本發明涉及一種制備方法，尤其是一種用于高通量焦磷酸測序芯片微反應池陣列的制備方法，屬于焦磷酸測試的技術領域。
背景技術：
在現有的第2代測序儀中，基于焦磷酸測序原理的高通量基因測序儀，具有測序速度快、讀長長等優勢，在從頭測序(denovosequencing)和宏基因組測序(metagenomesequencing)方面有著不可替代的作用。高通量基因測序儀以焦磷酸測序原理為基礎，通過陣列式微反應池測序芯片完成測序過程，其基本工作原理是：將包被有擴增后dna文庫的微球及酶分子填入測序芯片的陣列式微反應池，使焦磷酸測序反應在每個微反應池中獨立進行，陣列式微反應池的數目決定了測序通量。測序芯片背面與ccd(charge-coupleddevice)緊密貼合，測序反應釋放的光信號從微反應池底部并行傳輸至ccd，并以圖像形式輸出。將測序全過程產生的圖像經分析后對準疊加，就可得到待測dna文庫的堿基序列。
目前，基于焦磷酸測序原理的高通量基因測序儀主要有454測序儀和bigis-4測序儀，其使用的測序芯片均是由roche公司研制的ptp(picotiterplate)，目前全球僅有roche公司具備生產ptp的能力，其價格昂貴，約為1000美元/片，且不可重復使用；此外，ptp制備工藝復雜并且受到相關專利技術的保護。
因此，如何制備用于高通量焦磷酸測序芯片的微反應池是目前的難題。
技術實現要素：
本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種用于高通量焦磷酸測序芯片微反應池陣列的制備方法，其能有效制備得到微反應池，與現有工藝兼容，能有效降低成本，安全可靠。
按照本發明提供的技術方案，一種用于高通量焦磷酸測序芯片微反應池陣列的制備方法，所述微反應池陣列的制備方法包括如下步驟：
步驟1、提供光纖面板，并對所述光纖面板進行所需的清洗；
步驟2、在上述清洗后的光纖面板上涂覆得到su8光刻膠膜；
步驟3、對上述光纖面板以及su8光刻膠膜進行熱烘，在熱烘時，先在65℃～85℃下熱烘5min～15min，然后在95℃～105℃下熱烘10min～20min；
步驟4、對上述su8光刻膠膜進行曝光，以在光纖面板上得到圖形化光刻膠膜；
步驟5、對上述光纖面板以及圖形化光刻膠膜再次熱烘，并在熱烘后置于氮氣環境中冷卻至室溫；其中，在熱烘時，先在65℃～85℃下熱烘10min～20min，然后在90℃～100℃下熱烘15min～25min，再降至45℃～65℃下熱烘10min～20min，最后自然冷卻至常溫；
步驟6、對上述圖形化光刻膠膜進行顯影，以在光纖面板上得到所需的微反應池陣列，所述微反應池陣列內包括若干微反應池，所述微反應池包括垂直于光纖面板上的反應池體以及位于所述反應池體內中心區的池體槽，所述池體槽貫通反應池體。
在光纖面板上得到微反應池陣列后，將具有微反應池陣列的光纖面板置于烘箱中，其中，先將烘箱的溫度設定在180℃～210℃并保持2h，然后逐步降溫至常溫。
在逐步降溫過程中，依次將烘箱內的溫度降至150℃、100℃、50℃，最后將烘箱內的溫度降至常溫；其中，在烘箱內的溫度降至150℃后，使得烘箱內溫度在150℃保持10min～15min，烘箱內的溫度降至100℃后，使得烘箱內溫度在100℃保持10min～15min；烘箱內的溫度降至50℃后，使得烘箱內的溫度在50℃保持10min～15min。
所述反應池體的深度為30μm，反應池體的側壁厚度為6μm，池體槽的寬度為28μm。
步驟1中，對光纖面板的清洗過程包括如下步驟：
步驟1.1、將光纖面板置于玻璃水中，并利用超聲清洗后，利用去離子水清洗，在用去離子水清洗后，用氮氣將光纖面板吹干；
步驟1.2、對光纖面板利用等離子體清洗，并在清洗后，依次采用三氯乙烯、丙酮、乙醇對所述光纖面板進行有機清洗，在有機清洗后，利用去離子水對光纖面板進行清洗；
