一種丹參素的生產方法及工程菌與流程

本發明涉及一種丹參素的生產方法及工程菌，屬于生物工程
技術領域：
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背景技術：
提取自丹參的丹參素，學名r-(+)-3-(3，4-二羥基苯基)-2-羥基丙酸、d-(+)-β-(3，4-二羥基苯基)乳酸，英文名為：danshensu、d-dss、r-dss、(r)-(+)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-lacticacid、(r)-(+)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoicacid，是一種右旋酚酸類化合物。目前不存在天然的左旋丹參素。丹參素是丹參水提液中的重要有效成份，國內于1980年從丹參水提液中得到并鑒定了結構(丹參水溶性有效成分的研究，ⅱ.d(+)β(3，4-二羥基苯基)乳酸的結構，上海第一醫學院學報，1980，05(7)，384-385)，各種研究表明丹參素具有重要的藥理藥效作用，在心腦血管疾病的治療等方面具有獨特治療作用。當前丹參素主要從丹參中提取得到(專利cn200810038853.9)。丹參素在丹參中的含量較低，并且丹參素種植成本高且產量有限，因此當前丹參素不僅價格高而且遠遠無法滿足市場的需求。專利cn201310559498.0提出了一種構建大腸桿菌基因工程菌利用葡萄糖發酵產丹參素的方法，由于合成代謝途徑涉及利用羥基化酶，該酶很容易使代謝過程產物氧化而影響丹參素的產率，同時由于大腸桿菌發酵是高耗氧過程，也會氧化丹參素，因此當前該方法產率較低，成本將會高于植物提取過程。專利cn201210190171.6提出了水解丹酚酸b生產丹參素的方法，丹酚酸b需從丹參提取，并且化學水解過程有大量副反應，同樣不適用于規模化生產。手性合成丹參素(專利cn201210420488.4)的催化劑極為昂貴，當前也僅停留在實驗室水平。早在1988年roth等人提出了先以化學法處理左旋多巴得到對應的3，4-二羥基苯丙酮酸，再酶法合成s-(+)-3-(3，4-二羥基苯基)-2-羥基丙酸(s-dss，l-dss)的方法(enzymaticsynthesisof(s)-(-)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)lacticacid，arch.pharm.(weinheim)321，179-180(1988))。z.findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶將左旋多巴轉化成3，4-二羥基苯丙酮酸，然后再用d-乳酸脫氫酶還原生成d-(3，4-二羥基苯基)乳酸(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzedwithd-lactatedehydrogenasefromlactobacillusleishmanniiusinggeneticalgorithm，chem.biochem.eng.q.19(4)351–358(2005))。這兩種方法制備3，4-二羥基苯丙酮酸中間體的成本較高，且操作復雜。在前期的研究中，發明人開發了一種三基因共表達生產丹參素的方法(cn201710652387.2)中，但底物和產物容易被大腸桿菌中的酚類降解酶所分解，而且大腸桿菌中相關輔酶量不充足。技術實現要素：基于目前各種方法的缺陷，本發明提了了一種光學純的丹參素的生產方法，并構建了多酶共表達的工程菌，實現了丹參素的高效生產。本發明所要解決的技術問題是提供一種能低成本生產丹參素的重組菌。同時本發明要解決該菌株的構建和應用的技術問題。本發明的第一個目的是提供能低成本生產光學純丹參素的重組菌；所述重組菌同時表達3種酶，分別為l-氨基酸氧化酶、葡萄糖脫氫酶、α-羥基羧酸脫氫酶，并在宿主大腸桿菌的基礎上敲除了酚類化合物分解相關的基因。。在一種實施方式中，所述α-羥基羧酸脫氫酶為d型α-羥基羧酸脫氫酶，來自lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一種實施方式中，所述α-羥基羧酸脫氫酶為l型α-羥基羧酸脫氫酶，來自bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一種實施方式中，所述α-羥基羧酸脫氫酶為d-α-羥基羧酸脫氫酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.為wp_003643296.1、wp_002335374.1、或eei22188.1的序列；α-羥基羧酸脫氫酶為l-α-羥基羧酸脫氫酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno為wp_013858488.1、wp_003607654.1或wp_035430779.1的序列。在一種實施方式中，d-α-羥基羧酸脫氫酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.為nz_gl379761region:complement(533562..534560)、nz_kb944641region:161892..162830、acgi01000078region:20793..21791的序列；l-α-羥基羧酸脫氫酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.為nz_atum01000014region:39316..40254、nz_jqay01000006region:69708..70640、nz_gg669901region:45517..46470的序列。