背景技術(shù)：
1、本技術(shù)一般涉及分子生物學(xué)，并且更具體地涉及用于增強(qiáng)對核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測序的穩(wěn)定性的組合物和方法，以及它們的使用方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、在一般方面a1中，一種形成經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體的方法包括：(a)提供多個串聯(lián)體，其中各個串聯(lián)體包括靶序列的多個實(shí)例和至少一種銜接子序列的多個實(shí)例；(b)使所述多個串聯(lián)體與訂書釘分子接觸以形成多個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體；其中各個訂書釘分子至少包括第一區(qū)域和第二區(qū)域；并且其中訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自與所述至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
2、本技術(shù)的方法可進(jìn)一步包括以下方面中的任一者：
3、a2.根據(jù)方面a1所述的方法，其中步驟(a)的所述提供多個串聯(lián)體包括用鏈置換聚合酶由與環(huán)狀核酸模板雜交的引物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(rca)，其中所述環(huán)狀核酸模板包括所述靶序列和所述至少一種銜接子序列。
4、a3.根據(jù)方面a2所述的方法，其進(jìn)一步包括環(huán)化包括所述靶序列和所述至少一種銜接子序列的線性核酸模板以產(chǎn)生所述環(huán)狀核酸模板。
5、a4.根據(jù)方面a3所述的方法，其中所述線性核酸模板包括所述靶序列3'的第一銜接子序列和所述靶序列5'的第二銜接子序列。
6、a5.根據(jù)方面a4所述的方法，其中所述線性核酸模板的所述第一銜接子序列和所述第二銜接子序列在與夾板寡核苷酸雜交后連接。
7、a6.根據(jù)方面a5所述的方法，其中所述夾板寡核苷酸是與經(jīng)環(huán)化的核酸雜交的所述引物。
8、a7.根據(jù)方面a5所述的方法，其中在rca之前去除所述夾板寡核苷酸。
9、a8.根據(jù)方面a2所述的方法，其中在rca期間將所述引物固定在表面上。
10、a9.根據(jù)方面a2所述的方法，其中在rca期間所述引物處于溶液中。
11、a10.根據(jù)方面a9所述的方法，其進(jìn)一步包括在接觸步驟(b)之后將所述多個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體沉積在表面上。
12、a11.根據(jù)方面a10所述的方法，其中所述表面是結(jié)構(gòu)化表面。
13、a12.根據(jù)方面a9所述的方法，其進(jìn)一步包括在接觸步驟(b)之前將所述多個串聯(lián)體沉積在表面上。
14、a13.根據(jù)方面a12所述的方法，其中所述表面是結(jié)構(gòu)化表面。
15、a14.根據(jù)方面a2所述的方法，其中rca產(chǎn)生有義鏈，并且所述方法進(jìn)一步包括擴(kuò)增所述有義鏈以產(chǎn)生多條反義鏈。
16、a15.根據(jù)方面a14所述的方法，其中所述訂書釘分子中的至少一些與所述多條反義鏈的銜接子序列雜交。
17、a16.根據(jù)方面a14所述的方法，其中步驟(b)進(jìn)一步包括使所述訂書釘分子與所述有義鏈雜交。
18、a17.根據(jù)方面a16所述的方法，其中所述訂書釘分子中的至少一些是用于擴(kuò)增所述有義鏈以產(chǎn)生所述多條反義鏈的訂書釘引物。
19、a18.根據(jù)方面a2所述的方法，其中接觸步驟(b)在rca步驟(a)期間發(fā)生。
20、a19.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例包括引物結(jié)合位點(diǎn)。
21、a20.根據(jù)方面a19所述的方法，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例進(jìn)一步包括標(biāo)簽區(qū)域，任選地其中所述標(biāo)簽區(qū)域是樣品索引。
22、a21.根據(jù)方面a19所述的方法，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例進(jìn)一步包括夾板結(jié)合位點(diǎn)。
23、a22.根據(jù)方面a19所述的方法，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例進(jìn)一步包括可變區(qū)域，任選地其中所述可變區(qū)域是獨(dú)特分子標(biāo)識符(umi)。
24、a23.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述各個串聯(lián)體包括與多條反義鏈雜交的有義鏈。
