本發明公開了一種生產米爾貝霉素的重組菌及其構建方法與應用，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
米爾貝霉素是一種十六元大環內脂類抗生素，米爾貝霉素a3/a4因對環境非常友好，已作為生態友好型農藥被商業化應用于多種農作物、經濟作物及花卉的害蟲防治。盡管米爾貝霉素與阿維菌素相比具有更高活性和更低毒性，但其昂貴價格限制了米爾貝霉素的廣泛應用。
冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)是本實驗室具有獨立知識產權，能夠生物合成商業化應用的米爾貝霉素a3/a4的工業化鏈霉菌。冰城鏈霉菌能夠產生多種次級代謝產物，雖然米爾貝霉素a3(α1)和a4(α3)是冰城鏈霉菌中最重要的次級代謝產物，但是米爾貝霉素其他衍生物、大環內酯類和聚醚類化合物南昌霉素以及環五肽等其他次級代謝產物常伴隨產生。其中副產物以米爾貝霉素衍生物為主，因該類化合物與米爾貝霉素a3/a4化學結構和性質相似，故該類副產物不僅造成目標化合物米爾貝霉素a3+a4的效價降低，而且為其分離帶來了困難。
技術實現要素：
為了提高米爾貝霉素a3/a4的提取純度，本發明提供了一種生產米爾貝霉素的重組菌，所述重組菌是通過將出發菌株中cyp41基因敲除使其失活后獲得的，所述出發菌株為冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7，菌種保藏編號為cgmcc1734；所述cyp41基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
優選地，所述cyp41基因中被敲除的序列如seqidno.2所示。
本發明還提供了上述重組菌的構建方法，步驟如下：
1)cyp41基因敲除載體構建：
用冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7全基因組序列為模板設計引物，經pcr擴增獲得cyp41基因上游序列cyp41up和下游序列cyp41down；經pcr擴增得到卡那抗性基因片段cyp41neo；將cyp41up、cyp41down和cyp41neo進行融合pcr得到片段cyp41-up-neo-down，將所述cyp41-up-neo-down片段插入到載體pkc1139中，獲得敲除cyp41基因的質粒pkccyp41neo；
2)cyp41基因敲除重組冰城鏈霉菌的獲得：
將所述質粒pkccyp41neo導入到大腸桿菌et12567(puz8002)中，然后通過接合轉移法導入到所述冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7中，獲得重組菌bcdp。
進一步地限定，步驟1)中所述的上游序列cyp41up擴增所用的引物為：cyp41up-f：cccaagcttcaggatgaggaacgacagga；cyp41up-r：caggggatcccagcaacctcccctccac。
進一步地限定，步驟1)中所述的下游序列cyp41down擴增所用的引物為：cyp41down-f：ttcactggcctttcacgccgcacgctt；cyp41down-r：gctctagaattccgcaggagaacagatga。
進一步地限定，步驟1)中所述的cyp41neo擴增以puc119質粒為模板；所用的引物為：cyp41neo-f：gaggttgctgggatcccctggatacc；cyp41neo-r：cggcgtgaaaggccagtgaattcgag。
本發明還提供了上述重組菌在發酵生產米爾貝霉素中的應用。
進一步地限定，所述發酵生產米爾貝霉素的方法為：將重組菌株在skym固體培養基上培養后，接種到種子培養基培養，再接種到發酵培養基進行培養。
進一步地限定，每100ml種子培養基中含有蔗糖1.0g，脫脂奶粉0.1g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.35g，k2hpo40.05g，余量為水，ph＝7.2；培養條件為28℃，250rpm培養46h。
進一步地限定，每100ml發酵培養基中含有蔗糖8.0g，脫脂奶粉0.1g，黃豆餅粉2.0g，feso40.01g，k2hpo40.1g，caco30.3g，余量為水，ph＝7.2；培養條件為28℃，250rpm培養9天。
有益效果
對冰城鏈霉菌及已報道冰城鏈霉菌突變株代謝產物分析發現，副產物米爾貝霉素α9/α10與米爾貝霉素a3/a4始終伴隨產生，要想理性消除冰城鏈霉菌中米爾貝霉素α9/α10對米爾貝霉素a3/a4的影響，明確其生物合成過程至關重要，本發明通過敲除冰城鏈霉菌中cyp41基因，構建了基因敲除的鏈霉菌重組菌，解析了冰城鏈霉菌中米爾貝霉素a3/a4到米爾貝霉素α9/α10形成過程，明確了冰城鏈霉菌中本發明所述基因編碼的蛋白質cyp41的功能。本發明的重組菌生產米爾貝霉素時米爾貝霉素α9/α10組分減少或失活，不僅簡化了米爾貝霉素a3/a4的純化過程，同時米爾貝霉素a3+a4效價提高，降低米爾貝霉素生產成本。
