí)施例4.PBO對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花植物樣品中Bt-毒素含量的影響。
為了研究Bt毒素水平和PBO處理對(duì)棉花植物作用間的相關(guān)性，在用PBO處理的或未處理的(對(duì)照)Bt轉(zhuǎn)基因的棉花植物樣品(cv.SicalaV2i)中檢測(cè)Bt毒素濃度。
對(duì)在植物不同發(fā)育期播種后4，35，60，85日收集的樣品實(shí)施檢測(cè)。
材料和方法為確定PBO處理的或未處理的棉花樣品中的Bt毒素濃度，采用特異性ELISA測(cè)定法。ELISA Cry1Ab/Cry1Ac平板試劑盒獲自Envirologix(Portland，Maine-USA)。按照包括如下改變的Envirologix操作規(guī)程實(shí)施所述檢測(cè)1.使用得自葉或子葉組織的棉花凍干粉末替代新鮮和完整的葉組織。
2.從棉花凍干粉中提取Bt毒素，樣品/緩沖液比率為1∶25(w/v)。
3.采用將樣品置于緩沖液中于室溫下至少4小時(shí)進(jìn)行提取替代采用Envirologix Disposable Tissue Extractor。然后以5,000×g，室溫離心5分鐘澄清提取物。
圖6a顯示了在上述植物發(fā)育期時(shí)PBO處理的或未處理的棉花植物樣品中Bt濃度。在圖6和表5中還顯示了在種植后35、60、85天時(shí)PBO-處理的樣品中Bt含量顯著降低，而在4天時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異。圖6b顯示了PBO-處理的或未處理的棉花植物樣品間的差異百分?jǐn)?shù)。
表5中概括了用所述檢測(cè)法獲得的結(jié)果。
表5.用PBO處理的和未處理的轉(zhuǎn)基因棉花樣品中Bt含量以及二者間的差異

Δ處理組數(shù)值減去對(duì)照組數(shù)值(未處理的cv V2i)的差值實(shí)施例5.PBO處理對(duì)不同生長(zhǎng)期棉花植物中蛋白酶(內(nèi)切蛋白酶)活性的影響為了評(píng)估PBO對(duì)棉花植物中蛋白水解活性的作用，檢測(cè)PBO處理的和未處理的棉花葉(作為對(duì)照)樣品的酶活性。所述樣品是在植物的不同發(fā)育期播種后4，35，60和85日收集的。
對(duì)這些樣品還進(jìn)行了檢測(cè)Bt含量(如實(shí)施例4中所述)的分析。為實(shí)現(xiàn)該目的，采用兩種不同的檢測(cè)法檢測(cè)粗凍干葉提取物的酶活性，所述檢測(cè)法為輻射擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(RDA)，其中蛋白例如牛明膠，用作檢測(cè)內(nèi)肽酶活性的底物；以及描述于下一實(shí)施例中的光度法，其中DL-BAPA用作確定一般肽酶活性的底物。
材料和方法植物栽培預(yù)先在蒸餾水中漂洗cv.Sicala V2i品種的棉花種子，然后置于等數(shù)量的含有固定的且滅菌的沙土的適宜塑料箱中。用等體積的蒸餾水澆灌種子然后用塑料膜覆蓋培養(yǎng)箱以避免在黑暗中30℃4天進(jìn)行發(fā)芽時(shí)的水份蒸發(fā)。發(fā)芽4日后將欲分析的種子用蒸餾水或用等體積PBO飽和的微懸浮液(2％ W/V)澆灌。4日后，收集這些幼芽進(jìn)行分析，而將其他幼芽移至適宜的盆中并置于日間溫度為24℃，夜間溫度為20℃的溫室中。
處理于播種后固定時(shí)間4，35，60，85日，用2％(w/v)商業(yè)PBO劑型(Endura)處理高度基本相同的10株植物。
通過(guò)在植物上蒸發(fā)稀釋的試劑(小心處理葉片的兩側(cè))實(shí)施處理。
凍干每一處理后2天，收集處理的植物樣品和相應(yīng)對(duì)照，將全部葉子冷凍于液氮中凍干。在該步驟后，在研缽中將所述物質(zhì)磨為粉末，然后于室溫下保存與干箱中。
制備提取物用兩個(gè)步驟提取處理樣品和對(duì)照樣品的一等份粉末(表示植物生長(zhǎng)的每個(gè)步驟)。對(duì)粉末樣品的提取采用0.1M Tris-HCl，pH7.7(1∶20 w/v)緩沖液并使用Ultraturrax攪拌器以24,000×RPM攪拌2分鐘，于冰浴中操作以避免過(guò)熱。通過(guò)5,000×g于10℃，離心20分鐘使提取物澄清。收集上清然后使用Whatman紙n°4過(guò)濾。用相同的步驟進(jìn)一步提取片狀沉淀物，不同的是提取比率為1∶10(w/v)。最后，將兩個(gè)提取步驟的上清合并，然后采用適宜的濃縮儀(Amicon Inc.Beverly，MA-USA)以3,000×g于15℃離心2小時(shí)將其濃縮4-5倍，符合10KD分級(jí)的膜。
蛋白濃度對(duì)每一提取物，采用Biuret法測(cè)定可溶蛋白的量然后以特異性活性即單位/mg可溶蛋白表示酶活性。
