心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測方法和試劑盒與流程

本發明涉及一種心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測方法和試劑盒，屬于分子生物學
技術領域：
。
背景技術：
：藥物體內代謝、轉運的遺傳變異及其表達水平的變化會影響藥物的體內濃度和敏感性，導致藥物反應性個體差異。近年來隨著基因檢測技術的不斷發展，藥物基因組檢測越來越精準，也越來也方便。藥物基因組學已成為指導臨床個體化用藥、評估嚴重藥物不良反應發生風險、指導新藥研發和評價的重要工具。目前，藥物反應相關基因及其表達產物的分子檢測是實施個體化藥物治療的前提。個體化降壓藥用藥說明：1)利尿劑類：氫氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米、布美他尼根據遺傳藥理學和基因組藥理學數據庫(pharmgkb-thepharmacogenetics&pharmacogenomicsknowledgebase)指導建議，add1基因與利尿劑類藥物的療效相關(等級：2b)。add1是一種α/β異源二聚體骨骼肌膜蛋白，可影響細胞內鈉-鉀泵功能。該基因發生突變能夠增強na+-k+-atp酶的活性，增加腎小管對鈉的重吸收而升高血壓，從而影響利尿劑的作用。2)鈣離子拮抗劑：維拉帕米、硝苯地平根據遺傳藥理學和基因組藥理學數據庫(pharmgkb-thepharmacogenetics&pharmacogenomicsknowledgebase)指導建議，cacna1c基因與鈣離子拮抗劑的療效相關(等級：3)。l型鈣離子通道α1亞基的α1c亞型是二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑調節心血管功能和降低血壓的主要作用靶點，其基因cacna1csnps可能與鈣離子通道阻滯劑降壓療效存在一定關系。根據遺傳藥理學和基因組藥理學數據庫(pharmgkb-thepharmacogenetics&pharmacogenomicsknowledgebase)指導建議，cacna1c基因與硝苯地平的療效相關(等級：3)。cyp3a5參與多種藥物的代謝。cyp3a5基因第3內含子內22893位存在6986a>g的突變(rs776746，cyp3a5*3)，該snp可導致cyp3a5mrna異常剪接，引起終止密碼子過早剪切cyp3a5蛋白，從而使其失去酶的活性，因此cyp3a5*3純合子個體肝臟和腸道cyp3a5蛋白表達和活性顯著下降。cyp3a5*1等位基因頻率存在顯著種族差異，白種人群中為10％--15％，中國人群中為28％，而黑種人群則高達60％--80％。該基因突變導致藥物代謝速率減慢，血藥濃度升高，毒副反應增強，建議酌情減少藥物劑量。3)β受體阻滯劑：阿替洛爾、美托洛爾、卡維地洛根據遺傳藥理學和基因組藥理學數據庫(pharmgkb-thepharmacogenetics&pharmacogenomicsknowledgebase)指導建議，cacna1c基因與阿替洛爾的療效相關(等級：3)。該基因突變使得個體對藥物敏感性增加，藥物療效增強。根據《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中指導建議，β腎上腺素受體(β-adrenergicreceptor)為腎上腺素受體的一個亞家族，屬于g蛋白偶聯受體超家族，包含β1、β2和β3三種不同亞型。該類受體通過與gs蛋白偶聯調節細胞內camp和l型ca2+通道的開放頻率，是β受體激動劑和β受體阻滯劑的作用靶點。β1受體編碼基因adrb1多態性可影響β受體阻斷劑如美托洛爾的療效。adrb1gly389arg(rs1801253)多態性導致位點arg389和gly389兩種類型的受體，其中arg389型受體與g蛋白偶聯效率高于gly389型受體。arg389純合子高血壓患者應用美托洛爾后血壓下降的程度是gly389arg雜合子基因型個體的3倍；arg389純合子基因型心衰患者應用卡維地洛和美托洛爾治療后左室射血分數改善情況更佳。建議臨床醫師在應用β1受體阻滯藥前進行adrb1多態性檢測，并根據其基因型調整用藥劑量，以提高療效，減少不良反應的發生。根據《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中指導建議，cyp2d6又稱異喹胍4’-羥化酶,cyp第二亞家族中的重要成員。人群中cyp2d6的活性呈現強代謝者(em)、中間代謝者(im)、弱代謝者(pm)和超強代謝者(um)四態分布的現象。白種人群中cyp2d6pm的發生率高達5～10％，而在東方人群中pm的發生率約為1％。導致cyp2d6酶活性缺失的多態性可影響安替比林、可待因、β受體阻滯劑如美托洛爾和卡維地洛、氯丙咪嗪、去甲替林、地昔帕明、多慮平、丙咪嗪、馬普替林、奧匹哌醇、三甲丙咪嗪、昂丹司瓊、曲馬多和他莫昔芬等的體內代謝，從而影響這些藥物的療效和不良反應的發生，臨床需根據個體的基因型進行劑量的調整。4)血管緊張素ⅱ受體拮抗劑：洛沙坦、纈沙坦、奧美沙坦根據《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中指導建議，cyp2c9是細胞色素p450酶(cyp)第二亞家族中的重要成員，占肝微粒體p450蛋白總量的20％。