本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及來(lái)源于海膽的糖肽以及其制備技術(shù)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快、生活水平提高，當(dāng)今居民飲食結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化，為滿足對(duì)飲食高要求，食品中常有各種添加劑，而這些化學(xué)品在不斷影響著機(jī)體的免疫健康。另外，盡管腫瘤治療新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但目前化療藥仍是臨床治療腫瘤的重要手段，化療藥選擇性低，引起的骨髓抑制、白細(xì)胞減少癥、免疫器官損傷等顯著降低治療效果和導(dǎo)致不良預(yù)后，改善這些毒副作用對(duì)于提高治療效果和生存質(zhì)量有重要意義。多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和升高白細(xì)胞作用，但也存在分子量大、水溶性低、生物利用度低等問(wèn)題。
2、糖肽/糖蛋白是寡糖或多糖通過(guò)苷鍵與肽鏈聚合形成的一類生物活性物質(zhì)，在肽鏈上引入寡糖或多糖，不僅能提高蛋白/肽的水溶性，還能進(jìn)一步提高其耐酸、耐酶特性，抵抗胃腸道對(duì)蛋白/肽的消化，適用于口服，維持活性結(jié)構(gòu)而發(fā)揮更好和穩(wěn)定的生物活性。糖肽的理化性質(zhì)和抗消化能力與其分子量密切相關(guān)，一方面多糖的聚合度越低，分子量越小，水溶性越好，例如寡糖比多糖的溶解性好。另一方面短肽鏈溶解性和抗消化能力均優(yōu)于長(zhǎng)鏈肽或大分子蛋白質(zhì)。例如文獻(xiàn)報(bào)道降解后的南瓜4-6肽在模擬胃腸消解時(shí)保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定幾乎無(wú)裂解，具有更好的靶蛋白結(jié)合能力。
3、高鹽、低氧、缺乏光照的環(huán)境造就海洋生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)特異和生物活性優(yōu)越的成分，成為新藥研發(fā)的重要來(lái)源。海洋生物尤其海洋動(dòng)物體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)，目前報(bào)道的海洋蛋白分子量較大，易被胃腸道消解，例如牡蠣、海參等的蛋白，他們經(jīng)過(guò)降解得到的低分子量肽表現(xiàn)出更好的理化性質(zhì)和藥理活性。海膽生殖腺俗稱海膽黃，是海洋珍品，具有極高的食用價(jià)值，近年從海膽得到多種多糖，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用，但未見(jiàn)其糖肽類成分研究和應(yīng)用報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供一系列糖肽、糖肽制備技術(shù)，以及其在制備調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能、改善或治療免疫相關(guān)機(jī)體功能障礙或疾病、重塑腸道菌群的制劑中的應(yīng)用。
2、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了糖肽的制備方法，
3、將海膽生殖腺低溫勻漿后，依次用乙醇脫脂、水提取、脫蛋白得到總糖肽，再依次用離子色譜和凝膠色譜純化得到3種高純度糖肽。
4、優(yōu)選地，制備總糖肽的具體步驟為：
5、(1)海膽新鮮生殖腺與1倍量以上乙醇混合后勻漿破碎；
6、(2)重復(fù)用乙醇脫脂，干燥得脫脂粉末；
7、(3)脫脂粉末用水做溶劑提取，提取溫度低于50℃，提取液濃縮后用sevag法除蛋白，干燥得到總糖肽，命名為：hpgp。
8、優(yōu)選地，制備高純度糖肽的具體步驟為：
9、(1)總糖肽先用離子交換色譜分離，依次用水、1%?nacl、2%?nacl水溶液洗脫；
10、(2)將含糖肽的洗脫液合并，分別用分子排阻色譜純化，用水洗脫，得到3種糖肽，命名為：hpgp-1、hpgp-2、hpgp-3。
11、更優(yōu)選地，步驟(1)中的固定相為陰離子交換樹(shù)脂，步驟(2)中的固定相為排阻限小于10kda的凝膠。
12、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了糖肽的結(jié)構(gòu)組成。
13、優(yōu)選地，所述糖肽的分子量小于3kda。
14、優(yōu)選地，所述糖肽結(jié)構(gòu)中的單糖選自氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和核糖的一種或幾種。