在一種實施方式中，所述葡萄糖脫氫酶來自bacillussubtilisatcc13952。在一種實施方式中，所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno為wp_013351020.1序列。在一種實施方式中，所述葡萄糖脫氫酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno為：nz_cp009748region:386154..38693。在一種實施方式中，所述l-氨基酸氧化酶為的來自proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc49993、providenciarettgeridsm1131或ignatzschinerialarvaedsm13226中的不產過氧化氫的l-氨基酸氧化酶。在一種實施方式中，l-氨基酸氧化酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno為wp_004244224.1、oat30925.1、efe55026.1、wp_036414800.1或wp_026879504.1的序列。在一種實施方式中，l-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如序列表中的：nz_gg668576region:1350390..1351805、lxen01000066region:20563..21963、acci02000030region:21025..22443、nz_lagc01000006region:309569..310993、nz_ki783332region:35799..37217。在一種實施方式中，所述重組菌，包括將編碼l-氨基酸氧化酶、α-羥基羧酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的基因，都連接到質粒上，構建得到三基因共表達重組質粒，然后將重組質粒轉化相應菌株，得到重組工程菌。在一種實施方式中，所述重組菌是以escherichiacolibl21(de3)為宿主構建得到的。在一種實施方式中，所述敲除的酚類物質分解基因為hpad、mhpb中的任意一種或者兩種組合。在一種實施方式中，所述酚類物質分解基因的核苷酸序列是ncbi上accessionno為：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。在一種實施方式中，所述強化表達是通過將escherichiacolibl21(de3)基因組上所要強化表達的基因前增加組成型啟動子。在一種實施方式中，所述強化表達的基因為nada(nad合成基因)、ribf(fad合成基因)中的任意一種或多種。在一種實施方式中，所述nada為nc_012892region:740487..741530；ribf為nc_012892region:25479..26420。本發明的第二個目的是提供一種生產丹參素的方法，所述方法是利用本發明的重組菌。在一種實施方式中，所述生產丹參素，是進行全細胞轉化生產。在一種實施方式中，所述全細胞轉化生產的體系中，包括細胞濕重為1-200g/l，左旋多巴濃度為1-200g/l，葡萄糖濃度為1-200g/l，ph6.0-9.0；于15-40℃反應，時間1-48小時。本發明的有益效果：本發明構建了一種新型的三酶共表達基因工程菌，該菌可應用于光學純丹參素的生產，并通過進一步敲除或強化表達大腸桿菌基因組上的相將關基因減少產物的分解和提高輔酶的含量，從而提高了目標物的產量。本發明選擇的(d/l)-α-羥基羧酸脫氫酶均具有底物專一性差，光學專一性強的特點，可生產光學純的d-丹參素和l-丹參素，同時聯產丙酮酸。該生產過程簡單且原料易得，具有良好的工業化應用前景。具體實施方案本發明的工程菌的功能核心在于可以同時表達3種酶，分別為l-氨基酸氧化酶、α-羥基羧酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶。其原理為：在工程菌全細胞內，葡萄糖脫氫酶以菌體內的nad為輔酶將葡萄糖脫氫生成葡萄糖酸和nadh；左旋多巴被l-氨基酸氧化酶脫氨生成3,4-二羥基苯丙酮酸；α-羥基羧酸脫氫酶利用葡萄糖脫氫過程生成的nadh將3,4-二羥基苯丙酮酸還原成丹參素、同時實現了輔酶nad的再生。在此基礎上，通過敲除或強化表達大腸桿菌基因組上的相將關基因促進底物的轉運及減少產物的分解，從而提高了目標物的產量。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：1.本發明所涉及的菌株及質粒購自美國菌種保藏中心atcc的lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931、bacillussubtilisatcc13952、escherichiacolibl21(de3)、proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc49993、lactococcuslactisatcc19257。購自德國微生物菌種保藏中心dsmz的bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、providenciarettgeridsm1131、ignatzschinerialarvaedsm13226。購自novagen公司的petduet-1、pacycdue-1、pcoladuet-1、prsfduet-1質粒和escherichiacolibl21(de3)。