25、a24.根據(jù)方面a23所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自與不同反義鏈上的所述至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
26、a25.根據(jù)方面a23所述的方法，其中所述有義鏈不包括尿嘧啶并且所述多條反義鏈包括尿嘧啶。
27、a26.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述各個串聯(lián)體內(nèi)的所述靶序列的所有實(shí)例都是相同的。
28、a27.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述靶序列的實(shí)例包括有義序列或反義序列。
29、a28.根據(jù)方面a1所述的方法，其中提供固定至流動池中的表面的所述多個串聯(lián)體。
30、a29.根據(jù)方面a28所述的方法，其中所述表面是連續(xù)表面。
31、a30.根據(jù)方面a28所述的方法，其中將所述多個串聯(lián)體固定至所述流動池的結(jié)構(gòu)化表面的結(jié)合位點(diǎn)。
32、a31.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述多個串聯(lián)體在步驟(a)中提供在溶液中并在步驟(b)中沉積在流動池的表面上。
33、a32.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域的序列是相同的。
34、a33.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括允許延伸的3'端。
35、a34.根據(jù)方面a33所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述3'端在距離所述靶序列的3'端40個核苷酸內(nèi)雜交。
36、a35.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括所述訂書釘分子的3'端并且與所述至少一種銜接子序列的引物結(jié)合位點(diǎn)雜交。
37、a36.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括允許三元復(fù)合物形成的3'端。
38、a37.根據(jù)方面a36所述的方法，其中將允許三元復(fù)合物形成的所述3'端可逆地終止。
39、a38.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域都不包括允許三元復(fù)合物形成或延伸的3'端。
40、a39.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述多個串聯(lián)體包括重復(fù)序列單元，所述重復(fù)序列單元包括所述靶序列和所述至少一種銜接子序列。
41、a40.根據(jù)方面a39所述的方法，其中所述序列單元內(nèi)的所述至少一種銜接子序列包括所述靶序列3'的第一銜接子序列和所述靶序列5'的第二銜接子序列。
42、a41.根據(jù)方面a40所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域與所述第一銜接子序列雜交并且所述訂書釘分子的所述第二區(qū)域與所述第二銜接子序列雜交。
43、a42.根據(jù)方面a40所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括所述訂書釘分子的3'端并且與3'銜接子雜交。
44、a43.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自的長度是至少10個核苷酸。
45、a44.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自與間隔至少100個核苷酸的所述至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
46、a45.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子的3'端包括至少一個錯配、防止核苷酸摻入的阻斷物或防止三元復(fù)合物形成的帽。
47、a46.根據(jù)方面a45所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述3'端包括防止核苷酸摻入的阻斷物。
48、a47.根據(jù)方面a45所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述3'端防止三元復(fù)合物形成。
49、a48.根據(jù)方面a47所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述3'端用防止三元復(fù)合物形成的部分加帽。
50、a49.根據(jù)方面a47所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述3'端包括錯配和阻斷物，任選地其中所述阻斷物是3'磷酸酯阻斷物。
51、a50.根據(jù)方面a1所述的方法，其中所述訂書釘分子中的至少一些的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域被間隔子分開。