本發明實施例中例舉的技術方案為敲除cyp41基因大部分序列致該基因功能失活，并進一步構建cyp41基因失活的重組菌，并獲得了上述有益的技術效果，本領域的技術人員能夠理解，敲除cyp41基因的完整編碼區(seqidno.1)也同樣能夠實現本發明所述的技術效果。
附圖說明
圖1：米爾貝霉素α9/α10質譜檢測圖；圖中分別可見α9質譜檢測圖和α10質譜檢測圖；
圖2：用于構建基因敲除重組菌株的載體pkccyp41neo簡圖；
圖3：菌株發酵產物的hplc檢測圖譜；(a)：重組冰城鏈霉菌hplc檢測圖；(b)：bcwt和bcdp的米爾貝霉素a3+a4效價比較。
具體實施方式
本發明利用冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7(cgmcc1734)基因組構建質粒文庫。利用融合pcr及加載抗性基因構建cyp41基因的敲除載體，通過接合轉移導入菌株x-7中，通過同源重組原理敲除cyp41基因，阻斷副產物米爾貝霉素α9/α10的合成。
本發明還利用冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7(cgmcc1734)基因組構建質粒。利用gibson組裝及不同啟動子構建cyp41基因的回補載體，通過接合轉移導入重組菌株bcdp中，恢復副產物米爾貝霉素α9/α10的合成。
本發明利用天藍鏈霉菌m1146作為體外寄主，通過接合轉移將本發明中構建的pij10500::phrdbcyp41質粒導入m1146中得到重組天藍鏈霉菌m1146-cyp41，通過在液體培養重組菌株時添加米爾貝霉素a3/a4，hplc檢測其發酵液中化合物組分的變化，確定冰城鏈霉菌中本發明所述基因編碼的蛋白cyp41的功能，并解析冰城鏈霉菌中米爾貝霉素α9/α10的合成過程。所述天藍鏈霉菌m1146，記載在gomez-escribanojp,bibbmj.engineeringstreptomycescoelicolorforheterologousexpressionofsecondarymetabolitegeneclusters.microbbiotechnol.2011；4(2):207-215.doi:10.1111/j.1751-7915.2010.00219.x。
所述冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7，于2006年06月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市海淀區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號為cgmcc1734。
pij10500，該載體記載在：zhangetal.microbcellfact(2016)15:152doi10.1186/s12934-016-0552-1。
streptomycescoelicolora3(2)記載在：zhangetal.microbcellfact(2016)15:152doi10.1186/s12934-016-0552-1，此菌用于后面hrdbp啟動子的擴增。
上述材料公眾可通過中國農業科學院植物保護研究所獲得。
在本發明中，所述野生型冰城鏈霉菌是指天然環境中存在的、并未進行任何人工操作的冰城鏈霉菌，即本發明中所用的出發菌株冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7。
在本發明中，產生所述重組鏈霉菌的起始鏈霉菌是指對其進行本發明所示遺傳操作例如基因敲除的鏈霉菌。也可以是具有其它遺傳修飾但是不具有本發明所述遺傳修飾的鏈霉菌如回補株和重組的1146鏈霉菌。本文所用“重組”是指由于有意人為干預所獲得的具有所需修飾的菌株，例如與相應天然(非重組)菌株相比，重組菌株不表達或者恢復表達天然基因活性。
在本發明中，術語“刪除”或“敲除”是指與野生型菌株相比，重組菌株經本發明所示遺傳操作刪除掉部分或全部目標基因基因編碼區序列，使重組菌株不能產生具有相應活性的蛋白質、或者產生的蛋白質的量或其活性與未進行所述失活操作的基因翻譯的蛋白質的量或活性相比是降低的或者被消除。敲除可以通過例如靶向載體、穿梭載體同源重組或隨機插入基因捕獲載體等方法使目標基因功能完全或部分喪失。
在本發明中，“回補”是指在敲除目標基因的菌株中，通過整合型載體將刪除掉目標基因基因編碼區序列全部克隆到敲除重組菌株中，使重組菌株能產生具有相應活性的蛋白質、或者產生的蛋白質的量或其活性與進行所述失活操作的基因翻譯的蛋白質的量或活性相比是上升的或者提高的。
