本發明涉及一種食用菌液體菌種精準化培養基與應用，特別涉及一種工廠化栽培食用菌液體菌種培養基及其制備方法與應用，屬于食用菌栽培技術領域。
背景技術
食用菌工廠化栽培是最具現代農業特征的產業化生產方式，是今后食用菌產業發展的必由之路。專用生產菌種是工廠化生產的基礎，直接關系到最終產品的產量、品質和效益。當前國際上工廠化制種行業已走上專業化、工廠化大規模生產的道路。液體菌種因具有培養時間短、發菌快、菌齡整齊、接種方便，有利于規模化、周年化、工廠化生產的特點，已成為食用菌制種產業的發展趨勢。
食用菌工廠化栽培由于管理工序化，除重視產量外，同時非常重視出菇周期的一致性。因此工廠化栽培對菌種同調性的要求特別高，培養基原材料的影響要盡力排除、培養管理要保持穩定，以獲得質量穩定、均一的優質菌種。
微生物的生長和發育，有一定的營養要求，根據配制材料和對它成分的了解程度，培養基可以分為三類：天然培養基，半組合培養基和組合培養基。天然培養基由動植物組織和它們的煎汁、以及廄肥、土壤和土壤浸出液等配成，成分比較復雜，幾乎無法完全了解。半組合培養基是由成分未知的天然物質和成分已知的物質配成，組合培養基是成分和濃度完全已知的培養基。天然培養基對于微生物的生長很好，其缺點是成分復雜而且不一致，真菌在天然培養基上容易產生孢子。目前用于食用菌液體菌種制作的培養基多以馬鈴薯、麩皮、玉米粉、豆粕或豆粉等天然原料制作，如中國專利文獻cn106831037a、cn106497798a、cn107805096a等公開的食用菌液體菌種培養基均以土豆、玉米粉、麥麩、豆粉、豆粕、酵母粉、蛋白胨等原料配制而成，這類原料制作的培養基雖然可以保證菌種生長，但缺點一是工藝復雜原料多需預處理，二是常因天然原料的批次來源不同，導致培養基的成分、ph等性狀發生改變，從而影響菌種的穩定性、均一性進一步影響后期栽培管理的一致性、同調性。
為了獲得性能穩定一致的菌種，開發液體菌種精準化生產配方與工藝流程是防止菌種活力降低、控制污染的關鍵，是液體菌種規模化生產與栽培生產標準化的保障。
技術實現要素：
本發明針對現有技術的不足，提供了一種食用菌液體菌種精準化發酵培養基與應用。
本發明的技術方案如下：
一種食用菌液體菌種精準化發酵培養基，成分如下：
成分單一的碳源20～25g/l，成分單一的氮源1.0～2g/l，caco32～2.5g/l，甘油5～10ml/l，kh2po40.8～1.2g/l，k2hpo40.5～0.8g/l，mgso4·7h2o0.5～1g/l，feso40.01～0.015g/l，赤霉素0.1～0.3mg/l，雙乙酸鈉0.1～0.3g/l，vb15～10mg/l，vb210～20mg/l，泡敵5～10μl/l。
根據本發明優選的，所述成分單一的碳源選自葡萄糖或蔗糖。進一步優選的，所述成分單一的碳源為葡萄糖。
根據本發明優選的，所述成分單一的氮源選自nh4no3、(nh4)2so4等，進一步優選的，所述成分單一的氮源為nh4no3。
上述食用菌液體菌種精準化培養基在食用菌精準化栽培中的應用。
根據本發明優選的，所述應用，步驟如下：
(1)母種制備：將食用菌保存菌株接種于加富pda平板培養基上，在22～25℃條件下，培養6～8天；
(2)種子液制備：取步驟(1)中的菌絲，接種于食用菌液體菌種精準化培養基中，在溫度20～25℃、震蕩速率為120～180rpm的條件下，培養5～8天，制得種子液；
(3)液體菌種擴大培養：將步驟(2)制得的種子液按體積百分比0.5～1％的接種量接種至食用菌液體菌種精準化培養基中，在溫度20℃～25℃、通氣量1.5～1.8v/v·min條件下，發酵培養6～8天，制得液體菌種；
(4)液體菌種應用：將步驟(3)制得的液體菌種在無菌條件下接種至滅菌后的菌棒或菌甁中，置18-25℃適溫下培養即得栽培用菌棒或菌甁。