步驟1.3、對上述清洗后的光纖面板采用氮氣吹干，并將吹干后的光纖面板置于110℃～130℃中熱烘20min～40min；在熱烘后，光纖面板降至常溫后，置于氮氣柜中。
步驟2中，在涂覆得到su8光刻膠膜時包括如下步驟：
步驟2.1、提供su8光刻膠液并靜置排泡，取靜置排泡后的su8光刻膠液10ml并滴在置于勻膠機托盤上的光纖面板上；
步驟2.2、利用勻膠機轉動光纖面板，在轉動時，光纖面板在600r/min～700r/min下轉動10s～20s，然后在2000r/min～2500r/min下轉動30s～40s，最后在800r/min～1000r/min下轉動10s～20s；在轉動結束后，能在光纖面板上得到25μm～30μm的su8光刻膠膜。
步驟4中，利用365nm的紫外線下對su8光刻膠膜進行曝光，曝光劑量為170mj/cm2～200mj/cm2。
步驟6中，顯影時，包括如下步驟：
步驟6.1、將光纖面板以及圖形化光刻膠膜泡在顯影液中1min～2min，然后再晃動20s～30s，最后將光纖面板以及圖形化光刻膠膜在顯影液中顯影10min～30min；
步驟6.2、將對光纖面板以及圖形化光刻膠膜利用新的顯影液并顯影6min～12min，在顯影后，利用異丙醇漂洗2min～10min，以在光纖面板上得到所需的微反應池陣列。
所述池體槽的橫截面呈六邊形。
本發明的優點：在光纖面板上涂覆得到su8光刻膠膜，通過對su8光刻膠膜進行前烘、曝光、后烘以及顯影等工藝，能在光纖面板上制備得到微反應池陣列；在勻膠過程中，對光纖面板的勻膠速度采用梯度升降速，避免了快速終止對su8光刻膠膜表面平整度的影響；由于su8熱膨脹系數較高，前烘過程、后烘過程會給su8光刻膠膜帶來熱應力，同時su8與光纖面板的熱膨脹性能差異也容易使得su8從光纖面板表面脫落，為了有效緩解su8熱應力并增加其與襯底的粘附性，在前烘工藝、后烘工藝中，均采用梯度升降溫方式來控制熱烘過程，從而能避免su8光刻膠的膨脹變形，能有效制備得到微反應池，與現有工藝兼容，且能實現對高通量焦磷酸的測序，能有效降低成本，安全可靠。
附圖說明
圖1～圖4為本發明具體實施工藝步驟剖視圖，其中
圖1為本發明光纖面板的剖視圖。
圖2為本發明在光纖面板上得到su8光刻膠膜后的剖視圖。
圖3為本發明利用掩模版對su8光刻膠膜圖形化后的剖視圖。
圖4為本發明在光纖面板上得到微反應池陣列后的剖視圖。
圖5為本發明微反應池陣列在光纖面板上的俯視圖以及微反應池的放大的示意圖。
附圖標記說明：1-光纖面板、2-su8光刻膠膜、3-掩模版、4-圖形化光刻膠膜、5-微反應池、6-池體槽以及7-反應池體。
具體實施方式
下面結合具體附圖和實施例對本發明作進一步說明。
如圖1～圖5所示：為了能有效制備得到微反應池，本發明的微反應池陣列的制備方法包括如下步驟：
步驟1、提供光纖面板1，并對所述光纖面板1進行所需的清洗；
如圖1所示，為光纖面板1的剖視圖，本發明實施例中，采用光纖面板1作為基片材料；光纖面板1具有傳光效率高，級間耦合損失小，圖像傳輸清晰、真實，在光學上具有零厚度等特點，適用于微弱光信號或圖像傳輸的特性，具體地，對光纖面板1的清洗過程包括如下步驟：
步驟1.1、將光纖面板1置于玻璃水中，并利用超聲清洗后，利用去離子水清洗，在用去離子水清洗后，用氮氣將光纖面板1吹干；
具體地，玻璃水的濃度可以為1％，在超聲清洗中，超聲功率可為100w～1000w，超聲清洗10min，在超聲清洗后放置2小時以上，再將光纖面板1在100w～1000w功率的超聲下清洗10min，在超聲振動時，超聲振動的頻率為超聲振動的頻率為50khz～150khz。采用去離子水清洗，以及氮氣吹干光纖面板1的過程與現有清洗、氮氣吹干工藝相一致，具體為本技術領域人員所熟知，此處不再贅述。
