本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，具體涉及一種白癜風(fēng)動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、白癜風(fēng)是一種色素脫失性皮膚疾病，特征是病患部位皮膚出現(xiàn)黑色素細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致白斑形成。白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為與自身免疫、氧化應(yīng)激、神經(jīng)精神和遺傳等機(jī)制相關(guān)。其中，越來(lái)越多的證據(jù)表明自身免疫反應(yīng)是白癜風(fēng)發(fā)病的核心機(jī)制之一。為了深入研究白癜風(fēng)病因、發(fā)病過(guò)程以及篩選有效的治療藥物，建立一種能夠模擬人類白癜風(fēng)疾病特征、穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型至關(guān)重要。
2、目前已有多種構(gòu)建白癜風(fēng)動(dòng)物模型的方法。其中，陳婷教授團(tuán)隊(duì)建立的白癜風(fēng)動(dòng)物模型是應(yīng)用廣泛且認(rèn)可度較高的經(jīng)典方案之一。該方案將b16f10細(xì)胞皮內(nèi)注射至c57bl/6小鼠背部皮膚，待腫瘤生長(zhǎng)后，第4d和第10d腹腔注射cd4耗竭抗體，第12d通過(guò)外科手術(shù)將腫瘤切除并縫合傷口。
3、盡管上述方案能夠成功誘導(dǎo)出白癜風(fēng)動(dòng)物模型，并且在研究中發(fā)揮了重要作用，但也存在缺陷和不足：
4、操作復(fù)雜且具有入侵性：該方案必須依賴外科手術(shù)切除腫瘤這一關(guān)鍵步驟。手術(shù)操作要求高，對(duì)于科研人員外科手術(shù)技能有依賴，增加了模型構(gòu)建的難度和操作的時(shí)間成本。同時(shí)手術(shù)作為一種強(qiáng)烈生理應(yīng)激，可能引入感染風(fēng)險(xiǎn)并對(duì)動(dòng)物的免疫狀態(tài)產(chǎn)生不可控的干擾，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
5、模型變異度大：手術(shù)切除腫瘤的大小、位置、創(chuàng)傷愈合情況等多種因素難以做到均一，這些因素會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物模型出現(xiàn)白癜風(fēng)癥狀時(shí)間、嚴(yán)重程度等存在差異。
6、腫瘤潛在轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)：在手術(shù)前，體內(nèi)存在活性的、持續(xù)增殖的腫瘤，盡管最終被切除，但仍存在腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)播散和轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致動(dòng)物因腫瘤轉(zhuǎn)移而造成模型構(gòu)建失敗。
7、因此，目前缺少一種操作簡(jiǎn)單的白癜風(fēng)動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種白癜風(fēng)動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明所述構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)便、模型穩(wěn)定、無(wú)需外科手術(shù)切除腫瘤。
2、本發(fā)明提供了一種白癜風(fēng)動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
3、將黑素瘤細(xì)胞系與絲裂霉素c混合，進(jìn)行預(yù)處理，得到預(yù)處理后的黑素瘤細(xì)胞系；
4、將預(yù)處理后的黑素瘤細(xì)胞系進(jìn)行清洗，清洗后的細(xì)胞與cpg?odn1826佐劑和脂多糖混合對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮內(nèi)接種；所述皮內(nèi)接種的次數(shù)為3~5次；每次皮內(nèi)接種間隔的時(shí)間為3~6d；
5、在皮內(nèi)接種期間進(jìn)行腹腔注射cd4耗竭抗體，構(gòu)建得到白癜風(fēng)動(dòng)物模型。
6、優(yōu)選的是，所述黑素瘤細(xì)胞系包括b16f10細(xì)胞系。
7、優(yōu)選的是，黑素瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)基包括rpmi1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基。
8、優(yōu)選的是，所述預(yù)處理的過(guò)程中，絲裂霉素c的質(zhì)量濃度為25~100?μg/ml；所述預(yù)處理的時(shí)間為30~120min；所述預(yù)處理的溫度為4~37℃。
9、優(yōu)選的是，使用pbs緩沖液進(jìn)行所述清洗；所述清洗的次數(shù)為3~5次。
10、優(yōu)選的是，所述動(dòng)物包括小鼠。
11、優(yōu)選的是，當(dāng)所述動(dòng)物為小鼠時(shí)，所述皮內(nèi)接種，清洗后的細(xì)胞的接種劑量為1×105~1×107個(gè)/只/次。
12、優(yōu)選的是，當(dāng)所述動(dòng)物為小鼠時(shí)，所述皮內(nèi)接種，cpg?odn1826佐劑的接種劑量為5~50μg/只/次；當(dāng)所述動(dòng)物為小鼠時(shí)，所述皮內(nèi)接種，脂多糖接種劑量為2~10μg/只/次。