cyp2c9參與抗凝血藥、抗驚厥藥、降糖藥、非甾體類解熱鎮痛抗炎藥、抗高血壓藥以及利尿藥等多種藥物的羥化代謝。cyp2c9活性變化可導致這些藥物體內濃度出現較大變化，甚至導致嚴重藥物不良反應的發生。洛沙坦是一種常用的抗高血壓藥物，在體內主要經cyp2c9代謝活化為具有降壓作用的代謝產物e-3174。攜帶cyp2c9*3等位基因的個體服用洛沙坦后e-3174的生成減少，洛沙坦的代謝率降低。口服單劑量洛沙坦后1h～6h后，cyp2c9*1/*3基因型個體中洛沙坦的降壓作用下降，需適當增加用藥劑量以增強降壓療效。根據《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中指導建議，有機陰離子轉運多肽1b1(oatp1b1，又稱oatp-c、oatp2或lst1)特異地表達在肝細胞基底膜上，在肝細胞攝取和清除內源性和外源性物質如他汀類藥物、瑞格列奈、依那普利拉、替莫普利、纈沙坦、奧美沙坦等中發揮重要作用。oatp1b1由slco1b1基因編碼，該基因第5外顯子521t>c(val174ala)多態性是亞洲人群中的主要遺傳變異，等位基因頻率為10～15％，該多態性顯著降低oatp1b1對其底物的攝取能力，使血藥濃度升高。5)血管緊張素轉換酶抑制劑：福辛普利、依那普利、賴諾普利、卡托普利、替莫普利根據衛計委發布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中指導建議，acei/d多態性可影響血漿ace的水平，dd基因型個體血漿ace的活性升高，依那普利治療后ace活性下降更明顯；在初治的高血壓患者中，dd型患者福辛普利的降壓療效增強；在高血壓合并左心室肥大和舒張期充盈障礙的患者中，dd基因型患者服用依那普利和賴諾普利后心功能改善程度優于id和ii基因型患者；ii基因型患者應用賴諾普利或卡托普利時腎功能下降更明顯。為取得最佳療效，建議臨床上在選擇acei類藥物進行治療前對acei/d多態性進行檢測，以指導選擇合適的acei類藥物。但目前的分子檢測方法主要以限制性片段長度多態性分析、pcr測序、基因芯片為主，普遍存在低通量、低分辨率、高背景信號、高成本等缺陷。massarray分子量陣列技術是世界上領先的基因突變分析技術。massarray結合了簡單、可靠的引物延伸反應和先進的maldi-tof質譜技術，可以快速經濟地進行基因型分析，達到目前市場上最高的準確率和性價比。基于massarray分子量陣列平臺的iplexgold技術可以便捷的設計多達40種的基因型檢測。實驗設計靈活，價格低廉。技術實現要素：針對上述現有技術存在的問題，本發明的第一目的是提供一種心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測方法。本發明的第二目的是提供一種心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測試劑盒。為了實現上述目的，本發明采用的一種心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測方法，所述心腦血管用藥相關基因多態性位點包括add1-rs4961、cyp2c9*3-rs1057910、cacna1c-rs1051375、cyp2d6*10-rs1065852、slco1b1-rs4149056、cyp3a5-rs776746、adrb1-rs1801253中的至少一種；優選的，所述心腦血管用藥相關基因多態性位點由add1-rs4961、cyp2c9*3-rs1057910、cacna1c-rs1051375、cyp2d6*10-rs1065852、slco1b1-rs4149056、cyp3a5-rs776746、adrb1-rs1801253組成；所述檢測方法包括以下步驟：1)pcr擴增引物的制備：pcr擴增引物為根據所選擇的待檢測的個體化用藥相關基因設計的特異性針對每種基因的擴增引物，所述擴增引物可擴增包括突變位點在內的一段dna序列，所述擴增引物(包括正向引物和反向引物)在3'端具有與其所針對的基因序列完全匹配的17-25個堿基，在5'端具有標簽序列，優選在5'端具有相同的標簽序列，更優選，所述標簽序列為acgttggatg，以區分擴增引物與延伸引物；其中，擴增引物包括seqidno:1～seqidno:14序列中的至少一對，優選的，擴增引物由seqidno:1～seqidno:14序列組成；2)質譜延伸引物的制備：所述質譜延伸引物的長度為15-28個堿基并且其3'端位于個體化用藥相關基因突變位點在延伸方向上的上一個堿基，延伸引物在發生延伸反應時，只延伸一個堿基，延伸的堿基即為個體化用藥相關基因突變位點；其中，延伸產物和延伸引物之間的分子量差異不小于9da；按照引物間，引物與擴增產物/延伸產物間不形成二聚體，引物自身不形成發夾結構，以及引物與模板間不發生錯配的原則設計引物，特別地，用于質譜檢測的延伸引物按照下列原則設計：各延伸產物的分子量相互間的差別不小于30da，各延伸引物與各延伸產物之間的分子量差異不小于9da，延伸引物與延伸產物的分子量在4500-8500da之間；其中，延伸引物包括seqidno:15～seqidno:21序列中的至少一對，優選的，延伸引物由seqidno:15～seqidno:21組成；3)檢測模板的制備：采用適當的商業化試劑盒提取待測樣本dna，臨床樣本采用tiangen基因組dna提取試劑盒；4)以步驟3)中提取的dna為模板，使用步驟1)中所述pcr擴增引物進行pcr擴增，獲得靶序列擴增產物；5)通過sap酶處理，除去步驟4)獲得的擴增產物中含有的未反應的dntp；6)以步驟5)中獲得的擴增產物為模板，使用步驟2)中的所述質譜延伸引物通過延伸反應，在延伸引物的3'端連接一個堿基，從而得到延伸產物；7)純化步驟6)中獲得的延伸產物；8)將純化后的產物在質譜儀上進行質譜檢測，所得到的質譜峰圖通過分析軟件進行分析，得到分型結果。