skym固體培養基(每100ml)：蔗糖0.4g，脫脂奶粉0.1g，酵母浸粉0.2g，麥芽浸粉0.5g，蒸餾水100ml，瓊脂粉2.0g，ph＝7.2。
種子培養基(每100ml)：蔗糖1.0g，脫脂奶粉0.1g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.35g，k2hpo40.05g，蒸餾水100ml，ph＝7.2。
發酵培養基(每100ml)：蔗糖8.0g，脫脂奶粉0.1g，黃豆餅粉2.0g，feso40.01g，k2hpo40.1g，caco30.3g，蒸餾水100ml，ph＝7.2。
本領域技術人員可以借鑒本文內容，本發明的方法及應用已經通過實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動和調整來實現和應用本發明。
本發明采用的試劑皆為普通市售品，皆可于市場購得。
下面結合實施例，進一步闡述本發明，為方便描述，下述實施例中所述的bcwt也代表冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7。
實施例1：生產米爾貝霉素的重組菌的構建方法。
一、cyp41基因刪除載體構建：
用米爾貝霉素生產菌冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsis)x-7(菌種保藏編號為cgmcc1734)全基因組序列為模板設計引物：
cyp41up-f/r(cccaagcttcaggatgaggaacgacagga(hindiii)/caggggatcccagcaacctcccctccac)；
cyp41down-f/r(ttcactggcctttcacgccgcacgctt/gctctagaattccgcaggagaacagatga(xbai))，用kod高保真酶體系pcr得到1.4kbcyp41上游序列cyp41up和1.6kbcyp41下游序列cyp41down，利用kod高保真酶體系、puc119質粒為模板、cyp41neo-f/r(gaggttgctgggatcccctggatacc/cggcgtgaaaggccagtgaattcgag)為引物pcr得到neo(卡那抗性基因)片段。
利用q5高保真酶對cyp41up、cyp41down、cyp41neo進行融合pcr得到片段cyp41-up-neo-down，將載體pkc1139用hindiii、xbai進行雙酶切后與cyp41-up-neo-down用t4連接酶反應，反應結束后轉化，挑取單克隆培養并用質粒試劑盒提取質粒，電泳檢測后測序驗證，得到敲除cyp41基因的質粒pkccyp41neo，載體圖如圖2所示。
融合pcr第1步：(體系)cyp41up、cyp41down、cyp41neo片段各30ng，4μl5×q5reactionbuffer，4μl5×q5gcbuffer，0.8μl10mmdntp，0.5μlq5high-fidelitydnapolymerase，ddh2oto20μl。
(程序)step198℃3min，step298℃30s，step355℃20s，step472℃2min，step5goto2×15，step672℃10min，step74℃forever。
融合pcr第2步：(體系)融合pcr1反應產物2μl，cyp41up-f2.5μl，cyp41down-r2.5μl，10μl5×q5reactionbuffer，10μl5×q5gcbuffer，3μl10mmdntp，0.5μlq5high-fidelitydnapolymerase，ddh2oto50μl。
(程序)step198℃3min，step298℃10s，step3依引物定30s，step472℃2min，step5goto2×35，step672℃10min，step74℃forever。
二、cyp41基因刪除重組冰城鏈霉菌的獲得：
將步驟一中構建的質粒pkccyp41neo導入et12567(puz8002)中，通過接合轉移方法(參照zhangy,heh,liuh,wangh,wangx,xiangw.characterizationofapathway-specificactivatorofmilbemycinbiosynthesisandimprovedmilbemycinproductionbyitsoverexpressioninstreptomycesbingchengsis.microbcellfact.2016；15(1):152.doi:10.1186/s12934-016-0552-1)導入到冰城鏈霉菌bcwt中，接合子長出后挑到含安普霉素(apr)和萘啶酮酸(nal)的skym培養基上，9天后將菌株置于37℃培養進行單交換，培養7d后在無抗skym培養基上培養3代后挑aprskanr(安普霉素敏感，卡那霉素抗性)的菌株。將挑到的aprskanr菌株在種子培養基培養菌絲，得到菌絲后提基因組，用3對引物：
