一種利用琥珀酸放線桿菌發酵產丁二酸的方法

專利名稱：一種利用琥珀酸放線桿菌發酵產丁二酸的方法
技術領域：
本發明屬于發酵技術領域，具體涉及一種利用琥珀酸放線桿菌發酵產丁二酸的方法。
背景技術：
丁二酸(succinic acid)又稱琥珀酸，被廣泛應用于醫藥、農藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業，作為C4平臺化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內酯等有機化學品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來12種最有價值的生物煉制產品之一。丁二酸的生產方法主要包括化學合成法和微生物發酵法，利用微生物發酵法轉 化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環境友好，且在發酵過程中可以吸收固定CO2，能有效緩解溫室效應，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來成為研究的熱點。丁二酸的生產菌株主要集中在Anaerobiospirillumsucciniciproducens'ActinobaciIlus succinogenes^Mannheimia succiniciproducens、重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。芭蕉芋(Canna edulis Ker.)，又稱蕉藕、姜芋等，為蕉科、美人蕉屬中的一種單子葉塊根植物，主要分布于我國南方的云南、貴州、四川、廣西、海南等省區。芭蕉芋的主要成分為淀粉，其含量高達17%_18%，畝產為2 500-5 500 kg。芭蕉芋干片化學組成為淀粉66. 0%,灰分 2. 80 %，粗纖維 2. 65%,脂肪 0. 28%，蛋白質 3. 63 %，單寧 0. 19 %，水分 17. 10%。由于芭蕉芋適口性較差，傳統上僅用作飼料，尚未得到很好的開發利用。發酵是一種復雜的生化過程，受很多因素的影響，如菌體自身的生產性能、培養基的配比、種子的質量、發酵條件和發酵過程控制等都與目的產物的產出有密切的關系。在工業生產中，為了最大限度的發揮菌體的生產能力，應該提供最優的生產培養基和培養條件。因此，探索菌株高產特性充分表達的最優培養條件是發酵生產的基礎和關鍵。

發明內容
本發明的目的在于提供了一種利用琥珀酸放線桿菌發酵產丁二酸的方法，以芭蕉芋糖衆為主要原料，利用琥拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes) CICC11014發酵生產丁二酸，通過對菌株培養基的研究，確定了菌株最適的發酵培養基優化后發酵培養基芭蕉芋糖漿(以總糖計)89. 66 g/L, CSL 38. 55 g/L, Na2HPO4 Iffi2O 2. 23 g/L,KH2PO4 *3H20 2. 23 g/L,MgCO3 60 g/L, pH 6. 5，115°C濕熱滅菌 20 min。此最優培養基條件下發酵可以提高糖的轉化率，使丁二酸的產量達到70 g/L。I. 一種利用琥珀酸放線桿菌CICC11014發酵產丁二酸的方法，其特征在于用芭蕉芋糖漿做碳源，將培養基裝于100 mL厭氧瓶中(裝液體積50 mL)，接種量5%，充入100%C02。每個實驗做3個平行樣，取平均值并計算誤差。2.步驟I所述的芭蕉芋糖漿的制備取芭蕉芋塊莖(產地中國四川省)，切片、烘干后在粉碎機上打碎，加水浸泡2h;調pH 6. 7，加高溫淀粉酶(無錫賽德酶制劑廠)20U/g干粉，105°C液化20-40 min;再降溫至60°C，調pH 4. 5，加入糖化酶300 U/g干粉，糖化8-12 h，再經過過濾得芭蕉芋糖漿，糖漿含總糖15%-20% ( w/w)。3.步驟I所述的種子培養基葡萄糖10 g/L，酵母膏15 g/L, Na2HPO4 *12H20 I g/LjKH2PO4 *3H20 I g/L，121°C濕熱滅菌20 min 后冷卻，并加入5%膜濾后的 I mol/L NaHCO3,以緩沖培養時種子液的pH變化。4 步驟I所述的初始發酵培養基芭蕉芋糖漿(以總糖計)65 g/L，玉米漿(CSL，固形物含量 55%) 20 g /L，Na2HPO4 Iffi2O I g /L，KH2PO4 3H20 I g /L，MgCO3 60 g/L, pH 值 6. 5，115°C濕熱滅菌 20 min。5.步驟4所述的具體培養基優化方法是，進行碳源實驗時，除總糖按照實驗濃度夕卜，其他成分與初始發酵培養基相同；氮源實驗時，除氮源按照實驗濃度外，碳源按照最優濃度外，其他成分與初始發酵培養基相同；CSL實驗時，除碳源濃度和氮源濃度按照最優濃度外，其他成分與初始發酵培養基相同；磷酸鹽實驗時，除磷酸鹽濃度(2種磷酸鹽濃度總和)按照實驗濃度外，碳源、氮源和CSL濃度按照最優濃度，其他成分與初始發酵培養基相同。6.步驟5所述的方法，其特征在于最佳碳源濃度為80 g/L。7.步驟5所述的最佳氮源為CSL。8.步驟6所述的最優CSL濃度為30 g/L。9.步驟5所述的最佳磷酸鹽濃度為6 g/L。