根據本發明優選的，所述步驟(1)中，加富pda平板培養基，成分如下：
馬鈴薯(煮汁)180～220g/l、麥麩(煮汁)18～22g/l、李子(煮汁)20-30g/l、葡萄糖18～22g/l、酵母浸粉2.5～3.5g/l、磷酸二氫鉀0.8～1.2g/l、硫酸鎂0.4～0.6g/l、瓊脂18～22g/l；進一步優選的，加富pda平板培養基，成分如下：
馬鈴薯(煮汁)200g/l、麥麩(煮汁)20g/l、葡萄糖20g/l、李子(煮汁)25g/l、酵母浸粉3g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸鎂0.5g/l、瓊脂20g/l；
根據本發明優選的，所述步驟(2)中，菌絲采用如下方法獲取：
在長滿菌絲的平板背面劃直徑為6cm和7cm的兩個同心圓，用直徑為0.5cm的打孔器在兩個同心圓之間打取菌圓片，將菌圓片接種于食用菌液體菌種精準化發酵培養基中。
進一步優選的，所述步驟(2)中的接種量為150～200ml食用菌液體菌種精準化發酵培養基中接種菌圓片5～10片。
根據本發明優選的，所述步驟(2)和步驟(3)中的培養均為暗培養。
根據本發明優選的，所述步驟(4)中，接種量為每1000g菌棒接種15ml～30ml液體菌種。
有益效果
1、本申請發明人首次發現，利用成分清晰的各種化合物調配可獲得適宜食用菌菌絲生長的精準化培養基，這改變了本領域技術人員的技術偏見,即食用菌需要采用天然成分配制的培養基進行培養。由于培養基成分可控，從而使培養獲得的不同批次液體菌種在接種固體培養料后，發菌速度均一，有利于生產管理的標準化、程序化；為降低食用菌工廠化生產的波動性提供了新的解決思路。
2、發明人通過實驗發現，使用本發明在優化基本的碳源、氮源、維生素和無機鹽的基礎上，并進一步改良添加微量營養成分的食用菌液體菌種精準化培養基，可以誘導菌絲的有效增殖，并且制得的接種菌液顏色清亮，便于觀察鑒別是否污染有雜菌，菌種活性強，質量穩定，后續同等條件下出菇速度、產量等方面較現有培養基制得的液體菌種具有顯著的優勢。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，實施例中未詳加說明的接種、發菌等管理均按本領域的現有技術。
實施例中所述原料均為普通市售品；
實施例中使用的食用菌品種，均可購自山東省農科院農業資源與環境研究所，普通市售產品。
實施例1
一種金針菇精準化液體菌種生產方法：
(1)金針菇母種的制備：取保存菌株接種于加富pda平板培養基上，在22℃條件下，避光培養7天；加富pda平板培養基配方為：馬鈴薯200g/l(煮汁)、麥麩20g/l(煮汁)、李子(煮汁)30g/l、葡萄糖20g/l、酵母浸粉3g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸鎂0.5g/l、瓊脂20g/l。
(2)金針菇搖瓶種子液的制備：取步驟(1)中長滿菌絲的平板，于平板背面劃直徑為6cm與7cm的同心圓，用直徑為0.5cm的打孔器在兩個同心圓之間打取菌圓片，接種到裝有200ml食用菌液體菌種精準化發酵培養基的500ml培養瓶中，每瓶接種5片，培養7天得搖瓶菌種；培養條件為：溫度22℃，震蕩速率為180rpm。
(3)金針菇發酵罐液體菌種的生產：采用氣升式不銹鋼發酵罐，將步驟(2)制得的搖瓶液體菌種按發酵培養基體積百分比0.5％的接種量接種至發酵罐中的食用菌液體菌種精準化發酵培養基，通過氣泵充氣和調整放氣閥調節罐體壓力表壓力在0.02mpa～0.03mpa，溫度控制在20℃，培養時間為7天，獲得金針菇液體菌種。
食用菌液體菌種精準化培養基配方為：葡萄糖20g/l，nh4no31.5g/l，caco32g/l，甘油10ml/l，kh2po41g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l,feso40.01g/l，赤霉素0.2mg/l,雙乙酸鈉0.2g/l，vb15mg/l，vb210mg/l，泡敵10μl/l，余量為水。