cyp41up-f/r(cccaagcttcaggatgaggaacgacagga/cccaatagcagccagtccct)cyp41down-f/r(tagcgttggctacccgtgatat/gctctagaattccgcaggagaacagatga)；cyp41-f/r(atggatgccccacgcgccgtcc/tggatgctgagggtgatgaaggcc)進行pcr驗證雙交換的位置是否正確，獲得重組冰城鏈霉菌bcdp。
對比例1：cyp41基因回補質粒構建。
用kod高保真酶體系、bcwt(cgmcc：1734)全基因組序列為模板、cyp41-f/r(caggaaacagctatgacatgattacgaattcggatgctgagggtgatgaaggc/ggctgcaggtcgactctagactgtcagttccctcttgttacc)為引物獲得包含cyp41上游啟動子和編碼區長為1.7kb的片段，將此pcr片段通過clonexpressmultis試劑盒克隆到ecori-和xbai-雙酶切過的載體pset152上得到質粒pset152::cyp41。
同時cyp41的編碼區和hrdb啟動子分別用cyp41hrdb-f/r(tcgtggtccttgtagtcctcgagagcgtgcggcgtgaaac/gttccgagaggttgttcatggatgccccacgcgc)和hrdbcyp41-f/r(gcgcgtggggcatccatgaacaacctctcggaac/aatcgttagttaggctaactagttctagaccgccttccgc)引物獲得，cyp41的編碼區擴增模板為bcwt(cgmcc：1734)全基因組序列，hrdb啟動子擴增模板為streptomycescoelicolora3(2)基因組，將cyp41編碼區和hrdb啟動子片段通過clonexpressmultis試劑盒克隆到spei和xhoi雙酶切過的載體pij10500上得到質粒pij10500::phrdbcyp41。
對比例2：在敲除cyp41基因重組冰城鏈霉菌中回補cyp41基因。
將對比例1中構建的質粒pset152::cyp41、pij10500::phrdbcyp41分別導入et12567(puz8002)中，通過接合轉移方法導入到重組冰城鏈霉菌bcdp中，利用同實施例1相同的方法分別得到重組冰城鏈霉菌bcdp的回補菌株bcdsp、bcdhp。回補載體導入本發明獲得的敲除重組冰城鏈霉菌中使得蛋白cyp41在本發明獲得的敲除重組冰城鏈霉菌中發揮功能，該方法進一步驗證了cyp41功能。
實施例2：發酵驗證。
將上述制備的各重組菌株以及原始菌株bcwt(cgmcc：1734)在skym(蔗糖0.4g，脫脂奶粉0.1g，酵母浸粉0.2g，麥芽浸粉0.5g，蒸餾水補齊至100ml，瓊脂粉2.0g，ph＝7.2)固體培養基上28℃培養9天后，進冰城鏈霉菌種子培養基(蔗糖1.0g，脫脂奶粉0.1g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.35g，k2hpo40.05g，蒸餾水補齊至100ml，ph＝7.2)，28℃250rpm46h培養后以6％的接種量進冰城鏈霉菌發酵培養基(蔗糖8.0g，脫脂奶粉0.1g，黃豆餅粉2.0g，feso40.01g，k2hpo40.1g，caco30.3g，蒸餾水補齊至100ml，ph＝7.2)，28℃250rpm培養9天后取0.5ml發酵液，用1.5ml乙醇浸泡旋轉過夜，離心取上清進行hplc檢測。hplc分析條件，色譜柱：綠百草sb-c18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動相b在15min內以1.0ml/min流速從0到100％梯度變化(流動相a：乙腈-水-甲醇(350：50：100，v/v/v)；流動相b：甲醇)；吸收波長242nm。
hplc檢測結果如圖3所示，圖中a為：hplc檢測結果：依次為野生型冰城鏈霉菌bcwt發酵樣品；重組菌株bcdp發酵樣品；重組菌株bcdhp發酵樣品；重組菌株bcdsp發酵樣品。圖中b為：bcwt、bcdp的a3+a4效價比較。結果表明，本發明獲得的cyp41基因失活重組冰城鏈霉菌株與回補重組菌株和野生型菌株相比較，副產物組分米爾貝霉素α9/α10消失(圖3中a)，且本發明獲得的cyp41基因失活重組冰城鏈霉菌株米爾貝霉素a3+a4的效價相較野生型菌株提高19.5％(圖3中b)。
實施例3：體外投喂。