另外，本發明還提供了一種心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測試劑盒，所述試劑盒包括pcr擴增引物、質譜延伸引物；所述pcr擴增引物為根據所選擇的待檢測的個體化用藥相關基因設計的特異性針對每種基因的擴增引物，所述擴增引物可擴增包括突變位點在內的一段dna序列，所述擴增引物(包括正向引物和反向引物)在3'端具有與其所針對的基因序列完全匹配的17-25個堿基，在5'端具有標簽序列，優選在5'端具有相同的標簽序列，更優選所述標簽序列為acgttggatg，以區分擴增引物與延伸引物；其中，擴增引物包括seqidno:1～seqidno:14序列中的至少一對，優選的，擴增引物由seqidno:1～seqidno:14序列組成；所述質譜延伸引物的長度為15-28個堿基并且其3'端位于個體化用藥相關基因突變位點的在延伸方向上的上一個堿基，延伸引物在發生延伸反應時，只延伸一個堿基，延伸的堿基即為個體化用藥相關基因突變位點；所述延伸引物包括seqidno:15～seqidno:21序列中的至少一對，優選的，延伸引物由seqidno:15～seqidno:21組成。與現有技術相比，本發明的有益效果是：1)本發明中使用的試劑耗材，相對簡單且性能穩定，不需要熒光染料、特殊的酶等價格昂貴的試劑。2)反應可以在微量體系中進行，減少了樣品和各種消耗品的使用。3)由于質譜技術直接檢測dna的分子量(質荷比)且直接確定堿基的類型(即不需要經過任何形式的信號轉換)，因此，理論上只要有一個拷貝的擴增dna片段被擴增即可識別，從而具有高的靈敏度；質譜技術還有自動化、高通量檢測等特點，因此，質譜技術與多引物延伸技術相結合，可以在一個反應體系中同時檢測多個用藥相關位點，從而大大減少了工作量，提高了檢測通量。4)本發明采用飛行時間質譜基因分型系統，通過設計一套全新的質譜延伸引物，實現了對上述藥物的個體化用藥相關基因的檢測和分型，與其它方法相比，能夠同時準確檢測出心腦血管用藥相關基因多態性位點相關性，具有高通量、自動化、低成本等顯著優點。附圖說明圖1為本發明以樣本提取的dna為模板，對add1-rs4961進行檢測的質譜峰圖，其分析結果為純合g，顯示對利尿劑類藥物療效正常。圖2為本發明以樣本提取的dna為模板，對add1-rs4961進行檢測的質譜峰圖，其分析結果為純合gt，顯示對利尿劑類藥物療效增強。圖3為本發明以樣本提取的dna為模板，對add1-rs4961進行檢測的質譜峰圖，其分析結果為純合g，顯示對利尿劑類藥物療效增強。具體實施方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明了，下面對本發明進行進一步詳細說明。但是應該理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限制本發明的范圍。首先，本發明的心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測試劑盒，包括：1)pcr反應液mix：包括1×pcr反應緩沖液(購自agenabioscience公司)、上述pcr擴增引物(由上海生工生物合成)；2)pcr反應taq酶(購自agenabioscience公司)；3)sap反應緩沖液(購自agenabioscience公司)；4)sap酶(購自agenabioscience公司)；5)extension反應液mix：包括反應緩沖液(購自agenabioscience公司)、上述質譜延伸引物(由上海生工生物合成)；6)extension反應taq酶(購自agenabioscience公司)；7)massarray芯片(購自agenabioscience公司)。另外，下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。引物序列由上海生工生物合成，pcr擴增試劑、sap酶、extension反應液、massarray芯片均購自agenabioscience公司，pcr擴增儀為ab公司9700型號，質譜分析儀為agenabioscience公司massarraycompactanalyzer。