13、優(yōu)選的是，所述腹腔注射的次數(shù)為2~4次，第一次腹腔注射的時(shí)間選自第二次皮內(nèi)接種后的第3~8d；每次腹腔注射間隔的時(shí)間為4~6d。
14、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的白癜風(fēng)動(dòng)物模型在如①~③任一項(xiàng)中的應(yīng)用：①探究白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制；②評(píng)估抗白癜風(fēng)藥物；③制備預(yù)防和/或治療白癜風(fēng)的藥物。
15、本發(fā)明提供了一種白癜風(fēng)動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明提供了一種白癜風(fēng)動(dòng)物模型構(gòu)建方法，它通過(guò)一種非手術(shù)、化學(xué)預(yù)處理的巧妙方式，成功誘導(dǎo)出穩(wěn)定、可靠的白癜風(fēng)表型，為白癜風(fēng)的病因?qū)W、免疫學(xué)研究和新型治療藥物的篩選提供了更為優(yōu)越的工具。具體的，本發(fā)明所述構(gòu)建方法具有以下有益效果：
16、1.規(guī)避外科手術(shù)，簡(jiǎn)化操作流程：本發(fā)明最核心的創(chuàng)新在于，通過(guò)使用絲裂霉素c預(yù)處理黑素瘤細(xì)胞系，使得細(xì)胞在接種后無(wú)法形成腫瘤，從而消除了“手術(shù)切除腫瘤”這一必要步驟。這極大地降低了實(shí)驗(yàn)的技術(shù)難度和對(duì)操作人員的要求，也避免了手術(shù)創(chuàng)傷、麻醉風(fēng)險(xiǎn)和術(shù)后感染等并發(fā)癥，使模型構(gòu)建過(guò)程更加標(biāo)準(zhǔn)化和易于推廣。
17、2.模型穩(wěn)定性：由于摒棄了可變因素眾多的外科手術(shù)環(huán)節(jié)，本發(fā)明的模型構(gòu)建過(guò)程更加可控。皮內(nèi)接種的細(xì)胞量、抗原暴露量以及cd4耗竭抗體的注射時(shí)機(jī)均可精確控制，這顯著減少了動(dòng)物個(gè)體間的差異，使得白癜風(fēng)皮損出現(xiàn)的時(shí)間、進(jìn)展速度和嚴(yán)重程度更為一致，從而提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)效力。
18、3.排除了活性腫瘤的干擾，模型更具針對(duì)性：經(jīng)典方案中，動(dòng)物體內(nèi)存在一個(gè)生長(zhǎng)中的活性腫瘤，其本身會(huì)引發(fā)復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境，這可能干擾對(duì)白癜風(fēng)特異性自身免疫反應(yīng)的純粹觀察。本發(fā)明使用的經(jīng)絲裂霉素c處理的細(xì)胞僅作為抗原來(lái)源，不會(huì)形成腫瘤體，因此所誘導(dǎo)出的免疫應(yīng)答和病理變化更純粹地反映了針對(duì)黑素細(xì)胞的自身免疫攻擊過(guò)程，使該模型更適用于研究白癜風(fēng)的核心發(fā)病機(jī)制。
1.一種白癜風(fēng)動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述黑素瘤細(xì)胞系包括b16f10細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，黑素瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)基包括rpmi1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述預(yù)處理的過(guò)程中，絲裂霉素c的質(zhì)量濃度為25~100?μg/ml；所述預(yù)處理的時(shí)間為30~120min；所述預(yù)處理的溫度為4~37℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，使用pbs緩沖液進(jìn)行所述清洗；所述清洗的次數(shù)為3~5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述動(dòng)物包括小鼠。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，當(dāng)所述動(dòng)物為小鼠時(shí)，所述皮內(nèi)接種，清洗后的細(xì)胞的接種劑量為1×105~1×107個(gè)/只/次。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，當(dāng)所述動(dòng)物為小鼠時(shí)，所述皮內(nèi)接種，cpg?odn1826佐劑的接種劑量為5~50μg/只/次；當(dāng)所述動(dòng)物為小鼠時(shí)，所述皮內(nèi)接種，脂多糖的接種劑量為2~10μg/只/次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述腹腔注射的次數(shù)為2~4次，第一次腹腔注射的時(shí)間選自第二次皮內(nèi)接種后的第3~8d；每次腹腔注射間隔的時(shí)間為4~6d。
10.權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的白癜風(fēng)動(dòng)物模型在如①~③任一項(xiàng)中的應(yīng)用：①探究白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制；②評(píng)估抗白癜風(fēng)藥物；③制備預(yù)防和/或治療白癜風(fēng)的藥物。