52、a51.根據(jù)方面a50所述的方法，其中所述訂書釘分子中的至少一些不包括間隔子。
53、a52.根據(jù)方面a50所述的方法，其中所述間隔子包括多核苷酸序列。
54、a53.根據(jù)方面a52所述的方法，其中所述多核苷酸序列的長度是可變的。
55、a54.根據(jù)方面a52所述的方法，其中所述多核苷酸序列包括雙鏈dna序列。
56、a55.根據(jù)方面a54所述的方法，其中所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自包括與所述串聯(lián)體雜交的3'端。
57、a56.根據(jù)方面a50所述的方法，其中所述間隔子在不同的訂書釘分子中具有可變的長度。
58、a57.根據(jù)方面a50所述的方法，其中所述間隔子包括非核苷酸聚合物接頭。
59、a58.根據(jù)方面a57所述的方法，其中所述非核苷酸聚合物接頭包括聚乙二醇(peg)。
60、a59.根據(jù)方面a57所述的方法，其中所述非核苷酸聚合物接頭包括樹枝狀大分子。
61、a60.根據(jù)方面a59所述的方法，其中所述樹枝狀大分子包括聚酰胺胺(pamam)。
62、a61.根據(jù)方面a59所述的方法，其中所述訂書釘分子與所述至少一種銜接子序列的3個或更多個實(shí)例雜交。
63、a62.根據(jù)方面a61所述的方法，其中所述訂書釘分子與所述至少一種銜接子序列的10個或更多個實(shí)例雜交。
64、a63.根據(jù)方面a61所述的方法，其中所述訂書釘分子中的大部分與側(cè)接至少10個不同靶序列的銜接子序列雜交。
65、a64.根據(jù)方面a59所述的方法，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域都不包括允許三元復(fù)合物形成或延伸的3'端。
66、a65.根據(jù)方面a50所述的方法，其中所述間隔子與所述第一區(qū)域的3'端偶聯(lián)。
67、a66.根據(jù)方面a65所述的方法，其中所述間隔子與所述第二區(qū)域的5'端偶聯(lián)。
68、a67.根據(jù)方面a65所述的方法，其中所述間隔子與所述第二區(qū)域的3'端偶聯(lián)并且其中所述訂書釘分子不能充當(dāng)引物。
69、a68.根據(jù)方面a1所述的方法，其中多個訂書釘分子與相同的串聯(lián)體雜交。
70、a69.根據(jù)方面a1所述的方法，其中提供所述多個串聯(lián)體包括在壓實(shí)添加劑的存在下形成所述串聯(lián)體。
71、a70.根據(jù)方面a69所述的方法，其中所述壓實(shí)添加劑是聚合物。
72、a71.根據(jù)方面a70所述的方法，其中所述聚合物是pamam樹枝狀大分子。
73、a72.根據(jù)方面a1或a69中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述訂書釘引物不使所述串聯(lián)體壓實(shí)。
74、a73.根據(jù)方面a1或a72所述的方法，其中所述訂書釘引物的第一區(qū)域是所述訂書釘引物的第二區(qū)域的3'。
75、a74.根據(jù)方面73所述的方法，其進(jìn)一步包括從所述訂書釘引物的所述第一區(qū)域的3'端對所述串聯(lián)體的部分進(jìn)行測序。
76、a75.根據(jù)方面a74所述的方法，其中所述串聯(lián)體的所述部分是所述靶序列的至少第一部分。
77、a76.根據(jù)方面a75所述的方法，其中所述串聯(lián)體的所述部分是所述至少一種銜接子序列的標(biāo)簽區(qū)域，任選地其中所述標(biāo)簽區(qū)域是樣品索引。
78、a77.根據(jù)方面a74至a76中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括阻斷所述訂書釘引物以防止從所述訂書釘引物進(jìn)一步測序。
79、a78.根據(jù)方面a77所述的方法，其中用三元復(fù)合物抑制劑進(jìn)行阻斷。
80、a79.根據(jù)方面a77或a78所述的方法，其進(jìn)一步包括使另一引物與所述銜接子序列的未與所述訂書釘引物雜交的區(qū)域雜交，其中所述另一引物不是訂書釘引物。
81、a80.根據(jù)方面a79所述的方法，其進(jìn)一步包括從所述另一引物對所述串聯(lián)體的第二部分進(jìn)行測序，同時所述訂書釘引物保持與所述串聯(lián)體雜交。
82、a81.根據(jù)方面a74至a80中任一項(xiàng)所述的方法，其包括至少100個測序循環(huán)。
83、a82.根據(jù)方面81所述的方法，其中在所述至少100個測序循環(huán)后，所述串聯(lián)體的半峰全寬(fwhm)沒有增加超過5%。
84、a83.根據(jù)方面82所述的方法，其中如果不存在所述訂書釘引物的所述第二區(qū)域，則在所述至少100個測序循環(huán)后，所述串聯(lián)體的半峰全寬(fwhm)不會增加超過5%。
85、a84.根據(jù)方面83所述的方法，其中如果不存在所述訂書釘引物的所述第二區(qū)域，則在所述至少100個測序循環(huán)后，所述串聯(lián)體的半峰全寬(fwhm)不會增加超過10%。