將對比例1中構建的質粒pij10500::phrdbcyp41導入et12567(puz8002)中，通過接合轉移方法導入到天藍鏈霉菌m1146中，利用同實施例1相同的方法得到重組天藍鏈霉菌m1146-cyp41。重組菌株m1146-cyp41以及原始菌株m1146分別在tsb(胰蛋白胨大豆肉湯3g，100ml蒸餾水)液體培養基中30℃250rpm培養48h后，加入終濃度為1mg/ml的溶于dmso(v/v，1：1000)的米爾貝霉素a3/a4標品，30℃250rpm培養24h后用等體積乙酸乙酯萃取，12000rpm4℃離心15min后，吸取上清于新試管中并用真空旋轉蒸干儀蒸干，然后用100ml甲醇溶解并進行lc-ms檢測。
lc-ms檢測結果表明，cyp41可以催化米爾貝霉素a3/a4形成米爾貝霉素α26/α27，而α26/α27可進一步生成米爾貝霉素α9/α10，即cyp41參與了米爾貝霉素α9/α10生物合成。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
核苷酸序列表
<110>中國農業科學院植物保護研究所
<120>一種生產米爾貝霉素的重組菌及其構建方法與應用
<130>
<160>19
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1326
<212>dna
<213>cyp41全核苷酸序列
<400>1
atggatgccccacgcgccgtccacgccggtgagaagcgctatgactccgtggacctgtcg60
tccctggccttctggtcgcagaccgccgaggagcgggagcggtccttcgccctgctgcgc120
gccgagcggccggtgtcctggcaccggccggtggaggggaggttgctgccggacccggac180
gacacgggcttttgggccgtcgtccggcatgaggacatcatgacggtcagccgccgcacc240
gatctgttcgcctcgtccgccggtgtgctgctcgagaacatccccgagggtctgctcgaa300
ggctcgcagtccctgctcgccatggacccgccccggcacaccaagatcaggcggctggtc360
agcggcgccttcaccccgcggcacatccttgggatgcgaaagcggatcgaggcccacgcg420
cggcggatcgtcggcgagttggcccgccgccccgacggcagggccgacttcatgcgggac480
tgcgcatcgctgctgcccatgcgcgtgatctccgatgtgatgggcatcccccgcgaatgg540
caggacaccgtggccgcgacggtctcccagagcatcagcggcagcggcacggacggggag600
gacggggagggcggggagcgcggggagcgcggggagggcggggacgagcagagcccgttg660
gagcttctgatcgagggcaatcgcagactgcgcgccatggcgctgaatctggccgggtta720
cggcgtggccgcccggctcaggacctgatgaccgtcctggtccaggccgaggtcgacggg780
gaccggctgaccgacgacgacatcgccgacttcttcctgctgctgtgcctggcgggcaac840
gacagtacgacgcagaccatcggccacgggctcagactgctcaccgacctgcccgagcaa900
cgcgcctggctgctggccggcctcgacggccggatcggccccgccgtggaggagatcctg960
cgctacgccacacccgtgctgaccttccgccgtacggcggtggcccccacccggctcggc1020
ggccggcacatctcggcaggggacaaggtggtgatgttctacgcctcgggcaaccgcgac1080
gcggccgtcttccgcgaaccgggacgttttgacctcgcccgcgatcccaacccccagctg1140
tccttcggcggtggcggtgcgcactactgcctggccgcccagctcgccagggcgcagctg1200
agaatcctcttccgggaactgctgcggatgctgcccgatatcgaggcgggtgagcccgag1260
tttgtgaccgggacgtccatccacggaatgacgcggctgccctgccgtttcacgccgcac1320
gcttga
<210>2
<211>1139
<212>dna
<213>cyp41基因敲除的序列
<400>2
ccggacccggacgacacgggcttttgggccgtcgtccggcatgaggacatcatgacggtc60