15、優(yōu)選地，所述糖肽結(jié)構(gòu)中的氨基酸選自天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸的一種或幾種。
16、本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供第一個(gè)方面和第二個(gè)方面所述糖肽在制備調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能的制劑、改善或治療免疫相關(guān)機(jī)體功能障礙或疾病的制劑、改善或治療腸道菌群紊亂的制劑中應(yīng)用。
17、優(yōu)選地，所述的一種或幾種組合為任意一種糖肽單獨(dú)使用，或任意幾種糖肽組合使用。
18、優(yōu)選地，所述免疫相關(guān)機(jī)體功能障礙或疾病為骨髓抑制、白細(xì)胞減少癥、淋巴細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、脾臟損傷、胸腺損傷、結(jié)腸損傷、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高和肝功能損傷中的一種或幾種。
19、優(yōu)選地，所述制劑為益生元、功能性食品或藥物。
20、本發(fā)明的有益效果包括：制備技術(shù)避免了糖肽被酶解，保持其天然結(jié)構(gòu)，再利用離子色譜富集具有相似單糖和氨基酸組成的糖肽，并進(jìn)一步利用凝膠柱色譜純化，得到高純度糖肽。本發(fā)明糖肽分子量小于3kda，易溶于水，能抵抗胃腸道消化，保持免疫細(xì)胞激活作用。口服能保持生物活性，在免疫細(xì)胞、血常規(guī)、免疫器官指數(shù)和組織狀態(tài)等指標(biāo)上，顯著逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺的毒副作用；并能治療環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的腸道菌群紊亂，重塑腸道免疫穩(wěn)態(tài)，提高有益菌（包括3種下一代益生菌）的豐度并降低有害菌的豐度。低分子量及結(jié)構(gòu)中的氨基糖、色氨酸和短肽鏈對(duì)其抗消化和高活性有重要貢獻(xiàn)，也是區(qū)別于其它多糖、肽、蛋白、糖肽的特有結(jié)構(gòu)要素。
1.海膽糖肽及其制備方法，特征在于，
2.如權(quán)利要求1所述的海膽糖肽及其制備方法，特征在于，制備總糖肽的具體步驟為：
3.如權(quán)利要求1所述的海膽糖肽及其制備方法，特征在于，制備高純度糖肽的具體步驟為：
4.如權(quán)利要求3所述的海膽糖肽及其制備方法，特征在于，步驟(1)中的固定相為陰離子交換樹(shù)脂，步驟(2)中的固定相為排阻限小于10kda的凝膠。
5.如權(quán)利要求1所述的海膽糖肽及其制備方法，其特征在于，所述糖肽的分子量小于3kda，所述糖肽結(jié)構(gòu)中的單糖選自氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和核糖的一種或幾種，所述糖肽結(jié)構(gòu)中的氨基酸選自天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的糖肽的一種或幾種組合在制備調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能的制劑中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1-5中任一所述的糖肽的一種或幾種組合在制備改善或治療免疫相關(guān)機(jī)體功能障礙或疾病的制劑中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1-5中任一所述的糖肽的一種或幾種組合在制備改善或治療腸道菌群紊亂的制劑中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求6、7、8中所述的應(yīng)用，其特征在于，所述一種或幾種組合為任意一種糖肽單獨(dú)使用，或任意幾種糖肽組合使用。
10.如權(quán)利要求7中所述的糖肽的一種或幾種組合在制備改善或治療免疫相關(guān)機(jī)體功能障礙或疾病的制劑中的應(yīng)用，所述免疫相關(guān)機(jī)體功能障礙或疾病為骨髓抑制、白細(xì)胞減少癥、淋巴細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、脾臟損傷、胸腺損傷、結(jié)腸損傷、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高和肝功能氧化應(yīng)激損傷中的一種或幾種。
11.如權(quán)利要求6、7、8中所述的糖肽的一種或幾種組合在制備制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑為益生元、功能性食品或藥物。