86、a85.根據(jù)方面a73至a84中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述串聯(lián)體是有義鏈，并且其中提供多個串聯(lián)體包括通過多鏈置換(mda)由所述串聯(lián)體產(chǎn)生多條反義鏈，對所述反義鏈的部分進(jìn)行測序，以及消化所述反義鏈。
87、組合物
88、組合物可通常包括一種經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體的方面b1，其包括：
89、(a)串聯(lián)體，其包括靶序列的多個實(shí)例和至少一種銜接子序列的多個實(shí)例；以及(b)一個或多個訂書釘分子；其中各個訂書釘分子至少包括第一區(qū)域和第二區(qū)域；并且其中訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自與所述至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
90、組合物可進(jìn)一步包括以下方面中的任一者：
91、b2.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述串聯(lián)體是用鏈置換聚合酶由與環(huán)狀核酸模板雜交的引物進(jìn)行rca的產(chǎn)物，其中所述環(huán)狀核酸模板包括所述靶序列和所述至少一種銜接子序列。
92、b3.根據(jù)方面b2所述的組合物，其中所述環(huán)狀核酸模板是對包括所述靶序列和至少一種銜接子序列的線性核酸模板進(jìn)行環(huán)化的產(chǎn)物。
93、b4.根據(jù)方面b3所述的組合物，其中所述線性核酸模板包括所述靶序列3'的第一銜接子序列和所述靶序列5'的第二銜接子序列。
94、b5.根據(jù)方面b4所述的組合物，其中所述線性核酸模板的所述第一銜接子序列和所述第二銜接子序列在與夾板寡核苷酸雜交后連接。
95、b6.根據(jù)方面b5所述的組合物，其中所述夾板寡核苷酸是與經(jīng)環(huán)化的核酸雜交的所述引物。
96、b7.根據(jù)方面b5所述的組合物，其中在rca之前去除所述夾板寡核苷酸。
97、b8.根據(jù)方面b2所述的組合物，其中在rca期間將所述引物固定在表面上。
98、b9.根據(jù)方面b2所述的組合物，其中在rca期間所述引物處于溶液中。
99、b10.根據(jù)方面b9所述的組合物，其中在使所述串聯(lián)體與一個或多個訂書釘分子雜交之后，將所述串聯(lián)體附接至表面。
100、b11.根據(jù)方面b10所述的組合物，其中所述表面是結(jié)構(gòu)化表面。
101、b12.根據(jù)方面b9所述的組合物，其中在使所述串聯(lián)體與一個或多個訂書釘分子雜交之前，將所述串聯(lián)體附接至表面。
102、b13.根據(jù)方面b12所述的組合物，其中所述表面是結(jié)構(gòu)化表面。
103、b14.根據(jù)方面b2所述的組合物，其中所述串聯(lián)體是有義鏈，并且所述組合物進(jìn)一步包括由所述有義鏈的擴(kuò)增產(chǎn)生的多條反義鏈。
104、b15.根據(jù)方面b14所述的組合物，其中所述一個或多個訂書釘分子中的至少一些與所述多條反義鏈的銜接子序列雜交。
105、b16.根據(jù)方面b14所述的組合物，其中所述一個或多個訂書釘分子與有義鏈雜交。
106、b17.根據(jù)方面b16所述的組合物，其中所述一個或多個訂書釘分子中的至少一些是用于擴(kuò)增所述有義鏈以產(chǎn)生所述多條反義鏈的一個或多個訂書釘引物。
107、b18.根據(jù)方面b2所述的方法，其中所述一個或多個訂書釘分子在rca期間與所述串聯(lián)體雜交。
108、b19.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例包括引物結(jié)合位點(diǎn)。
109、b20.根據(jù)方面b19所述的組合物，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例進(jìn)一步包括標(biāo)簽區(qū)域，任選地其中所述標(biāo)簽區(qū)域是樣品索引。
110、b21.根據(jù)方面b19所述的組合物，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例進(jìn)一步包括夾板結(jié)合位點(diǎn)。
111、b22.根據(jù)方面b19所述的組合物，其中所述至少一種銜接子序列的各個實(shí)例進(jìn)一步包括可變區(qū)域，任選地其中所述可變區(qū)域是獨(dú)特分子標(biāo)識符(umi)。
112、b23.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述串聯(lián)體包括與多條反義鏈雜交的有義鏈。
113、b24.根據(jù)方面b23所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自與不同反義鏈上的所述至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
114、b25.根據(jù)方面b23所述的組合物，其中所述有義鏈不包括尿嘧啶并且所述多條反義鏈包括尿嘧啶。