2.大腸桿菌中相關基因的敲除及組成型強化表達(1)大腸桿菌中酚類物質降解基因的敲除本發明中的酚類物質都極易被大腸桿菌中的酶分解，根據文獻(biodegradationofaromaticcompoundsbyescherichiacoli，microbiolmolbiolrev.2001,65(4):523–569.)，將相關基因敲除，避免產物和底物的分解。選擇的基因是hpad和mhpb,ncbi上accessionno為：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。(2)大腸桿菌輔酶合成相關重要基因的組成型強化表達在α-羥基羧酸脫氫酶還原過程中需要以nadh為輔酶，強化表達大腸桿菌nad合成途徑的關鍵酶，可以提高菌體內的nad水平，從而有利于丹參素的生成。選擇的基因有nada。ncbi上accessionno為：nc_012892region:740487..741530。fad是l-氨基酸氧化酶的輔酶，過表達該輔酶途徑中的重要基因ribf，有利于強化l-氨基酸氧化酶活性。ncbi上accessionno為：nc_012892region:25479..26420。3.酶的選擇(1)l-氨基酸氧化酶的選擇l-氨基酸氧化酶廣泛存在于細菌、真菌、哺乳動物細胞、蛇毒、昆蟲毒素及藻類中(l-aminoacidoxidaseasbiocatalyst:adreamtoofar.appl.microbiol.biotechnol.2013,97:9323-41)。l-氨基酸氧化酶將α氨基和cα上的氫轉移到fad上，絕大部份利用分子氧直接氧化還原型fad，再生氧化型fad，同時生成過氧化氫。例如poljanac等采用東部菱背響尾蛇毒l-氨基酸氧化酶氧化多巴生成3,4-二羥基苯丙酮酸，然后再加乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶生成成3,4-二羥基苯乳酸，在此過程中另外必須添加過氧化氫酶以消除過氧化氫的毒性(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzed,chem.biochem.eng.q.2005,19(4)351–358)。另外還有一類l-氨基酸氧化酶與細胞膜上電子傳遞鏈相關，電子經過呼吸鏈傳遞給細胞色素氧化酶，使分子氧還原為水，從而不生成過氧化氫，這種酶類主要存在于變形桿菌屬(proteussp.)、普羅威登菌屬(providenciasp.)、摩根菌屬(morganellasp.)等細菌中(crystalstructureofamembrane-boundl-aminoaciddeaminasefromproteusvulgaris.j.struct.biol.2016,195:306-15)。本發明選擇了5種不產過氧化氫的l-氨基酸氧化酶，從proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、providenciarettgeridsm1131、morganellamorganiiatcc49993、ignatzschinerialarvaedsm13226中分別克隆得到l-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、praao、mmaao、ilaao，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.為wp_004244224.1、oat30925.1、efe55026.1、wp_036414800.1或wp_026879504.1的序列，這些酶都具有底物廣泛和活性強的特點。(2)α-羥基羧酸脫氫酶的選擇根據最適底物的情況，α-羥基羧酸脫氫酶包含有乳酸脫氫酶、α-羥酸異己酸脫氫酶、扁桃酸脫氫酶、乙醛酸還原酶等，這些酶能廣泛作用于多種底物生成α-羥基羧酸，通常根據其最適作用的底物來命名。本發明從中選擇光學性強且對3，4-二羥基苯丙酮酸具有較強活性的酶，用于d或l丹參素的生產。從lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931中分別克隆得到d型α-羥基羧酸脫氫酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.為wp_003643296.1、wp_002335374.1、eei22188.1的序列。從bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、lactobacillusfermentumatcc14931中分別克隆得到l型α-羥基羧酸脫氫酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其氨基酸序列是ncbi上accessionno為wp_013858488.1、wp_003607654.1、wp_035430779.1的序列。(3)葡萄糖脫氫酶的選擇在生物轉化反應中，α-羥基羧酸脫氫酶需要以nadh和/或nadph為輔酶，采常有甲酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、亞磷酸酸脫氫酶等，葡萄糖脫氫酶相對于其它來酶來說活力最高，因此本發明從bacillussubtilisatcc13952得到葡萄糖脫氫酶基因bsgdh(氨基酸序列是wp_013351020.1)。4.共表達體系的構建及細胞的培養目前大腸桿菌多基因共表達有多種方法(大腸桿菌多基因共表達策略，中國生物工程雜志，2012，32(4):117-122)，本發明采用劉向磊(合成生物學技術改造大腸桿菌生產莽草酸及白藜蘆醇，2016，上海醫藥工業研究院，博士論文)所述方法構建，每個基因前均包含t7啟動子和rbs結合點，基因后帶有t7終止子。