實施例1一種心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測方法，包括以下步驟：1)pcr擴增引物的制備：根據所選擇的待檢測的藥物代謝酶和作用靶點藥物的個體化用藥相關基因，設計出特異性針對每種個體化用藥相關基因的擴增引物，擴增引物可擴增包括突變位點在內的一段dna序列，所述擴增引物在3'端具有與其所針對的基因序列完全匹配的至少15個堿基，在5'端具有10個堿基(acgttggatg)的標簽序列，以區分擴增引物與延伸引物；2)質譜延伸引物的制備：設計延伸引物，所述延伸引物的長度為15-28個堿基，并且其3'端位于用藥相關突變位點的在延伸方向上的上一個堿基，延伸引物在發生延伸反應時，只延伸一個堿基，延伸的堿基即為用藥相關突變位點，其中，延伸引物的野生型延伸產物與突變型延伸產物之間的分子量差異不小于9da(da＝道爾頓)，且各個用藥相關突變位點的延伸產物間的分子量差異不小于30da，按照引物之間、引物與擴增產物/延伸產物間不形成二聚體、引物自身不形成發夾結構以及引物與模板間不發生錯配的原則設計引物；特別地，用于質譜檢測的延伸引物按照下列原則設計：各延伸產物的分子量相互間的差別不小于30da，各延伸引物與各延伸產物之間的分子量差異不小于9da，延伸引物與延伸產物的分子量在4300-8500da之間。本發明設計的針對所述的個體化用藥相關基因突變位點信息如表1所示，擴增引物參見表2，延伸引物參見表3。表1降壓用藥相關基因突變信息表2針對所述pcr擴增的pcr擴增引物序列表3針對所述延伸反應的質譜延伸引物seqidno:延伸引物名稱引物序列5'→3'延伸堿基15add1-ueptgcttccattctgccg16cyp2c9*3-uepggaacgaggtccagagatacc17cacna1c-uepgtggccctccacagtgctgacg18cyp2d6*10-uepgcgccaacgctgggctgcacgctacg19slco1b1-uepattcaacgaagcatattacccatgaact20cyp3a5-uepccaaacagggaagagatac21adrb1-uepggaaggcgcgcgcagcagagcagtcg3)檢測模板的制備：突變樣本為醫院受檢2名腫瘤患者的腫瘤組織(編號為2-a和2-b)和正常人組織樣本4份(編號為3-a、4-a、5-a、6-a等)提取dna(采用tiangendna試劑盒提取，操作方法按照試劑盒說明書提取)；4)以步驟3)中提取的dna為模板，使用步驟1)中所述pcr擴增引物進行pcr擴增，獲得靶序列擴增產物；pcr擴增反應體系參見表4；其中，所有試劑購買自agenabioscience公司。表4pcr擴增反應體系pcr反應條件為94℃，2分鐘；94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共擴增45循環；最終72℃延伸5分鐘。在本實施例中，使用步驟3)中提取的dna作為pcr擴增的dna模板。同時，將無菌雙蒸水作為陰性對照。將對照樣本與待測樣本按照相同的反應過程進行反應和測試，以驗證檢測的有效性。5)通過sap酶處理，除去步驟4)獲得的擴增產物中含有的未反應的dntp。sap酶反應體系見表5。所有試劑購買自agenabioscience公司。表5sap酶反應體系試劑體積/反應水(hple級)1.53μlsap酶緩沖液0.17μlsap酶0.30μl步驟4)中獲得pcr擴增產物5.0μl總體積7.0μlsap酶反應條件為37℃溫育40分鐘，以去除pcr擴增反應中剩余的dntp；85℃溫育5分鐘，以使sap酶失活。6)以步驟5)中獲得的擴增產物為模板，使用步驟2)中的質譜延伸引物通過延伸反應，在延伸引物的3’端連接一個堿基，從而得到延伸產物。延伸反應體系見表6。所有試劑購買自agenabioscience公司。表6延伸反應體系試劑體積/反應水(hple級)0.619μliplex緩沖液0.200μliplexddntp混合物0.200μl表3中的延伸引物混合物*0.940μliplex酶0.041μl步驟(5)中獲得的產物7.00μl總體積9.00μl*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小進行線性關系調整(即根據每種延伸引物的分子量計算每種引物的使用量)。延伸反應條件為94℃，30秒；94℃變性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共擴增40個循環，且在每個循環中退火和延伸進行5個小循環；最終72℃延伸3分鐘。7)采用樹脂(購買自agenabioscience公司)純化步驟6)中獲得的延伸產物。在延伸產物中加入6mg樹脂，16.00μl水，垂直搖勻一小時。經過本步反應后，樹脂將與反應體系中的陽離子充分結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成后的純化產物可在4℃保存數天，也可在-20℃保存數周。所得的純化產物在4000rpm離心5分鐘后，取上清直接用于質譜檢測。8)將純化后的產物在agenabiosciencemaldi-tof質譜儀上進行質譜檢測。所得到的質譜峰圖通過typer4.0分析軟件(由agenabioscience公司提供)進行分析，得到分型結果。檢測結果：質譜峰圖分析結果如圖1-圖3所示。圖1為本發明以樣本提取的dna為模板，對add1-rs4961進行檢測的質譜峰圖，其分析結果為純合g，顯示對利尿劑類藥物療效正常。圖2為本發明以樣本提取的dna為模板，對add1-rs4961進行檢測的質譜峰圖，其分析結果為純合gt，顯示對利尿劑類藥物療效增強。圖3為本發明以樣本提取的dna為模板，對add1-rs4961進行檢測的質譜峰圖，其分析結果為純合g，顯示對利尿劑類藥物療效增強。