115、b26.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述串聯(lián)體內(nèi)的所述靶序列的所有實(shí)例都是相同的。
116、b27.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述靶序列的實(shí)例包括有義序列或反義序列。
117、b28.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中提供固定至流動池中的表面的所述串聯(lián)體。
118、b29.根據(jù)方面b28所述的組合物，其中所述表面是連續(xù)表面。
119、b30.根據(jù)方面b28所述的組合物，其中將所述串聯(lián)體固定至所述流動池的結(jié)構(gòu)化表面的結(jié)合位點(diǎn)。
120、b31.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述串聯(lián)體在溶液中產(chǎn)生并隨后附接至流動池的表面。
121、b32.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域的序列是相同的。
122、b33.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括允許延伸的3'端。
123、b34.根據(jù)方面b33所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述3'端在距離所述靶序列的3'端40個核苷酸內(nèi)雜交。
124、b35.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括所述訂書釘分子的3'端并且與所述至少一種銜接子序列的引物結(jié)合位點(diǎn)雜交。
125、b36.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括允許三元復(fù)合物形成的3'端。
126、b37.根據(jù)方面b36所述的組合物，其中將允許三元復(fù)合物形成的所述3'端可逆地終止。
127、b38.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域都不包括允許三元復(fù)合物形成或延伸的3'端。
128、b39.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述串聯(lián)體包括重復(fù)序列單元，所述重復(fù)序列單元包括所述靶序列和所述至少一種銜接子序列。
129、b40.根據(jù)方面b39所述的組合物，其中所述序列單元內(nèi)的所述至少一種銜接子序列包括靶序列3'的第一銜接子序列和靶序列5'的第二銜接子序列。
130、b41.根據(jù)方面b40所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域與所述第一銜接子序列雜交并且所述訂書釘分子的所述第二區(qū)域與所述第二銜接子序列雜交。
131、b42.根據(jù)方面b40所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域中的至少一者包括所述訂書釘分子的3'端并且與3'銜接子雜交。
132、b43.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自的長度是至少10個核苷酸。
133、b44.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自與間隔至少100個核苷酸的所述至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
134、b45.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子的3'端包括至少一個錯配、防止核苷酸摻入的阻斷物或防止三元復(fù)合物形成的帽。
135、b46.根據(jù)方面b45所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述3'端包括防止核苷酸摻入的阻斷物。
136、b47.根據(jù)方面b45所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述3'端防止三元復(fù)合物形成。
137、b48.根據(jù)方面b47所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述3'端用防止三元復(fù)合物形成的部分加帽。
138、b49.根據(jù)方面b47所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述3'端包括錯配和阻斷物，任選地其中所述阻斷物是3'磷酸酯阻斷物。
139、b50.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中所述訂書釘分子中的至少一些的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域被間隔子分開。