理論上來講因為每個基因前都有t7和rbs，因此基因的表達強度受排列次序的影響不大。每個質粒上包含三個基因，將構建好的質粒熱轉導入大腸桿菌感受態細胞中，并涂布于抗生素固體平板上，篩選得到陽性轉化子，即得到重組大腸桿菌。細胞的培養：根據經典的重組大腸桿菌培養及誘導表達方案，將重組大腸桿菌按體積比為2％的量轉接到lb發酵培養基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，當細胞od600達到0.6-0.8后，加入終濃度為0.4mm的iptg，在20℃誘導表達培養8h。誘導表達結束后，20℃、8000rpm、20分鐘離心收集細胞。5.全細胞轉化生產光學純丹參素細胞轉化生產的體系為：細胞濕重為1-200g/l，左旋多巴濃度為1-200g/l，葡萄糖濃度為1-200g/l，ph6.0-9.0，于15-40℃反應，時間1-48小時。轉化結束后液相色譜測定丹參素產量及構型。左旋多巴溶解度較低，高濃度情況下是含有不溶物的混懸液。5.樣品的檢測分析丹參素的定量分析：轉化液采用perkinelmerseries200高效液相色譜儀檢測分析，配紫外檢測器。色譜條件為：流動相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用漢邦megresc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱溫30℃、進樣量20μl，280nm。手性分析：perkinelmerseries200高效液相色譜儀檢測分析，配示紫外檢測器，chiralcelod-h手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷:異丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5ml/min，柱溫25℃，進樣量20μl，檢測波長280nm。丹參素溶解度較低，轉化過程如有結晶析出，則稀釋后測定。丹參素的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價。當生產r-丹參素時，對映體過量值％e.e＝[(sr-ss)/(sr+ss)×100％]當生產s-丹參素時，對映體過量值％e.e＝[(ss-sr)/(sr+ss)×100％]式中ss為轉化液中s-丹參素的峰面積，sr為轉化液中r-丹參素的液相色譜峰面積。為了使本發明所要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行詳細的說明。應當說明的是，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例1根據文獻largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法將escherichiacolibl21(de3)上的hpad和mhpb進行單或雙敲除。其中，本發明所用基因敲除的質粒為pcasred與pcrispr-gdna(hpadsgrna)與同源臂(hpaddonor)一起導入escherichiacolibl21(de3)上，cas9/sgrna誘發宿主在hpad基因位點發生雙鏈斷裂，重組酶red將hpaddonor整合到hpad基因上，實現基因的敲除，并測序驗證。hpadsgrna、hpaddonor、mhpbsgrna、mhpbdonor分別如序列表seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12所示。mhpb以同樣的方式敲除。配置ph為7的溶液，左旋多巴或d-丹參素4g/l，濕菌體量200g/l，35℃放置10小時后測定濃度，表1中顯示了反應體系中基左旋多巴和d-丹參素的剩余量。表1不同菌株對底物和產物分解后的剩余濃度左旋多巴g/ld-丹參素g/lescherichiacolibl21(de3)1.21.3escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)3.83.4escherichiacolibl21(δhpad,de3)1.82.9escherichiacolibl21(δmhpb,de3)1.62.1很顯然escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)效果最好，將之命名為escherichiacolihm。實施例2重組大腸桿菌構建：首先將編碼l-氨基酸氧化酶、α-羥基羧酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的基因，連接到petduet-1或pacycduet-1質粒上。得到三基因共表達重組質粒，將質粒轉化大腸桿菌escherichiacolihm，利用氯霉素和氨芐青霉素平板篩選得到陽性轉化子，即得到重組大腸桿菌。誘導表達方法：將重組大腸桿菌按體積比為2％的量轉接到lb發酵培養基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，當細胞od600達到0.6-0.8后，加入終濃度為0.4mm的iptg，在20℃誘導表達培養8h。誘導表達結束后，20℃、8000rpm、20分鐘離心收集細胞。將重組大腸桿菌誘導表達完成后收集菌體，于100ml反應體積中，細胞濕重為40g/l，左旋多巴濃度為40g/l，葡萄糖濃度為30g/l，ph8.0，于35℃反應，時間12小時。轉化結束后液相色譜測定丹參素產量及構型。