(4)放罐接種：接種用氣管(膠管)和接種槍提前滅菌，接種房間提前消毒。接種時先放掉一部分菌種，盡量減少感染機會。將待接種的栽培甁放置在輸送帶上，輸入至無菌接種區。在接種區用接種器將液體菌種高壓噴入，每個接種點接種30ml液體菌種，接種后放入培養室發菌培養，發菌溫度20℃。
實施例2
一種杏鮑菇精準化液體菌種生產方法：
(1)杏鮑菇母種的制備：取保存菌株接種于加富pda平板培養基上，在22℃條件下，避光培養7天。加富pda平板培養基配方為：馬鈴薯200g/l(煮汁)、麥麩20g/l(煮汁)、李子(煮汁)20g/l、葡萄糖20g/l、酵母浸粉3g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸鎂0.5g/l、瓊脂20g/l。
(2)杏鮑菇搖瓶種子液的制備：取步驟(1)中長滿菌絲的平板，于平板背面劃直徑為6cm與7cm的同心圓，用直徑為0.5cm的打孔器在兩個同心圓之間打取菌圓片，接種到裝有200ml食用菌液體菌種精準化培養基的500ml培養瓶中，每瓶接種10片，培養7天得搖瓶菌種；培養條件為：溫度25℃，震蕩速率為180rpm。
(3)杏鮑菇發酵罐液體菌種的生產：采用氣升式不銹鋼發酵罐，將步驟(2)制得的搖瓶液體菌種按發酵培養基體積百分比0.5％的接種量接種至發酵罐中的食用菌液體菌種精準化發酵培養基，通過氣泵充氣和調整放氣閥調節罐體壓力表壓力在0.02mpa～0.03mpa，溫度控制在23℃，培養時間為7天，獲得杏鮑菇液體菌種。
食用菌液體菌種精準化培養基配方為：葡萄糖20g/l，nh4no31.5g/l，caco32g/l，甘油5ml/l，kh2po41g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l,feso40.01g/l，赤霉素0.2mg/l,雙乙酸鈉0.2g/l，vb15mg/l，vb215mg/l，泡敵10μl/l，余量為水。
(4)放罐接種：接種用氣管(膠管)和接種槍提前滅菌，接種房間提前消毒。接種時先放掉一部分菌種，盡量減少感染機會。將待接種的栽培袋放置在輸送帶上，輸入至無菌接種區。在接種區用接種器將液體菌種注入，每個接種點接種30ml液體菌種，接種后放入培養室發菌培養。
實施例3
一種真姬菇精準化液體菌種生產方法：
(1)真姬菇母種的制備：取保存菌株接種于加富pda平板培養基上，在22℃條件下，避光培養7天。加富pda平板培養基配方為：馬鈴薯200g/l(煮汁)、麥麩20g/l(煮汁)、李子(煮汁)20g/l、葡萄糖20g/l、酵母浸粉3g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸鎂0.5g/l、瓊脂20g/l。
(2)真姬菇搖瓶種子液的制備：取步驟(1)中長滿菌絲的平板，于平板背面劃直徑為6cm與7cm的同心圓，用直徑為0.5cm的打孔器在兩個同心圓之間打取菌圓片，接種到裝有200ml食用菌液體菌種精準化培養基的500ml培養瓶中，每瓶接種10片，培養7天得搖瓶菌種；培養條件為：溫度23℃，震蕩速率為180rpm。
(3)真姬菇發酵罐液體菌種的生產：采用800升氣升式不銹鋼發酵罐，將步驟(2)制得的搖瓶液體菌種按發酵培養基體積百分比0.5％的接種量接種至發酵罐中的食用菌液體菌種精準化發酵培養基，通過氣泵充氣和調整放氣閥調節罐體壓力表壓力在0.02mpa～0.03mpa，溫度控制在23℃，培養時間為7天，獲得真姬菇液體菌種。