按照Santarius，K.和Ryan，C.(Anal.Biochem.，1977，771-9)的描述在Petri dishes培養(yǎng)皿中實(shí)施RDA，所述Petri dishes培養(yǎng)皿中含有分散于瓊脂糖凝膠中作為底物的牛明膠。每一培養(yǎng)皿均含有5個(gè)孔，其中在4個(gè)孔中注滿濃縮棉花提取物的適宜等份，而在1個(gè)孔中注滿牛β-胰蛋白酶作為標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2U/ml)。用塑料膜覆蓋并密封培養(yǎng)皿以避免水份蒸發(fā)，然后于37℃孵育16小時(shí)。
由于在不透明背景上的牛明膠蛋白水解作用，蛋白-瓊脂糖凝膠中的酶活性在每個(gè)圓形孔周?chē)纬汕逦姆派錉顢U(kuò)散區(qū)。
通過(guò)測(cè)量由植物提取物產(chǎn)生的亮區(qū)(clear zone)的半徑來(lái)計(jì)算胰蛋白酶等效物并將其與獲自胰蛋白酶連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。每個(gè)培養(yǎng)皿中均含有胰蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其用于繪制每個(gè)平板的標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此以胰蛋白酶等效物的單位表示內(nèi)肽酶活性。
每組分析均按一式四份實(shí)施。圖7顯示了獲自處理的或未處理的棉花樣品RDA的內(nèi)肽酶活性值。該實(shí)驗(yàn)顯示出商業(yè)PBO劑型(Endura)，特別是于播種后35、60、85日時(shí)，顯著抑制Sicala V2i基因型的棉花葉中內(nèi)肽酶活性。表6中顯示了處理的或未處理的棉花樣品間的差異百分?jǐn)?shù)。
表6.用RDA法測(cè)定PBO的內(nèi)肽酶活性處理的和未處理的樣品。

U＝胰蛋白酶等效物按照Erlanger，B.F.等(Arch.Biochem.，1961，95271-278)的描述實(shí)施光度法。由于DL-BAPA水解，故可在該試驗(yàn)中于410nm處檢測(cè)吸光度變量。在比色杯中將20μl棉花粗提取物與980μl DL-BAPA于緩沖液0.1M Tris-HCl，pH8.2中直接混合實(shí)施所述檢測(cè)。以能夠于pH8.2和30℃以410nm/分鐘產(chǎn)生一單位吸光度變量的酶量確定一個(gè)肽酶單位。
每組分析均按一式兩份或一式三份實(shí)施。圖8顯示了以U/可溶蛋白mg計(jì)算PBO處理的或未處理的棉花樣品中的肽酶活性值。該圖中顯示了肽酶活性在發(fā)育約60天時(shí)為最大值。此時(shí)，用商業(yè)PBO劑型(Endura)的處理顯示了對(duì)Sicala V2i棉花蛋白水解活性的最顯著抑制。通過(guò)PBO處理對(duì)比未處理的棉花植物中的該測(cè)定在整個(gè)植物生長(zhǎng)期中均觀察到蛋白水解活性的差異。在植物生長(zhǎng)期的大部分時(shí)期觀察到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的抑制。最后，表7中顯示了處理的或未處理的Sicala V2i棉花樣品的肽酶的特異性活性。
在該表中，還記載了處理的和未處理的樣品間的活性差異百分?jǐn)?shù)。
表7.以DL-BAPA為底物的光度檢測(cè)PBO處理的和未處理的樣品的肽酶活性(U/溶蛋白的mg)。

權(quán)利要求
1.具有式I的苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物作為調(diào)節(jié)植物中蛋白水解酶的活性或含量的用途， 其中R1、R2和R3相同或不同地選自氫、C2-C8烷基、CH2OR4，其中R4選自氫、-(CH2CH2O)n-R5，其中n為1～4的整數(shù)，且R5選自氫、C1-C8烷基、無(wú)取代基的或由C1-C4烷基、鹵素、氰基(CN)基團(tuán)、-SO3H基團(tuán)、羧基烷基性-COOR6基團(tuán)取代的芳基，其中R6為氫或C1-C8烷基、-N(R7)-R8基團(tuán)，其中R7和R8相同或不同地為氫或C1-C4烷基或與其結(jié)合的氮原子一起可代表哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基基團(tuán)，R5另外選自無(wú)取代基或在芳環(huán)上由選自C1-C4烷基、鹵素、氰基基團(tuán)、-SO3H基團(tuán)、羧基烷基性基團(tuán)-COOR9的取代基取代的C7-C9芳烷基，其中R9定義同R6，且在R1、R2和R3全部相同時(shí)，其從不為氫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中R1、R2和R3相同或不同地選自氫、C2-C4烷基、CH2OR4，其中R4選自氫、-(CH2CH2O)n-R5，其中n為1～2的整數(shù)，R5選自氫、C1-C4烷基、芐基、無(wú)取代基的或C1-C3烷基取代的芳基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中R1、R2相同或不同地選自氫、丙基、CH2OR4，其中R4為-(CH2CH2O)2-R5，R5選自C2-C4烷基、苯基、甲苯基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述化合物具有如下式II