表3各種重組菌的比較實施例3根據實例2的方法將escherichiacolihm中nada、ribf基因前增加大腸桿菌的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gpda)前的中等表達強度組成型啟動子(pg)，序列如seqidno:8所示。然后再將質粒導入。強化基因nada表達時，以escherichiacolihm基因組為模板，以引物nada-ff/nada-fr、nada-gpda-f/nada-gpda-r、nada-rf/nada-rr,擴增出上游、啟動子、下游序列，并以nada-ff和nada-rr為引物融合為含有gpda啟動子的表達框。然后與質粒pcasred、pcrispr-gdna(含nadasgrna)一起轉入escherichiacolihm后，cas9/sgrna誘發宿主在nada基因位點發生雙鏈斷裂，重組酶red將gpda啟動子整合到nada基因之前，并測序驗證。強化基因ribf表達時，以escherichiacolihm基因組為模板，以引物ribf-ff/ribf-fr、ribf-gpda-f/ribf-gpda-r、ribf-rf/ribf-rr,擴增出上游、啟動子、下游序列，并以ribf-ff和ribf-rr為引物融合為含有gpda啟動子的表達框。然后與質粒pcasred、pcrispr-gdna(含ribfsgrna)一起轉入escherichiacolihm后，cas9/sgrna誘發宿主在ribf基因位點發生雙鏈斷裂，重組酶red將gpda啟動子整合到ribf基因之前，并測序驗證。下表為引物名稱與序列表序號的對應索引。表6引物名稱與序列表序號對照名稱序列表中編號ribfsgrnaseqidno:13nadasgrnaseqidno:1ribf-ffseqidno:14ribf-frseqidno:15ribf-gpda-fseqidno:16ribf-gpda-rseqidno:17ribf-rfseqidno:18ribf-rrseqidno:19nada-ffseqidno:2nada-frseqidno:3nada-gpda-fseqidno:4nada-gpda-rseqidno:5nada-rfseqidno:6nada-rrseqidno:7基因改造完成后，將共表達質粒導入。根據實施例2所述的方法誘導表達，收集各類細胞進行轉化分析，結果如表7所示。轉化體系中全細胞轉化體系為：細胞濕重為20g/l，葡萄糖100g/l，左旋多巴120g/l，ph9.0，溫度為30℃，搖床轉速250轉/分鐘；轉化時間24小時。表7轉化結果比較將最好的escherichiacolihm(pg-nada,pg-ribf)命名為escherichiacolinr。實施例4根據實施例2所述誘導表達方法，將escherichiacolinr/pcoladuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao誘導表達完成后收集菌體，于100ml反應體系中，細胞濕重1g/l，葡萄糖1g/l，左旋多巴1g/l，ph6.0，溫度為15℃，搖床轉速250轉/分鐘；轉化時間1小時。測定結果，s-丹參素濃度為93mg/l，e.e％>99.9。實施例5根據實施例2所述誘導表達方法，將表8中菌株誘導表達完成后收集菌體，于100ml反應體系中，細胞濕重200g/l，葡萄糖200g/l，左旋多巴200g/l，ph8.5，溫度為40℃，搖床轉速250轉/分鐘；轉化時間48小時。將沉淀全部稀釋溶解后測定結果。表8轉化結果比較以上所述的酶及其共表達基因工程菌的改造和構建、菌體的培養基組成及培養方法和全細胞生物轉化僅為本發明的較佳實施例而已，并不用于限制本發明，理論上來講其它的細菌、絲狀真菌、放線菌、動物細胞均可進行基因組的改造，并用于多基因共表達的全細胞催化。凡在本發明的原則和精神之內所作的任何修改、等同替換。序列表<110>江南大學<120>一種丹參素的生產方法及工程菌<130>2018.3.15<160>19<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ttaacggcgtcggcttcggg20<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2tcgaatcctgcacgacccaccacta25<210>3<211>50<212>dna<213>人工序列<400>3tcggccactcatcaacatgattcatcgacattagcgtaatattcgctgtt50<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列<400>4aacagcgaatattacgctaatgtcgatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>5<211>50<212>dna<213>人工序列<400>5tgtctggatcaaacattacgctcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>6<211>50<212>dna<213>人工序列<400>6cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgagcgtaatgtttgatccagaca50<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7catccacggacaatgcgcgcagctg25<210>8<211>1100<212>dna<213>escherichiacolibl21(de3)<400>8atgaatcatgttgatgagtggccgatcgctacgtgggaagaaaccacgaaactccattgc60gcaatacgctgcgataaccagtaaaaagaccagccagtgaatgctgatttgtaaccttga120atatttattttccataacatttcctgctttaacataattttccgttaacataacgggctt180ttctcaaaatttcattaaatattgttcacccgttttcaggtaatgactccaacttattga240tagtgttttatgttcagataatgcccgatgactttgtcatgcagctccaccgattttgag300aacgacagcgacttccgtcccagccgtgccaggtgctgcctcagattcaggttatgccgc360tcaattcgctgcgtatatcgcttgctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattca420tacagcggccagccatccgtcatccatatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcata480agacgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgtcttccgg540agcctgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttagccccgacatagccccac600tgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtcactgcccggctgtatgcgcgaggttacc660gactgcggcctgagttttttaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgc720gggcagttgcccggcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtac780cgggttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggcagtgagagcaga840gatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaac900aggagggacagctgatagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacac960taaatcagtaagttggcagcatcaccccgttttcagtacgttacgtttcactgtgagaat1020ggagattgcccatcccgccatcctggtctaagcctggaaaggatcaattttcatccgaac1080gttcctgacaggagaaaacc1100<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tatgcccgtcgatcgcgccc20<210>10<211>120<212>dna<213>人工序列<400>10ccaagatcacgcacgtaccgtcgatgtatctctctgaactgccagggaaaaaccacggtt60agatcagcaagcgttgccgggaaatgggcgtcgataccattatcgttttcgacacccact120<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tcatcgagtacctcttgcgc20<210>12<211>120<212>dna<213>人工序列<400>12tagcctgatatgcacgcttatcttcactgtctttcccactcgccgctggtgggatatgtc60aatggcgtgattgccagcgcccgcgagcgtattgcggctttctcccctgaactggtggtg120<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13cagcacacacccttcttgcg20<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14aaggtctaatgaggagatatttatg25<210>15<211>50<212>dna<213>人工序列<400>15tcggccactcatcaacatgattcatcataaatatctcctcattagacctt50<210>16<211>50<212>dna<213>人工序列<400>16aaggtctaatgaggagatatttatgatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>17<211>50<212>dna<213>人工序列<400>17tatgtatgccgcgtatcagcttcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>18<211>50<212>dna<213>人工序列<400>18cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgaagctgatacgcggcatacata50<210>19<211>25<212>dna<213>人工序列<400>19ttcatcacgcgcaatctgcgctttc25當前第1頁12