140、b51.根據(jù)方面b50所述的組合物，其中所述一個或多個訂書釘分子中的至少一些不包括間隔子。
141、b52.根據(jù)方面b50所述的組合物，其中所述間隔子包括多核苷酸序列。
142、b53.根據(jù)方面b52所述的組合物，其中所述多核苷酸序列的長度是可變的。
143、b54.根據(jù)方面b52所述的組合物，其中所述多核苷酸序列包括雙鏈dna序列。
144、b55.根據(jù)方面b54所述的組合物，其中所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域各自包括與所述串聯(lián)體雜交的3'端。
145、b56.根據(jù)方面b50所述的組合物，其中所述間隔子在不同的訂書釘分子中具有可變的長度。
146、b57.根據(jù)方面b50所述的組合物，其中所述間隔子包括非核苷酸聚合物接頭。
147、b58.根據(jù)方面b57所述的組合物，其中所述非核苷酸聚合物接頭包括聚乙二醇(peg)。
148、b59.根據(jù)方面b57所述的組合物，其中所述非核苷酸聚合物接頭包括樹枝狀大分子。
149、b60.根據(jù)方面b59所述的組合物，其中所述樹枝狀大分子包括聚酰胺胺(pamam)。
150、b61.根據(jù)方面b59所述的組合物，其中所述一個或多個訂書釘分子與所述至少一種銜接子序列的3個或更多個實(shí)例雜交。
151、b62.根據(jù)方面b61所述的組合物，其中所述一個或多個訂書釘分子與所述至少一種銜接子序列的10個或更多個實(shí)例雜交。
152、b63.根據(jù)方面a61所述的組合物，其中所述一個或多個訂書釘分子中的大部分與側(cè)接至少10個不同靶序列的銜接子序列雜交。
153、b64.根據(jù)方面b59所述的組合物，其中所述訂書釘分子的所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域都不包括允許三元復(fù)合物形成或延伸的3'端。
154、b65.根據(jù)方面b50所述的組合物，其中所述間隔子與所述第一區(qū)域的3'端偶聯(lián)。
155、b66.根據(jù)方面b65所述的組合物，其中所述間隔子與所述第二區(qū)域的5'端偶聯(lián)。
156、b67.根據(jù)方面b65所述的組合物，其中所述間隔子與所述第二區(qū)域的3'端偶聯(lián)并且其中所述訂書釘分子不能充當(dāng)引物。
157、b68.根據(jù)方面b1所述的組合物，其中多個訂書釘分子與相同的串聯(lián)體雜交。
158、測序方法
159、測序方法可通常包括一種對靶序列進(jìn)行測序的方法的方面c1，該方法包括：(i)根據(jù)方面b1至b68中任一項(xiàng)所述的多個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體或通過a1至a68的方法中的任一者提供多個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體；以及(ii)對所述靶序列的至少第一部分進(jìn)行測序。
160、測序方法可進(jìn)一步包括以下方面中的任一者：
161、c2.根據(jù)方面c1所述的方法，其中測序步驟(ii)使用可逆終止的核苷酸。
162、c3.根據(jù)方面c1所述的方法，其中訂書釘分子包括測序步驟(ii)中的訂書釘引物。
163、c4.根據(jù)方面c3所述的方法，其中在從所述訂書釘引物進(jìn)行測序之后，對所述訂書釘引物阻斷或加帽，并且使另外的引物與所述串聯(lián)體雜交，隨后從所述另外的引物進(jìn)行測序。
164、c31.根據(jù)方面c4所述的方法，其中所述另外的引物是非訂書釘引物。
165、c32.根據(jù)方面c4所述的方法，其中所述另外的引物是訂書釘引物。
166、c5.根據(jù)方面c1所述的方法，其中測序步驟(ii)包括邊合成邊測序(sbs)。
167、c6.根據(jù)方面c1所述的方法，其中測序步驟(ii)包括邊結(jié)合邊測序(sbb)。
168、c7.根據(jù)方面c1所述的方法，其中測序步驟(ii)包括使用所述訂書釘分子作為訂書釘引物的邊結(jié)合邊測序(sbb)。
169、c8.根據(jù)方面c7所述的方法，其中sbb包括以下循環(huán)步驟：(a)延伸：將可逆終止的核苷酸添加至所述訂書釘引物，(b)檢查：形成并檢測包括所述訂書釘引物的經(jīng)穩(wěn)定的三元復(fù)合物，以及(c)活化：從所述訂書釘引物切割可逆終止子。
170、c9.根據(jù)方面c8所述的方法，其中所述經(jīng)穩(wěn)定的三元復(fù)合物包括經(jīng)標(biāo)記的核苷酸和經(jīng)標(biāo)記的聚合酶中的至少一者。
171、c10.根據(jù)方面c8所述的方法，其進(jìn)一步包括對訂書釘引物進(jìn)行加帽。
172、c11.根據(jù)方面c10所述的方法，其進(jìn)一步包括使非訂書釘引物與所述經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體雜交并在sbb過程中對所述靶序列的第二部分進(jìn)行測序。
173、c12.根據(jù)方面c11所述的方法，其中所述靶序列的所述第二部分與所述第一部分的至少一部分重疊。
174、c13.根據(jù)方面c11所述的方法，其中所述靶序列的所述第二部分在所述第一部分的上游。