agccgccgcaccgatctgttcgcctcgtccgccggtgtgctgctcgagaacatccccgag120
ggtctgctcgaaggctcgcagtccctgctcgccatggacccgccccggcacaccaagatc180
aggcggctggtcagcggcgccttcaccccgcggcacatccttgggatgcgaaagcggatc240
gaggcccacgcgcggcggatcgtcggcgagttggcccgccgccccgacggcagggccgac300
ttcatgcgggactgcgcatcgctgctgcccatgcgcgtgatctccgatgtgatgggcatc360
ccccgcgaatggcaggacaccgtggccgcgacggtctcccagagcatcagcggcagcggc420
acggacggggaggacggggagggcggggagcgcggggagcgcggggagggcggggacgag480
cagagcccgttggagcttctgatcgagggcaatcgcagactgcgcgccatggcgctgaat540
ctggccgggttacggcgtggccgcccggctcaggacctgatgaccgtcctggtccaggcc600
gaggtcgacggggaccggctgaccgacgacgacatcgccgacttcttcctgctgctgtgc660
ctggcgggcaacgacagtacgacgcagaccatcggccacgggctcagactgctcaccgac720
ctgcccgagcaacgcgcctggctgctggccggcctcgacggccggatcggccccgccgtg780
gaggagatcctgcgctacgccacacccgtgctgaccttccgccgtacggcggtggccccc840
acccggctcggcggccggcacatctcggcaggggacaaggtggtgatgttctacgcctcg900
ggcaaccgcgacgcggccgtcttccgcgaaccgggacgttttgacctcgcccgcgatccc960
aacccccagctgtccttcggcggtggcggtgcgcactactgcctggccgcccagctcgcc1020
agggcgcagctgagaatcctcttccgggaactgctgcggatgctgcccgatatcgaggcg1080
ggtgagcccgagtttgtgaccgggacgtccatccacggaatgacgcggctgccctgccg1139
<210>3
<211>441
<212>prt
<213>cyp41基因編碼的氨基酸序列
<400>3
metaspalaproargalavalhisalaglyglulysargtyraspser
151015
valaspleuserserleualaphetrpserglnthralaglugluarg
202530
gluargserphealaleuleuargalagluargprovalsertrphis
354045
argprovalgluglyargleuleuproaspproaspaspthrglyphe
505560
trpalavalvalarghisgluaspilemetthrvalserargargthr
65707580
aspleuphealaserseralaglyvalleuleugluasnileproglu
859095
glyleuleugluglyserglnserleuleualametaspproproarg
100105110
histhrlysileargargleuvalserglyalaphethrproarghis
115120125
ileleuglymetarglysargileglualahisalaargargileval
130135140
glygluleualaargargproaspglyargalaaspphemetargasp
145150155160
cysalaserleuleuprometargvalileseraspvalmetglyile
165170175
proargglutrpglnaspthrvalalaalathrvalserglnserile
180185190
serglyserglythraspglygluaspglygluglyglygluarggly
195200205
gluargglygluglyglyaspgluglnserproleugluleuleuile
210215220
gluglyasnargargleuargalametalaleuasnleualaglyleu
