一種解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的方法

專利名稱：一種解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的方法
技術領域：
本發明屬于發酵技術領域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的方法。背景技干酪又稱奶酪，富含多種營養成分，又容易消化吸收，且不易致肥，被營養學家譽為“乳業皇冠上的珍珠”，它是一種在牛奶或羊奶中加入適量乳酸菌發酵劑和凝乳酶制劑，使奶中的蛋白質凝固，排除乳清，并經一定時間的成熟而制成的食品，凝乳酶則是奶酪生產過程中使牛奶凝固的關鍵性酶。其傳統來源是從未斷奶的小牛皺胃中提取，是一種酸性蛋白酶，其主要的生物學功能是有限剪切Phel05-Metl06連接的k -酪蛋白，導致牛乳凝結，被廣泛用于乳酪業。隨著奶酪產業的發展，動物凝乳酶已經無法滿足現代工業對凝乳酶的需求，而植物凝乳酶雖然來源廣泛，但是其蛋白水解力強，并且受時間地點等的限制難以發展，因此利用微生物凝乳酶是目前最有前途的發展方向。目前工業上微生物凝乳酶主要采用米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等真菌發酵生產。細菌較絲狀真菌具有體積小、生長周期短、成本低、發酵產物易于提取分離等特點，能在人工控制的條件下進行生產，而高蛋白水解能力是細菌來源的凝乳酶成為商品凝乳酶的主要障礙，因此凝乳酶活力高，蛋白水解活力低的細菌凝乳酶作為小牛凝乳酶的代用品在工業化生產中具有廣闊的發展前景。

發明內容
本發明提供了一種解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的方法，本專利為了進一步提高解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)發酵產凝乳酶的活力,對影響解淀粉芽孢桿菌凝乳酶活力的培養溫度、搖床轉速、培養基初始PH及發酵時間等主要因素進行了優化試驗，確定最佳發酵條件，在IOOmL三角瓶中裝25 mL發酵培養基，接種量3. 5%，培養溫度36°C，培養基最初pH為6.0，發酵時間為20 h，搖床轉速為120 r/min，凝乳酶活力可達最聞值。I. 一種解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的方法，其特征在于，在100 mL搖瓶中配制一定體積的發酵培養基，接入一定量的解淀粉芽孢桿菌種子液，在恒溫振蕩器中培養溫度24 38°C，搖瓶轉速60-260 r/min，然后進行凝乳活力和蛋白水解活力的測定。2.步驟I里的種子培養基馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基馬鈴薯浸粉0. 5%，葡萄糖2%，蛋白胨 1%, NaCl 0. 5%, 121°C滅菌 20min。3.步驟I里的發酵培養基鈴薯浸粉0. 5%，葡萄糖I. 13%，酵母浸粉I. 76%，CaCO30. 32%，121°C 滅菌 20 min。4.步驟I所述的解淀粉芽孢桿菌接種量最佳為3. 5%。5.步驟I所述的培養溫度最佳為36°C。6.步驟I所述的搖床轉速最佳為120 r/min。7.步驟I所述的最佳裝液量為25 mL8.步驟I所述的培養基初始pH最佳為6. O9.步驟I所述的凝乳活性的測定方法為，取5mL IOOg /L的脫脂乳，40°C保溫5min后加入0. 5 mL經適當稀釋的發酵液混合，振蕩使它們混合均勻。準確記錄從加入酶液到乳凝固的時間(s)。凝乳酶活力(milk — clotting activity, MCA )定義為40min凝固ImL 10%脫脂乳的酶量為I個酶活力單位(Soxhelt Unit, Su)。MCA =(2400 X 5 X D) / ( T X 0. 5)式中MCA為凝乳酶活力/ ( Su /mL) ；T為凝乳時間/s ；D為稀釋倍數。10.步驟I所述的蛋白水解活力的測定方法為底物是牛乳全酪蛋白，用pH 6. 5
0.IM磷酸鹽緩沖液配制2%酪蛋白溶液，ImL底物溶液加入0.1 mL酶液，在40°C孵育I h，立即加入I. ImL 0. 4 M TCA溶液終止反應，渦旋混勻后在室溫下放置20 min，然后12000 r/min離心10 min,上清液中多肽含量用Lowry法測定。一個酶活力單位定義為每分鐘生成100 u g多肽所需的酶的量。