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的用途，其中所述酶選自羧肽酶、氨肽酶、二肽酶、內(nèi)肽酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述內(nèi)肽酶選自絲氨酸蛋白酶，胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶，金屬-內(nèi)肽酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述胱氨酸蛋白酶為波蘿蛋白酶、鈣蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的用途，其中所述植物選自大豆、玉米和棉花。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述植物為轉(zhuǎn)基因性的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼蘇蕓金桿菌Cry蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述Cry蛋白選自Cry I、CryII、Cry III、Cry IV。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述蛋白為(a)、(b)或(c)亞型的Cry IA蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的用途，其中所述調(diào)節(jié)為負(fù)調(diào)節(jié)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物聯(lián)合適用的乳化劑和可選的光保護(hù)劑化合物，作為植物中蛋白水解酶的活性或含量的調(diào)節(jié)劑的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中所述乳化劑選自烷基芳基磺酸鈣鹽、脂肪酸聚乙二醇酯、烷基芳基聚乙二醇醚、脂肪醇聚乙二醇醚、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷縮合物、烷基聚醚、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述乳化劑選自烷基芳基聚乙二醇醚和烷基芳基磺酸鈣鹽。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述光保護(hù)劑化合物選自苯并三唑，二苯甲酮和空間位阻胺。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中二苯甲酮選自2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和2-羥基-4-辛基氧基二苯甲酮，且空間位阻胺選自癸二酸二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)酯和癸二酸二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)酯。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-14的用途，包括用式II的苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物以包括50～800克/公頃的濃度處理所述植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述濃度包含100～400克/公頃，更優(yōu)選為200～350克/公頃。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其特征在于其中在每個(gè)生長(zhǎng)周期重復(fù)最多三次處理。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中在生長(zhǎng)周期結(jié)束時(shí)至少實(shí)施一次處理。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22的用途，其中采用噴霧法實(shí)施所述處理。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于苯并間二氧雜環(huán)戊烯衍生物作為植物中蛋白水解酶活性或含量調(diào)節(jié)劑的用途。所述新用途能增加植物天然或經(jīng)誘導(dǎo)的抵抗力。
文檔編號(hào)A01N43/02GK1633238SQ03803872
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2003年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月14日
發(fā)明者G·D·格萊尼瓊斯, V·博扎塔 申請(qǐng)人:恩德拉股份公司