225230235240
argargglyargproalaglnaspleumetthrvalleuvalglnala
245250255
gluvalaspglyaspargleuthraspaspaspilealaaspphephe
260265270
leuleuleucysleualaglyasnaspserthrthrglnthrilegly
275280285
hisglyleuargleuleuthraspleuprogluglnargalatrpleu
290295300
leualaglyleuaspglyargileglyproalavalglugluileleu
305310315320
argtyralathrprovalleuthrpheargargthralavalalapro
325330335
thrargleuglyglyarghisileseralaglyasplysvalvalmet
340345350
phetyralaserglyasnargaspalaalavalphearggluprogly
355360365
argpheaspleualaargaspproasnproglnleuserpheglygly
370375380
glyglyalahistyrcysleualaalaglnleualaargalaglnleu
385390395400
argileleuphearggluleuleuargmetleuproaspilegluala
405410415
glygluprogluphevalthrglythrserilehisglymetthrarg
420425430
leuprocysargphethrprohisala
435440
<210>4
<211>29
<212>dna
<213>cyp41up-f
<400>4
cccaagcttcaggatgaggaacgacagga29
<210>5
<211>28
<212>dna
<213>cyp41up-r
<400>5
caggggatcccagcaacctcccctccac28
<210>6
<211>27
<212>dna
<213>cyp41down-f
<400>6
ttcactggcctttcacgccgcacgctt27
<210>7
<211>29
<212>dna
<213>cyp41down-r
<400>7
gctctagaattccgcaggagaacagatga29
<210>8
<211>26
<212>dna
<213>cyp41neo-f
<400>8
gaggttgctgggatcccctggatacc26
<210>9
<211>26
<212>dna
<213>cyp41neo-r
<400>9
cggcgtgaaaggccagtgaattcgag26
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>cyp41up-r
<400>10
cccaatagcagccagtccct20
<210>11
<211>22
<212>dna
<213>cyp41down-f
<400>11
tagcgttggctacccgtgatat22
<210>12
<211>22
<212>dna
<213>cyp41-f
<400>12
atggatgccccacgcgccgtcc22
<210>13
<211>24
<212>dna
<213>cyp41-r
<400>13
tggatgctgagggtgatgaaggcc24
<210>14
<211>53
<212>dna
<213>cyp41-f
<400>14
caggaaacagctatgacatgattacgaattcggatgctgagggtgatgaaggc53
<210>15
<211>42
<212>dna
<213>cyp41-r
<400>15
ggctgcaggtcgactctagactgtcagttccctcttgttacc42
<210>16
<211>40
<212>dna
<213>cyp41hrdb-f
<400>16
tcgtggtccttgtagtcctcgagagcgtgcggcgtgaaac40
<210>17
<211>34
<212>dna
<213>cyp41hrdb-r
<400>17
gttccgagaggttgttcatggatgccccacgcgc34
<210>18
<211>34
<212>dna
<213>hrdbcyp41-f
<400>18
gcgcgtggggcatccatgaacaacctctcggaac34
<210>19
<211>40
<212>dna
<213>hrdbcyp41-r
<400>19
aatcgttagttaggctaactagttctagaccgccttccgc40