步驟1.2、對光纖面板1利用等離子體清洗，并在清洗后，依次采用三氯乙烯、丙酮、乙醇對所述光纖面板1進行有機清洗，在有機清洗后，利用去離子水對光纖面板1進行清洗；
本發明實施例中，在利用三氯乙烯、丙酮、乙醇進行有機清洗過程中，不需要使用去離子水進行沖洗光纖面板1，在乙醇清洗結束后，再用去離子水清洗光纖面板1，可以對光纖面板1清洗20遍以上。三氯乙烯可選用的濃度為99.5％，丙酮可選用的濃度為99.5％，乙醇的濃度可選用的濃度為99.5％，當然，三氯乙烯、丙酮以及乙醇還可以選用其他所需的濃度，具體可以根據需要進行選擇，具體為本技術領域人員所熟知，此處不再贅述。
步驟1.3、對上述清洗后的光纖面板1采用氮氣吹干，并將吹干后的光纖面板1置于110℃～130℃下熱烘20min～40min；在熱烘后，光纖面板1降至常溫后，置于氮氣柜中。
本發明實施例中，采用現有常用的高純氮氣對光纖面板1進行吹干，然后將光纖面板1置于110℃～130℃的烘箱中熱烘20min～40min，在烘箱中降至常溫后，將光纖面板1置于氮氣柜中待用。加熱后能去除光纖面板1上的水汽。
步驟2、在上述清洗后的光纖面板1上涂覆得到su8光刻膠膜2；
具體地，在涂覆得到su8光刻膠膜2時包括如下步驟：
步驟2.1、提供su8光刻膠液并靜置排泡，取靜置排泡后的su8光刻膠液10ml并滴在置于勻膠機托盤上的光纖面板1上；
本發明實施例中，su8光刻膠可采用su-82025光刻膠。su8光刻膠的機械性能優良且具有較好的生物兼容性。su8是一種負性、環氧型、近紫外光刻膠，具有高深寬比>5:1，且具有生物兼容性。su8可應用于厚膠光刻工藝。
在涂覆前，需要將su8光刻膠液靜置，以排出su8光刻膠液中的氣泡。為了能實現在光纖面板1上均勻涂覆su8光刻膠液，將光纖面板1置于勻膠機的托盤上，打開勻膠機的真空吸附按鈕，確保光纖面板1能牢固地吸附在勻膠機的托盤上，其中，勻膠機可以采用本技術領域常用的設備，具體利用勻膠機吸附光纖面板1以及驅動光纖面板1轉動的過程均與現有相一致，具體為本技術領域人員所熟知，此處不再贅述。
步驟2.2、利用勻膠機轉動光纖面板1，在轉動時，光纖面板1在600r/min～700r/min下轉動10s～20s，然后在2000r/min～2500r/min下轉動30s～40s，最后在800r/min～1000r/min下轉動10s～20s；在上述轉動后，勻膠機的電機關閉，光纖面板1在慣性下轉動直至停止轉動，在轉動結束后，能在光纖面板1上得到25μm～30μm的su8光刻膠膜2。
如圖2所示，為在光纖面板1上得到8光刻膠膜2的剖視圖。采用上述工藝在光纖面板1上勻膠時，由于采用梯度降速，避免了快速終止對su8光刻膠膜2表面平整度的影響。
步驟3、對上述光纖面板1以及su8光刻膠膜2進行熱烘，在熱烘時，先在65～85℃下熱烘5min～15min，然后在95～105℃下熱烘10min～20min；在上述烘烤后，降至45～65℃下熱烘10min～20min，最后自然冷卻至常溫；
具體地，將光纖面板1置于熱板上，以實現對光纖面板1以及su8光刻膠膜2進行熱烘，即進行前烘工藝。具體實施時，由于su8光刻膠的熱膨脹系數較高，熱烘過程會給su8光刻膠膜2帶來熱應力，同時su8光刻膠膜2與光纖面板1的熱膨脹性能差異，也容易使得su8光刻膠膜2從光纖面板1表面脫落。為了有效緩解su8光刻膠膜2的熱應力并增加其與光纖面板1的粘附性，本發明實施例中，采用梯度升降溫的方式進行前烘，能有效避免su8光刻膠在前烘過程中膨脹變形帶來的問題。
步驟4、對上述su8光刻膠膜2進行曝光，以在光纖面板1上得到圖形化光刻膠膜；