采用本發明的檢測方法和檢測試劑盒，與一代測序相比，不到一天的快速周轉時間；試劑耗材簡單，流程化運行實驗，不需要熒光染料或者探針類的昂貴試劑；由于質譜技術直接檢測dna的分子量(質荷比)，理論上只要有一個拷貝的擴增dna片段被擴增即可識別，從而具有高的靈敏度，相比rt-pcr偏差更小；反應可以在微量體系中進行，單個反應孔中實現高度多重性的能力，最高能達到40重的檢測能力，提高檢測效率。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換或改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。序列表<110>闊然醫學檢驗實驗室(徐州)有限公司<120>心腦血管用藥相關基因多態性位點的檢測方法和試劑盒<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>29<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>1acgttggatgtgaactctggccggggcga29<210>2<211>29<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>2acgttggatggtgatcgtgtgtaatgttc29<210>3<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>3acgttggatgtgtcacaggtcactgcatgg30<210>4<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>4acgttggatgctacacagatgctgtggtgc30<210>5<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>5acgttggatgtcaacaacgccaacaacacc30<210>6<211>29<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>6acgttggatggcccgtggccctccacagt29<210>7<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>7acgttggatgagtccacatgcagcaggttg30<210>8<211>29<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>8acgttggatgtggtggacctgatgcaccg29<210>9<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>9acgttggatgaatctgggtcatacatgtgg30<210>10<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>10acgttggatgccaatggtactatgggagtc30<210>11<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>11acgttggatgacccagcttaacgaatgctc30<210>12<211>30<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>12acgttggatggtaatgtggtccaaacaggg30<210>13<211>29<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>13acgttggatgatcatctactgccgcagcc29<210>14<211>29<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>14acgttggatgggtctccgtgggtcgcgtg29<210>15<211>15<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>15tgcttccattctgcc15<210>16<211>20<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>16ggaacgaggtccagagatac20<210>17<211>21<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>17gtggccctccacagtgctgac21<210>18<211>25<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>18gcgccaacgctgggctgcacgctac25<210>19<211>27<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>19attcaacgaagcatattacccatgaac27<210>20<211>18<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>20ccaaacagggaagagata18<210>21<211>25<212>dna<213>人類基因組(humangenomic)<400>21ggaaggcgcgcgcagcagagcagtc25當前第1頁12