圖I不同碳源濃度對發酵生產丁二酸的影響。圖2不同氮源對芭蕉芋糖漿發酵生產丁二酸的影響。圖3不同CSL濃度對芭蕉芋糖漿發酵生產丁二酸的影響。圖4不同磷酸鹽濃度對芭蕉芋糖漿發酵生產丁二酸的影響。
具體實施例方式下面的實施例對本發明作詳細說明，但對本發明沒有限制。本專利所用的菌株為琥珀酸放線桿菌CICC11014，購自于ATCC，編號為55618。實施例I
本實施例說明不同碳源濃度對發酵生產丁二酸的影響，分別以葡萄糖和芭蕉芋糖漿為不同碳源，按照總糖濃度20 g/L, 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L和100 g/L配制發酵培養基，比較A. succinogenes CICC11014對色蕉芋糖衆和葡萄糖的利用情況,實驗結果如圖I所示。圖I結果表明，A 利用色蕉芋糖衆作為碳源的效果要明顯好于葡萄糖。使用葡萄糖做碳源時，以初始發酵培養基含60 g/L總糖時丁二酸產量為最高，達到36. 45 g/L;而使用芭蕉芋糖漿做碳源時，以初始發酵培養基含80 g/L總糖時丁二酸產量為最高，達到52. 14 g/L。實施例2
本實施例說明不同氮源對芭蕉芋糖漿發酵生產丁二酸的影響，其中發酵培養基中各有機或無機氮源的添加量以相同的氮元素含量為基準，分別為NH4C1 4.5 g/L, KNO3 8 g/L,酵母膏12. 5 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米漿(CSL) 20 g/L (固形物含量55%)，胰酪胨大豆胨蛋白(TSB) 15 g/L，牛肉膏12 g/L，空白(不加入任何氮源)。
由圖2可以看出，當不加入任何外加氮源時，利用芭蕉芋糖漿發酵能夠產生13.69 g/L的丁二酸；而在相同條件下使用葡萄糖發酵時則幾乎不產生丁二酸(數據未列出)。這種現象說明，在芭蕉芋糖漿中除了含有豐富的碳源外，還含有一些能夠被Asuccinogenes利用的氮源營養物質,從而促進了菌體的生長和產酸。該菌對無機氮源的同化作用較差，幾乎不能利用無機氮源。當發酵培養基中外加入各有機氮源時，以CSL( 20 g/L)的產丁二酸量為最高(62.32 g /L)。雖然酵母膏的產酸量與CSL基本相當，但由于酵母膏的價格較高，考慮到今后工業化生產成本，在以后的實驗中均采用CSL作為發酵培養基的氮源添加物。實施例3
本實施例說明不同CSL濃度對芭蕉芋糖漿發酵生產丁二酸的影響，使CSL濃度分別為10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L，發酵后測定丁二酸含量。由圖2可知，CSL濃度為30 g/L時，丁二酸產量最高為68. 42 g/L。實施例4
本實施例說明不同磷酸鹽濃度對芭蕉芋糖漿發酵生產丁二酸的影響，在上面其他最優條件下，在初始發酵培養基中分別添加磷酸鹽濃度分別為0 g/L, I. 5 g/L, 6 g/L, 10. 5 g/L，15 g/L，發酵后測定丁二酸含量。圖4可以看出，磷酸鹽濃度為6 g/L時丁二酸產量最高為70 g/L。
權利要求
1.一種利用琥珀酸放線桿菌CICC11014發酵產丁二酸的方法，其特征在于用芭蕉芋糖漿做碳源，將培養基裝于100 mL厭氧瓶中，接種量5%，充入100% CO2 ;每個實驗做3個平行樣，取平均值并計算誤差。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于芭蕉芋糖漿的制備取芭蕉芋塊莖，切片、烘干后在粉碎機上打碎，加水浸泡2 h;調pH 6. 7，加高溫淀粉酶20 U/g干粉，105°C液化20-40 min;再降溫至60°C，調pH 4. 5，加入糖化酶300 U/g干粉，糖化8-12 h，再經過過濾得芭蕉芋糖漿，糖漿含總糖15%_20% ( w/w)。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于種子培養基葡萄糖10g/L，酵母膏15 g/L, Na2HPO4 12H20 I g/L, KH2PO4 3H20 I g/L，121°C濕熱滅菌 20 min 后冷卻，并加入 5%膜濾后的I mol/L NaHCO3，以緩沖培養時種子液的pH變化。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于初始發酵培養基芭蕉芋糖漿(以總糖計)65 g/L，玉米漿(CSL，固形物含量 55%) 20 g /L，Na2HPO4 12H20 I g /L，KH2PO4 3H20I g /L，MgCO3 60 g /L, pH 值 6. 5，115°C濕熱滅菌 20 min。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于進行碳源實驗時，除總糖按照實驗濃度外，其他成分與初始發酵培養基相同；氮源實驗時，除氮源按照實驗濃度外，碳源按照最優濃度外，其他成分與初始發酵培養基相同；CSL實驗時，除碳源濃度和氮源濃度按照最優濃度夕卜，其他成分與初始發酵培養基相同；磷酸鹽實驗時，除磷酸鹽濃度(2種磷酸鹽濃度總和)按照實驗濃度外，碳源、氮源和CSL濃度按照最優濃度，其他成分與初始發酵培養基相同。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于碳源濃度為80g/L。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于為CSL實驗。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于CSL濃度為30g/L。
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于磷酸鹽濃度為6g/L。
全文摘要
本發明提供了一種利用琥珀酸放線桿菌發酵產丁二酸的方法，以芭蕉芋糖漿為主要原料，利用琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)CICC11014發酵生產丁二酸，通過對菌株培養基的研究，確定了菌株最適的發酵培養基優化后發酵培養基:芭蕉芋糖漿(以總糖計)89.66g/L，CSL38.55g/L，Na2HPO4·12H2O2.23g/L，KH2PO4·3H2O2.23g/L，MgCO360g/L，pH6.5，115℃濕熱滅菌20min。此最優培養基條件下發酵可以提高糖的轉化率，使丁二酸的產量達到70g/L。
文檔編號C12R1/01GK102643873SQ20121013506
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者張斌 申請人:蘇州百趣食品有限公司