如圖3所示，利用掩模版3對su8光刻膠膜2進行曝光，曝光時，利用365nm的紫外線下對su8光刻膠膜2進行曝光，曝光劑量為170mj/cm2～200mj/cm2。
步驟5、對上述光纖面板1以及圖形化光刻膠膜再次熱烘，并在熱烘后置于氮氣環境中冷卻至室溫；其中，在熱烘時，先在65℃～85℃下熱烘10min～20min，然后在90℃～100℃下熱烘15min～25min；在上述烘烤后，降至45℃～65℃下熱烘10min～20min，最后自然冷卻至常溫；
具體地，將光纖面板1以及圖形化光刻膠膜4置于熱板上熱烘，即進行后烘工藝。本發明實施例中，由于光纖面板1與su8熱膨脹系數差異，會產生較大的熱應力，這與前烘過程中的熱應力是一致的，除了熱應力之外，su8中的環氧樹脂分子在熱催化下進一步交聯，并產生較大的內應力，所以也需采用梯度升溫降溫的方式來避免其膨脹變形。
步驟6、對上述圖形化光刻膠膜進行顯影，以在光纖面板1上得到所需的微反應池陣列，所述微反應池陣列內包括若干微反應池5，所述微反應池5包括垂直于光纖面板1上的反應池體7以及位于所述反應池體7內中心區的池體槽6，所述池體槽6貫通反應池體7。
具體地，顯影時，包括如下步驟：
步驟6.1、將光纖面板1以及圖形化光刻膠膜泡在顯影液中1min～2min，然后再晃動20s～30s，最后將光纖面板1以及圖形化光刻膠膜在顯影液中顯影10min～30min；
步驟6.2、將對光纖面板1以及圖形化光刻膠膜利用新的顯影液并顯影6min～12min，在顯影后，利用異丙醇漂洗2min～10min，以在光纖面板1上得到所需的微反應池陣列。
本發明實施例中，顯影液為pgmea溶液，可選用的濃度濃度為99.5％，顯影的總時間為20min～30min。利用pgmea進行具體顯影的過程與現有相一致，具體為本技術領域人員所熟知，此處不再贅述。
如圖5所示，在顯影后，在光纖面板1上的多微反應池陣列，其中，微反應池陣列中包括若干微反應池5，每個微反應池5間相互獨立。對每個微反應池5，包括反應池體7，即反應池體7由上述su8光刻膠膜2制備得到。反應池體7垂直分布在光纖面板1上，反應池體7呈六面體狀，而池體槽6的橫截面呈六邊形。具體實施時，所述反應池體7的深度h為30μm，反應池體7的側壁厚度w為6μm，池體槽6的寬度l為28μm。此外，對于反應池體7的尺寸具體可以根據實際需要進行選擇，如可以根據dna細胞的大小來調節池體深度，但反應池體7的側壁厚度不能太薄，否則，反應池體7之間會有干擾。
本發明實施例中，微反應池陣列內微反應池5的數目決定了測序通量，在相同面積下，蜂窩結構的微反應池5可使得微反應池陣列內微反應池5的數目達到最大，為高通量測序提供保障，如圖5所示。反應池體7的側壁厚度盡量縮小，以增加式微反應池陣列內微反應池5的密度，反應池體7內池體槽8的深度略大于包被dna文庫的微球直徑，在保障微反應池中測序反應單獨分離的前提下使每個微反應池5中至多有一個dna微球。
進一步地，在光纖面板1上得到微反應池陣列后，將具有微反應池陣列的光纖面板1置于烘箱中，其中，先將烘箱的溫度設定在180℃～210℃并保持2h(當然，具體保持的時間可以根據實際需要進行調整)，然后逐步降溫至常溫。本發明實施例中，，將光纖面板1以及微反應池陣列置于210℃的烘箱中，能增加微反應池陣列中微反應池5的機械強度，以及微反應池5與光纖面板1的粘附性，提高微反應池陣列在光纖面板1上的穩定性與可靠性。
具體地，在逐步降溫過程中，依次將烘箱內的溫度降至150℃、100℃、50℃，最后將烘箱內的溫度降至常溫；其中，在烘箱內的溫度降至150℃后，使得烘箱內溫度在150℃保持10min～15min，烘箱內的溫度降至100℃后，使得烘箱內溫度在100℃保持10min～15min；烘箱內的溫度降至50℃后，使得烘箱內的溫度在50℃保持10min～15min。