食用菌液體菌種精準化培養基配方為：葡萄糖20g/l，nh4no31.3g/l，caco32g/l，甘油8ml/l，kh2po41g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l,feso40.01g/l，赤霉素0.2mg/l,雙乙酸鈉0.2g/l，vb110mg/l，vb215mg/l，泡敵10μl/l，余量為水。
(4)放罐接種：接種用氣管(膠管)和接種槍提前滅菌，接種房間提前消毒。接種時先放掉一部分菌種，盡量減少感染機會。將待接種的栽培袋放置在輸送帶上，輸入至無菌接種區。在接種區用接種器將液體菌種注入，每個接種點接種30ml液體菌種，接種后放入培養室發菌培養。
對比例1
按中國專利文獻cn106497798a公開的方法制備搖甁液體培養基組份如下：
葡萄糖40g/l、麥麩40g/l、玉米面6g/l、豆面10g/l、蛋白胨5g/l、土豆泥400g/l、硫酸鎂3g/l、維生素b10.1g/l、磷酸二氫鉀6g/l；
發酵罐液體培養基組份如下：
葡萄糖40g/l、麥麩40g/l、玉米面6g/l、豆面10g/l、蛋白胨5g/l、土豆泥400g/l、硫酸鎂3g/l、維生素b10.1g/l、磷酸二氫鉀6g/l、泡敵15μl/l。
其余制備步驟同實施例1制得金針菇液體菌種。
對比例2
按中國專利文獻cn106497798a公開的方法制備搖甁液體培養基組份如下：
葡萄糖40g/l、麥麩40g/l、玉米面6g/l、豆面10g/l、蛋白胨5g/l、土豆泥400g/l、硫酸鎂3g/l、維生素b10.1g/l、磷酸二氫鉀6g/l；
發酵罐液體培養基組份如下：
葡萄糖40g/l、麥麩40g/l、玉米面6g/l、豆面10g/l、蛋白胨5g/l、土豆泥400g/l、硫酸鎂3g/l、維生素b10.1g/l、磷酸二氫鉀6g/l、泡敵15μl/l。
其余制備步驟同實施例2制得杏鮑菇液體菌種。
對比例3
按中國專利文獻cn106497798a公開的方法制備搖甁液體培養基組份如下：
葡萄糖40g/l、麥麩40g/l、玉米面6g/l、豆面10g/l、蛋白胨5g/l、土豆泥400g/l、硫酸鎂3g/l、維生素b10.1g/l、磷酸二氫鉀6g/l；
發酵罐液體培養基組份如下：
葡萄糖40g/l、麥麩40g/l、玉米面6g/l、豆面10g/l、蛋白胨5g/l、土豆泥400g/l、硫酸鎂3g/l、維生素b10.1g/l、磷酸二氫鉀6g/l、泡敵15μl/l。
其余制備步驟同實施例3制得真姬菇液體菌種。
對比例4
如實施例1所述的方法，不同之處在于，食用菌液體菌種精準化培養基的氮源替換為kno33.8g/l。
對比例5
如實施例1所述的方法，不同之處在于，食用菌液體菌種精準化培養基的碳源替換為乳糖20g/l。
對比例6
如實施例1所述的方法，不同之處在于，食用菌液體菌種精準化培養基的赤霉素替換為2,4－d0.2mg/l。
栽培試驗：
以上實施例1～3與對比例1～3均生產3批，每批液體菌種接種相應品種栽培袋1000袋。
對比例4～6生產3批，每批液體菌種接種相應品種栽培袋20袋。
結果分析：根據表1可以看出，本發明各試驗例培養的金針菇、杏鮑菇、真姬菇等食用菌液體菌種實施例均較對比例具有明顯的優勢，不同批次實施例獲得的液體菌種穩定、一致性高，菌液清亮、菌種培養階段易于觀察剔除污染菌種，菌種活力強，接種后萌發快，發菌一致，不同生產批次間出菇周期同調性好，有利于生產管理。
對比例1～3中培養基所用麥麩、玉米面、豆面、土豆泥等原料均為天然農產品，而不同來源批次的農產品其營養成分受產地、品種、栽培措施的不同會有較大差異，由其制成的培養基成分也會發生相應變動從而影響食用菌菌絲的生長發育。
食用菌對不同的碳、氮源及微量元素的吸收利用率有較大差異，本發明通過大量的比較試驗篩選出最佳的成分組成與濃度配比，達到最佳的培養效果，獲得穩定、均一的液體菌種以適應工廠化栽培的需要。
表1不同制備方法對食用菌液體菌種及栽培生產的影響