175、c14.根據(jù)方面c11所述的方法，其中所述靶序列的所述第二部分在所述第一部分的下游。
176、c15.根據(jù)方面c11所述的方法，其中使對所述靶序列的所述第二部分進(jìn)行測序重復(fù)多次。
177、c16.根據(jù)方面c8所述的方法，其中sbb的所述循環(huán)步驟重復(fù)50次或更多次。
178、c17.根據(jù)方面c1所述的方法，其中所述多個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體中的各個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體包括與多條反義鏈雜交的有義鏈。
179、c18.根據(jù)方面c17所述的方法，其中訂書釘分子的第一區(qū)域和第二區(qū)域各自與所述多條反義鏈中的不同反義鏈上的至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
180、c19.根據(jù)方面c18所述的方法，其進(jìn)一步包括對所述多個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體的所述多條反義鏈中的至少一些進(jìn)行測序。
181、c20.根據(jù)方面c19所述的方法，其進(jìn)一步包括降解所述多個經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體的所述多條反義鏈，由此釋放所述訂書釘分子，任選地其中降解包括消化所述反義鏈的尿嘧啶核苷酸。
182、c21.根據(jù)方面c20所述的方法，其中所述降解包括用尿嘧啶-dna糖苷酶消化尿嘧啶。
183、c22.根據(jù)方面c20所述的方法，其進(jìn)一步包括使所述多個串聯(lián)體與訂書釘分子接觸，所述訂書釘分子各自與所述有義鏈上的所述至少一種銜接子序列的不同實(shí)例雜交。
184、c23.根據(jù)方面c22所述的方法，其進(jìn)一步包括對各個串聯(lián)體的所述有義鏈進(jìn)行測序。
185、c24.根據(jù)方面c23所述的方法，其中所述有義鏈的所述測序從與所述有義鏈雜交的訂書釘分子開始。
186、c25.根據(jù)方面c17所述的方法，其中所述訂書釘分子與所述有義鏈雜交。
187、c26.根據(jù)方面c25所述的方法，其中所述經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體包括與所述有義鏈雜交的多個訂書釘分子，并且其中所述多個訂書釘分子延伸以形成所述多條反義鏈。
188、c27.根據(jù)方面c1所述的方法，其中在至少100個測序循環(huán)之后，在至少一個維度上測量的所述經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體的平均半峰全寬(fwhm)沒有增加超過5%。
189、c28.根據(jù)方面c1所述的方法，其中在至少100個測序循環(huán)之后，在至少一個維度上測量的所述經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體的fwhm的平均增加被所述訂書釘分子降低至少5倍。
190、c29.根據(jù)方面c1所述的方法，其中所述經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體以大于150個循環(huán)的讀段長度進(jìn)行測序。
191、c30.根據(jù)方面c29所述的方法，其中與從未被訂書釘分子穩(wěn)定的串聯(lián)體獲得的平均信號相比，在最后的測序循環(huán)中從被所述訂書釘分子穩(wěn)定的串聯(lián)體獲得的平均信號高50%。
192、試劑盒
193、試劑盒可通常包括試劑盒的方面d1，該試劑盒包括根據(jù)方面1至166中任一項(xiàng)所述的訂書釘分子。
194、套件可進(jìn)一步包括以下方面中的任一者：
195、d2.根據(jù)方面d1所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括以下項(xiàng)的一者或多者：(i)一種或多種訂書釘引物，(ii)一種或多種非訂書釘引物，(iii)一種或多種銜接子，(iv)一種或多種聚合酶，(v)一種或多種連接酶，(vi)一種或多種夾板寡核苷酸，(vii)流動池，(viii)多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，(ix)多種可逆終止的核苷酸，(x)加帽部分或它們的任何組合。
196、e1.一種試劑盒，其包括：(i)第一銜接子，(ii)第二銜接子，和(iii)訂書釘分子，其中所述訂書釘分子的第一區(qū)域和第二區(qū)域各自與所述第一銜接子和/或所述第二銜接子的不同實(shí)例雜交。
197、e2.根據(jù)方面e1所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括：(iv)足以由靶核酸形成經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體的試劑，其中所述經(jīng)穩(wěn)定的串聯(lián)體包括所述第一銜接子、所述第二銜接子和所述訂書釘分子。