圖I接種量對凝乳酶活力的影響。圖2不同培養溫度對凝乳酶活力的影響。圖3搖床轉速對凝乳酶活力的影響。圖4裝液量對凝乳酶活力的影響。圖5培養基初始pH對凝乳酶活力的影響。
具體實施例方式下面的實施例對本發明作詳細說明，但對本發明沒有限制。本專利所用的菌株為解淀粉芽孢桿菌，購買于ATCC，編號為01855。實施例I
本實施例說明接種量對解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的影響，在發酵培養基其他條件相同的情況下，將解淀粉芽孢桿菌分別按分別以1%、1. 5%、3. 5%、5. 5%、7. 5%、9. 5%、11. 5%的
接種量接種入發酵培養基中。由圖I可以看出，接種量對解淀粉芽孢桿菌發酵產酶影響不大，但接種量小于1%時明顯抑制菌株產酶，當接種量為3. 5%時凝乳酶活力最大，隨著接種量的增加，凝乳酶活力緩慢降低，但變化不大，因此，接種量為3. 5%時較適宜。實施例2
本實施例說明不同培養溫度對解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的影響，在發酵培養基其他條件相同的情況下，培養溫度分布控制在24-38 °C。由圖2可以看出，在28_36°C的范圍內培養，該菌株都能進行良好的生長和產酶，且在36°C時凝乳酶活力、蛋白水解活力及二者比值均達到最大值，當培養溫度超過36°C時，凝乳酶活力和蛋白水解活力都在下降，但凝乳酶活力影響更大些，因此，選定36V為最佳培養溫度。實施例3
本實施例說明搖床轉速對解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的影響，在發酵培養基其他條件相同的情況下，搖床轉速依次采用60 r/min> 100 r/min> 120 r/min、140r /min、180 r/min、220 r/min、260 r/min。由圖3可以看出，搖床轉速為120 r/min時，凝乳活力與蛋白水解活力均達到最大值，且二者比值最大，其后隨著搖床轉速的增大，凝乳活力和蛋白水解活力緩慢下降，變化不大，因此選擇搖床轉速為120 r/min較適宜。實施例4
本實施例說明裝液量對解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的影響，在發酵培養基其他條件相同的情況下，100 mL三角瓶中的裝液量依次采用5 mL、15 mL、25 mL、35 mL、45 mL、55 mL
進行發酵培養。
由圖4可以看出，裝液量為25 mL時,凝乳活力和蛋白水解活力都達到最大值，隨著裝液量的增加，蛋白水解活力稍有下降，而蛋白水解活力降低得更為明顯。因此，選擇裝液量為25 mL較適宜。實施例5
本實施例說明培養基初始pH對解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的影響，在發酵培養基其他條件相同的情況下，培養基初始pH依次采用3、4、5、6、7、8，以自然pH (6. 8)為對照進行發酵培養。由圖5可以看出，培養基的初始pH不同，所產酶的凝乳活力和蛋白水解活力差別較大，培養基在酸性3. 0-6. 0的范圍內，凝乳活力與蛋白水解活力變化較大，當初始pH為6.0時,凝乳酶活力與蛋白水解活力均達到最大值,培養基在中性至堿性7. 0-8. 0的范圍內，凝乳酶活力與蛋白水解活力均比較穩定，因此，將培養基的初始PH控制在6.0較好。
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的方法，其特征在于，在100 mL搖瓶中配制一定體積的發酵培養基，接入一定量的解淀粉芽孢桿菌種子液，在恒溫振蕩器中培養溫度24 38°C，搖瓶轉速60-260 r/min，然后進行凝乳活力和蛋白水解活力的測定。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，種子培養基馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基馬鈴薯浸粉O. 5%,葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl O. 5%, 121°C滅菌20 min。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，發酵培養基馬鈴薯浸粉O.5%，葡萄糖I.13%，酵母浸粉 I. 76%, CaCO3 O. 32%, 121°C滅菌 20 min。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于解淀粉芽孢桿菌接種量為3.5%。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于培養溫度為36°C。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于搖床轉速為120r/min。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于最佳裝液量為25mL。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于培養基初始pH為6.O。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于凝乳活性的測定方法為，取5mL 100 g/L的脫脂乳，40°C保溫5 min后加入O. 5 mL經適當稀釋的發酵液混合，振蕩使它們混合均勻；準確記錄從加入酶液到乳凝固的時間(s);凝乳酶活力(milk-clotting activity,MCA )定義為40 min凝固I mL 10%脫脂乳的酶量為I個酶活力單位(Soxhelt Unit,Su) ；MCA = ( 2400X5XD) / ( TXO. 5)式中MCA 為凝乳酶活力 / ( Su/mL) ；T 為凝乳時間/s ；D為稀釋倍數。
10.根據權利要求I所述的方法，其特征在于蛋白水解活力的測定方法為底物是牛乳全酪蛋白，用PH 6. 5 O. IM磷酸鹽緩沖液配制2%酪蛋白溶液，I mL底物溶液加入O. I mL酶液，在40°C孵育I h，立即加入I. I mL O. 4 M TCA溶液終止反應，渦旋混勻后在室溫下放置20 min,然后12000 r/min離心10 min,上清液中多肽含量用Lowry法測定；一個酶活力單位定義為每分鐘生成100 μ g多肽所需的酶的量。
全文摘要
本發明提供了一種解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶發酵的方法，本發明為了進一步提高解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)發酵產凝乳酶的活力，對影響解淀粉芽孢桿菌凝乳酶活力的培養溫度、搖床轉速、培養基初始pH及發酵時間等主要因素進行了優化試驗，確定最佳發酵條件，在100mL三角瓶中裝25mL發酵培養基，接種量3.5%，培養溫度36℃，培養基最初pH為6.0，發酵時間為20h，搖床轉速為120r/min，凝乳酶活力可達最高值。
文檔編號C12R1/07GK102634501SQ201210135058
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者張斌 申請人:蘇州百趣食品有限公司